Trasduzione del Segnale da Recettori di Superfice

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1 Trasduzione del Segnale da Recettori di Superfice MEMBRANA 1. Legame recettore-ligando 2. oligomerizzazione 3. Attivazione TYR-K -Dominio citosolico dei RTK -Reclutamento TYR-K (src, jak, fak, abl) 4. Formazione del complesso di trasduzione -Proteine adattatrici (grb, stat, MyD88, ) -Proteine effettrici (gap, plc, dynamin, ras) 5. Attivazione SER/THR K -PKC -MAPKKK, MAPKK, MAPK NUCLEO MODIFICAZIONI METABOLICHE MODIFICAZIONI CITOSCHELETRO TRASCRIZIONE

2 1. RECETTORI recettori LIGANDO Recettore di membrana Recettore nucleare LIGANDO canali N 1TM 7TM N CYTOKINE RECEPTOR FAMILY Class I (4 cys consecutive e motivo TRP-SER-X-TRP-SER in prossimità della membrana -GH receptor subfamily (GH, EpoR, G-CSF R) omodimeri -IL-3 receptor subfamily (IL-3R, IL-5R, GM-CSF) complessi con subunità beta comune -IL-6 receptor subfamily (IL-6R, IL-11R, LIFR) complessi con subunità comune gp130 -IL-2 receptor subfamily (IL-2Ralfa e beta, IL-4R, IL-7R) complessi con IL-2Rgamma Class II (4 cys consecutive) IFNsR, IL-10R RECETTORI 1 TM IL-6 REC recettori IFN REC

3 Ig superfamily Uno molti loop dati da ponti disolfuro omologhi alle Ig (IL-6R, IL-1R, MCSFR, PDGFR) recettori TNF RECEPTOR FAMILY Formano trimeri, cys ripetute TNFR-1, CD40, Fas, Cd27, CD30 recettori

4 recettori Cross-talk: il segnale tramite un recettore può agire attraverso l attivazione di un secondo recettore Il recettore lega in modo specifico un ligando In cellule diverse e/o in momenti diversi la risposta cellulare al ligando cambia CAMBIA IL MECCANISMO DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE 1 CHECK POINT DI REGOLAZIONE Regolazione del segnale via recettore -espressione sulla S -distacco ad opera di enzimi (shedding) recettori

5 2. OLIGOMERIZZAZIONE oligomerizzazione Riguarda i 1TM R I complessi Rec-Lig non sono isolati ma si raggruppano 1. Ligando dimero/trimero (es.tnf) 2. Ligando con più siti di legame (es EGF) 3. Un ligando induce il recettore a legarne un altro 4. Il recettore è associato a CSK e Ligando/Rec oligomerizzazione del CSK (es TGFbeta) 5. Combinazione di1-4 Questa oligomerizzazione consente: Avvicinare i domini citosolici dei rec per trans-fosforilazione Crea un microambiente inaccessibile agli inibitori Superamento della soglia Equilibrio inibitori/attivatori regolazione del segnale OLIGOMERIZZAZIONE FUNZIONALE dei RECETTORI a 1TM oligomerizzazione U U U U U U

6 3. ATTIVAZIONE DELLA VIA CITOSOLICA TYR-CHINASI A. TYR-K fanno parte del dominio citosolico del Rec B. TYR-K devono essere reclutate dal citosol (famiglia delle JAK, FAK 125) 2 domini caratterizzanti - uno con cui legano il dominio citosolico dl Rec (modificato dopo l interazione col ligando) - uno per trans-fosforilazione di substrati Esistono 4 tipi di JAK che si associano in varie combinazioni ai rec dando risposte diverse Fosforilazione di TYR in proteine bersaglio che vengono reclutate a formare un complesso -Amplifica il segnale iniziale Complessità della trasduzione -Può essere modulato regolazione del segnale Alle TYR-P si legano in modo specifico i domini SH2 (Src Homology) contenuti in alcune proteine che si assemblano a formare un complesso

