Indagini molecolari nella gestione delle epatiti B e C: stato dell arte (Rassegna)

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1 Indagini molecolari nella gestione delle epatiti B e C: stato dell arte (Rassegna) Laura Mazzuti 1, Maria Antonietta Lozzi 2, Ombretta Turriziani 1 1Dipartimento di Medicina Molecolare e 2 Dipartimento di Sanità Pubblica e Malattie infettive, Sapienza Università di Roma INTRODUZIONE Negli ultimi vent anni le tecniche di biologia molecolare hanno subito una continua evoluzione che ha portato alla disponibilità di strumenti altamente sensibili e specifici che hanno rivoluzionato l approccio diagnostico delle infezioni virali. Metodi molecolari permettono oggi non solo di rilevare la presenza di un genoma virale in un determinato campione clinico, ma anche di quantificarlo, sequenziarlo ed assegnarlo ad un determinato genotipo; è possibile inoltre identificare eventuali sostituzioni aminoacidiche rilevanti da un punto di vista clinico. Attualmente tutte queste diverse applicazioni trovano un largo impiego nella diagnosi e nel monitoraggio delle infezioni virali croniche, quali quelli da epatite B e C che, come noto, possono richiedere un trattamento farmacologico e pertanto necessitano di strumenti diagnostici che permettano di monitorare in modo accurato sia lo stato di infezione che la risposta al trattamento. Nel presente articolo vengono discussi i più recenti metodi molecolari e come questi possano essere utilizzati per migliorare la gestione del paziente con epatite cronica di tipo B o C. INFEZIONE DA HBV Quantificazione della carica virale plasmatica Nel corso degli anni diversi metodi di amplificazione sono stati utilizzati per misurare la concentrazione del genoma di HBV. In particolare, i saggi quantitativi disponibili in commercio si basano su diverse tecniche di amplificazione, quali l amplificazione del segnale (branced DNA), l amplificazione genica convenzionale (Polymerase Chain Reaction - PCR) e tecniche in Real Time PCR, tutte metodiche molto specifiche e capaci di riconoscere e quantificare i diversi genotipi di HBV. Nelle tecniche classiche di amplificazione genomica, quali PCR e la Transcription Mediated Amplification (TMA), gli ampliconi vengono rilevati alla fine del processo di amplificazione mediante ibridazione con sonde specifiche immobilizzate e successiva reazione enzimatica. Dal momento che le reazioni di amplificazione vanno incontro a saturazione, questi metodi presentano uno stretto intervallo dinamico ( ) e, di conseguenza, non permettono una accurata quantificazione di livelli di viremia molto alti o molto bassi. Questo limite è stato superato dallo sviluppo della Real Time PCR, una metodica che permette di misurare l amplificato nella fase esponenziale della reazione di amplificazione, presentando un intervallo dinamico molto più ampio ( ). La tabella 1 illustra i più recenti test commerciali oggi disponibili per la quantificazione di HBV DNA, con l indicazione del tipo di sistema, i livelli di sensibilità e l intervallo dinamico. Diversi autori hanno valutato la variabilità intra- ed inter-assay di questi saggi dimostrando la validità del loro utilizzo nella diagnosi e nel monitoraggio dell infezione 1-3. Nei pazienti con infezione da HBV la carica virale plasmatica può variare da valori molto bassi a valori >10 8 IU/mL nei soggetti definiti immunotolleranti ; di conseguenza la disponibilità di saggi in Real Time PCR, che presentano elevata sensibilità e ampio intervallo dinamico, permette una accurata valutazione delle diverse fasi dell infezione. Lo stato di portatore inattivo viene ad esempio definito dalla presenza dell HBsAg per più di 6 mesi, da livelli persistentemente normali di ALT/AST e da valori di HBV DNA sierico < IU/mL; nei soggetti con epatite cronica invece i livelli di viremia sono solitamente superiori alle IU/mL 4. L elevata sensibilità di queste metodiche molecolari si è rivelata estremamente importante nella diagnosi di epatite cronica HBeAg negativa e nell epatite occulta, dove i livelli di HBV DNA sono estremamente bassi 5. In particolare nell epatite occulta è raccomandato l uso di saggi con il limite di rilevazione più basso <10 IU/mL. I test in Real time PCR hanno la particolarità di fornire anche un risultato qualitativo. Questo dato si ottiene quando i livelli di viremia non cadono all interno dell intervallo dinamico, ma sono minori del più basso limite di quantificazione (LLOQ). In particolare, in alcuni saggi il risultato minore del LLOQ viene espresso come target non detected quando i valori di HBV DNA sono prossimi allo zero, e come target detected quando è presente una viremia residua; altri metodi, oltre al LLOQ, presentano un limite di rilevabilità (LOD) che, come noto, è inferiore al LLOQ (Tab.1). La possibilità di verificare la presenza di livelli minimi di HBV DNA è importante soprattutto durante il monitoraggio della terapia. E proprio nell ambito del trattamento dell infezione che questo marcatore virologico trova la sua massima espressione. La conoscenza del valore della carica virale è fondamentale per decidere l inizio di un trattamento e per monitorare il successo dello stesso. Le maggiori linee guida per la gestione del paziente con epatite cronica B raccomandano l inizio della terapia nei pazienti HBeAg positivi e con livelli di viremia IU/mL 6-8. Lo scopo del trattamento è quello di prevenire la progressione della malattia epatica, obiettivo che può essere raggiunto con la soppressione sostenuta della replicazione virale, che viene valutata misurando ogni settimane i livelli di HBV DNA 6. Le linee guida europee raccomandano l uso di metodiche di Real Time PCR nel monitoraggio della terapia e definiscono la risposta al trattamento quando i livelli di HBV DNA vengono mantenuti al di sotto delle IU/mL 8. LigandAssay 19 (2)

2 Tabella 1. Saggi disponibili per la quantificazione dell' HBV DNA Saggio Metodo Volume di reazione (µl) LLOD (IU/mL) Intervallo lineare di quantificazione (IU/mL) COBAS TaqMan HBV Test For Use With The High Pure System, Roche Molecular Systems COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan (CAP/CTM) HBV Test,2.0, Roche Molecular Systems Real-time PCR (1, ) Real-time PCR (1, ) RealTime HBV, Abbott Molecular Real-time PCR (1, ) RealTime HBV, Abbott Molecular Real-time PCR (1, ) Artus HBV QS-RGQ Assay, Qiagen Real-time PCR ,6 - (4, ) VERSANT HBV DNA 1.0 Assay (kpcr), Siemens Real-time PCR (7, ) LLOD: Lower Limit Of Detection Come riportato sopra, grazie alla elevata sensibilità di questi saggi molecolari è oggi possibile identificare e/o quantificare livelli minimi di viremia. Ma qual è il significato di queste basse copie di HBV DNA nei pazienti in trattamento? Possono questi valori essere responsabili di una più rapida selezione di ceppi resistenti? Un lavoro pubblicato recentemente ha dimostrato che i livelli di viremia residua non dipendono dal trattamento somministrato, ma nei pazienti trattati con regimi terapeutici a bassa barriera genetica, la loro presenza può predire l insorgenza di mutazioni associate a farmacoresistenza 9 e quindi indurre ad un cambiamento del regime terapeutico. L insorgenza di farmacoresistenza rappresenta l ostacolo maggiore al successo della terapia ed ha importanti conseguenze anche sull evoluzione della malattia; pertanto è cruciale la disponibilità di strumenti diagnostici che ci permettano sia di prevenire questo fenomeno sia di caratterizzarlo una volta insorto. Determinazione del genotipo e della farmacoresistenza La prevenzione dell insorgenza della farmacoresistenza ed il suo controllo una volta comparsa, costituiscono degli elementi fondamentali per garantire un successo terapeutico duraturo nel tempo. L uso del test di resistenza è fondamentale in questo ambito, in quanto consente di valutare il profilo di resistenza, e quindi selezionare farmaci attivi sul ceppo mutato identificato. I saggi molecolari utilizzati in questo ambito si basano sulla identificazione di sostituzioni aminoacidiche nel gene che codifica per la polimerasi virale che, come noto, costituisce il bersaglio della attuale terapia. Diversi sono i metodi molecolari oggi disponibili, che permettono l identificazione di mutazioni associate a farmacoresistenza, quali metodi di sequenziamento classico, metodi basati su reazioni di amplificazione seguite da digestione con enzimi di restrizione e analisi dei frammenti [PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)], o da ibridazione con sonde specifiche immobilizzate su membrana (LiPA - LIne Probe Assay), o ancora reazioni di PCR con primers allele specifici. Allo stato attuale il saggio di genotipizzazione Trugene HBV (Siemens Diagnostics Heathcare) ed il saggio INNO- LiPA (Innogenetics) rappresentano i metodi più utilizzati per l identificazione sia di mutazioni associate a farmacoresistenza sia del genotipo virale. Sebbene il genotipo di HBV non costituisca, ad oggi, un prerequisito per la gestione dell infezione da HBV e non sia stato ancora incluso nelle linee guida al trattamento, le diverse evidenze che dimostrano come questo fattore possa influenzare l esito dell infezione ed il successo della terapia stanno sempre più contribuendo ad aumentare l interesse del clinico verso questo parametro. Pertanto è oggi auspicabile avere in laboratorio la disponibilità di saggi che permettano l identificazione anche del genotipo virale. I saggi di genotipizzazione Trugene HBV e LiPA, sebbene sensibili e adeguati ad una routine diagnostica 14, presentano entrambi dei vantaggi e degli svantaggi. Il Trugene HBV è un saggio di genotipizzazione che prevede una reazione di amplificazione del genoma virale e di sequenziamento della regione che codifica per la