7 Due classi di proteine si associano ai RTKs attivati Tirosina chinasi non recettoriale Fosfo lipasi PI-3 Chinasi Protein-fosfatasi 4. FORMAZIONE DEL COMPLESSO DI TRASDUZIONE La formazione di un complesso proteico consente una più efficiente modulazione della risposta cellulare. regolazione del segnale Complessità della trasduzione Reclutamento di proteine è dato dall interazione tra le stesse proteine -Proteine adattatrici -Proteine effettrici SH2 (Src Homology 2) circa 100 AA, motivo FLVR riconosce la fosfotyr SH3 60AA riconosce sequenze ricche in prolina PH (plecstrin Homology) riconosce l inositolo fosforilato

8 I domini SH2 si legano a regioni di molecole bersaglio contenenti residui di fosfotirosina La struttura fondamentale e quella di un foglietto β antiparallelo affiancato da due α eliche. Il foglietto β comprende tre lunghi filamenti β antiparalleli βb-βd oltre a due brevi filamenti, βa e βg legati con legami idrogeno in modo parallelo a βb. Questi elementi di struttura secondaria sono collegati da loop relativamente brevi eccetto il loop tra βd e αb che comprende un piccolo foglietto β antiparallelo. Core idrofobi sono formati dall impaccamento delle due α eliche contro ognuna delle due superfici del foglietto β. Il peptide si lega a una superficie relativamente piatta creata dalle due eliche e dal margine del foglietto β. I peptidi contenenti fosfotirosina usano la sequenza ptyr-glu- Glu-Ile che rappresenta il motivo per il legame a Src. La porzione di fosfotirosina e saldamente ancorata a SH2 attraverso residui carichi positivamente: 2 Arg provenienti da αa e βb e una lisina proveniente da βd. I due residui di Glu del peptide contraggono deboli ma specifiche interazioni con catene laterali polari di SH2, ma il residuo di Ile e legato strettamente a SH2 all interno di una tasca idrofoba.

9 I domini SH3 legano regioni ricche di residui di prolina in molecole bersaglio E costituito da una struttura β a 5 filamenti antiparalleli ruotata a formare una botte comprendente due foglietti β antiparalleli impaccati l uno sull altro. Il filamento β2 appartiene a entrambi i foglietti. Questo ripiegamento e presente in tutti i tipi di SH3 mentre le regioni loop differiscono e in certi domini SH3 contengono piccole regioni di struttura secondaria. Il sito di legame per il peptide e un solco idrofobo fiancheggiato da un loop RT tra β1 e β2 e dalloop tra β3 e β4 (n-src). Il solco e orlato da residui aromatici conservati. Nel dominio SH3 di Src, sono state trovate 2 classi di motivi consenso: RXLPPLPXX (classe I), XXXPPLPXR (classe II). X=qualsiasi residuo, R=Arg, L=Leu, P=Pro. Gli elementi leganti il dominio SH3 nelle molecole bersaglio consistono di sequenze peptidiche ricche di residui di prolina. In seguito al legame, questi segmenti peptidici assumono una struttura secondaria ad elica della poliprolina di tipo II sinistrorsa con tre residui per giro. Il ligando peptidico possiede 3 creste, due delle quali entrano in contatto col dominio SH3. La polarita di legame e determinata da interazioni aggiuntiva a un estremita del solco. Nel caso del dominio di SH3 di Src, una tasca carica negativamente contribuisce a selezionare l orientamento del peptide legato ricevendo un residuo di Arg presente a una delle due estremita del segmento ricco di proline.

10 RTK TYR chinasi II ordine INTEGRINE FAK 125 JAK CKR 7TMD G-PROTEIN SRC family TYR-K II ordine (Src K) Vicine alla membrana, attivate si inseriscono nella m.pl con code miristilate Inattive per opera della chinasi Csk, attivate da fosfatasi (PTP, CD45) Formano il complesso Molti membri la cui combinazione dà effetti finali diversi Favoriscono il superamento della soglia Agiscono su substrati comuni o specifici Promuovono il ciclo cellulare agendo su Myc Hanno azioni spcifiche e comuni con JAK e RTK Si attivano e fosforilano PLC gamma Potenziano la funzione delle TYR-K I ordine Attivano le SER/THR-K Myc o attivando Ras Complessità della trasduzione regolazione del segnale Recettori senza attivita enzimatica intrinseca accoppiati alla tirosin cinasi Questi recettori sono privi di attivita catalitica intrinseca, ma il legame del ligando induce la formazione di un recettore dimerico che interagisce ed attiva una o piu tirosina cinasi citosolica.

11 TYR chinasi II ordine L attività chinasica di Src è repressa nello stato inattivo Il legame di ligandi ai domini SH2/SH3, la defosforilazione di Tyr 527 tramite PTPs o la fosforilazione di Tyr 416 attivano src Src inattiva Src attiva Le tirosine cinasi della famiglia Src contengono domini SH2 e SH3 oltre al dominio cinasico La catena polipeptidica della tirosin cinasi Src, come quelle dei membri appartenenti alla stessa famiglia di cinasi, comprende una regione N-terminale che dirige i rapporti con la membrana, seguita da un dominio SH3, da un dominio SH2, e dai 2 lobi responsabili dell attivita tirosin cinasica. Sono due i residui di Tyr che vengono fosforilati, uno nel loop di attivazione del dominio cinasico (Tyr 416 in c-src) e l altro in una breve coda C- terminale (Tyr 527 in c-src). La fosforilazione di Tyr 416 attiva la funzione cinasica mentre la fosforilazione di Tyr 527 la inibisce.

12 Stato inattivo della cinasi: e un insieme compatto dei 4 domini. SH2 e SH3 giacciono, rispettivamente, accanto al domino maggiore e minore responsabili dell attivita cinasica, al lato opposto della fessura catalitica. La coda C-terminale fosforilata si estende dalla base del dominio catalitico maggiore della cinasi nel dominio SH2, dove il residuo di fosfotirosina si lega nel relativo sito di legame. La regione linker, estesa tra il dominio SH2 e il dominio N-terminale della cinasi, interagisce con il solco del dominio SH3. In questa interazione, i residui del linker assumono struttura ad elica della poliprolina II anche quando la sequenza attorno a questa regione, -Pro-Gln-Thr-Gln-Gly-Leu-, e diversa dalla sequenza consenso di riconoscimento da parte di SH3,-P-X-X-P-X-P. I contatti tra SH2 e SH3 sono limitati. Nello stato inattivo, i 2 domini della cinasi sono distanziati. Nella forma attiva, i domini sono spostati uno verso l altro e si trovano in una conformazione chiusa. L elica αc si trova in una posizione e orientamento in cui il residuo di Glu, cataliticamente importante, e volto in direzione opposta al sito attivo. Il segmento di attivazione ha una conformazione che, attraverso contatti sterici, blocca il posizionamento cataliticamente competente dell elica αc. Il passaggio da una conformazione all altra si accompagna allo spostamento e rotazione dell α elica αc nel dominio N-terminale.

13 Forma attiva: la regione linker e rilasciata dal dominio SH3 e il segmento di attivazione cambia la propria struttura forzando l elica αc a spostarsi in modo da portare il residuo di Glu nel sito attivo, a contatto con un residuo di Lys. Nel segmento di attivazione, un residuo di Arg lega la fosfotirosina mentre un altro residuo di Arg lega il fosfato γ dell ATP e un residuo di Asp si lega all atomo di Mg nel sito attivo. Il dominio SH3 che lega le regioni linker tra SH2 e il lobo N-terminale della cinasi puo modificare la conformazione di αc. La defosforilazione del residuo Tyr 527 o il reclutamento del dominio SH2 o SH3 in seguito a forte legame con molecole bersaglio abolisce l interazione intermolecolare della regione linker e presumibilmente porta l elica αc e il segmento di attivazione a spostarsi nelle loro conformazioni attive.