polimerasi virale e della porzione centrale di HBsAg. Nonostante la sua laboriosità, questo metodo permette di individuare mutazioni di resistenza primarie note, mutazioni secondarie e anche nuove varianti virali. Inoltre la regione del genoma associata allo sviluppo di farmacoresistenza rappresenta anche la regione utilizzata per la determinazione del genotipo. Il limite di questo metodo è rappresentato dal fatto che permette di identificare il genotipo maggiore ossia quello più rappresentato; pertanto alcune infezioni miste possono essere sottostimate quando si utilizza questa metodica. Al contrario, il saggio di genotipizzazione LiPA mostra una sensibilità maggiore nell identificazione delle infezioni miste 15-17, ma basandosi sull uso di sonde genotipo-specifiche, il suo utilizzo non permette la contestuale identificazione delle mutazioni associate a resistenza, per le quali è necessaria una reazione di ibridazione con probes specifici per le mutazioni note; di conseguenza questo metodo non permette di rilevare nuove varianti virali. Nonostante questi limiti, il test LiPA grazie alla sua facilità di esecuzione, rappresenta oggi il metodo di genotipizzazione più utilizzato nella routine di laboratorio. Inoltre questo saggio può riscontrare la 126 LigandAssay 19 (2) 2014

3 presenza di varianti virali resistenti quando la popolazione mutante costituisce più del 5% di quella totale. Il sequenziamento diretto invece è meno sensibile, poiché non permette l individuazione di mutanti presenti in quantità inferiori al 20%. Le varianti resistenti minoritarie, ossia quelle presenti nella popolazione con una frequenza molto bassa (<5%), possono essere identificate utilizzando metodi di sequenziamento altamente sensibili, quali l Ultra Deep PyroSequencing (UDPS) 18 o tecniche basate su analisi spettrometrica di piccoli frammenti di DNA contenenti siti di variazione come il MALDI TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Light Mass Spectrometry) 19. Questi metodi sono in grado di rilevare la presenza di mutanti che rappresentano appena lo 0,1% della popolazione virale. Recentemente utilizzando la tecnologia UDPS ed in particolare il Genome Sequencer FLX/454 Life Science platform alcuni autori hanno rilevato la presenza di mutanti resistenti in soggetti mai sottoposti a trattamento antivirale 20. Sebbene queste tecnologie permettano di acquisire delle informazioni interessanti è importante sottolineare che sono necessari studi prospettici per definire la rilevanza clinica della presenza di queste varianti virali minoritarie. Inoltre, trattandosi di metodi molto laboriosi, soprattutto dal punto di vista della elaborazione dei risultati, e costosi,il loro utilizzo nella routine di laboratorio è ancora molto lontano. INFEZIONE DA HCV Quantificazione della carica virale plasmatica I saggi molecolari per la rilevazione del genoma di HCV vengono utilizzati per diversi scopi nella pratica clinica. Per prima cosa, la presenza di HCV-RNA in circolo riflette una replicazione virale, motivo per cui test molecolari sensibili vengono utilizzati per diagnosticare un infezione attiva da HCV e per individuare i pazienti che invece hanno risolto l infezione. Test molecolari sono poi richiesti per una diagnosi precoce di infezione acuta da HCV (entro le prime tre settimane dall esposizione), quando non è ancora possibile rilevare gli anticorpi specifici. I test molecolari servono inoltre per confermare la diagnosi di infezione cronica da HCV, dopo l individuazione degli anticorpi anti- HCV. Infine, vengono utilizzati per monitorare l efficacia della terapia antivirale: i livelli plasmatici di HCV-RNA infatti devono essere periodicamente monitorati, al fine di minimizzare gli effetti collaterali, i costi e la comparsa di farmacoresistenza 21. Come precedentemente riportato per HBV, anche per la rilevazione e la quantificazione della carica virale di HCV, nel siero o nel plasma, sono disponibili diverse metodiche NATs (Nucleic Acid Testing), che sfruttano tecniche di PCR, Real Time PCR, TMA, o branced DNA. Tutti i NATs mostrano un elevata specificità (intorno al 99%) per i sei genotipi di HCV, avendo come bersaglio la regione altamente conservata 5 UTR I saggi molecolari commerciali attualmente approvati per la diagnosi in vitro sono elencati nella tabella 2, anche se, con l introduzione di saggi quantitativi ultrasensibili, in grado di rilevare fino a 10 IU/mL di HCV-RNA, l utilizzo dei test qualitativi è ormai destinato a scomparire. Il metodo di riferimento per la quantificazione della carica virale utilizzato nella pratica clinica, in accordo con le linee guida europee ed americane, è la Real Time PCR poiché, come riportato precedentemente, presenta una elevata sensibilità ed un ampio intervallo dinamico di quantificazione e, sviluppandosi in un sistema chiuso, riduce il rischio di contaminazione. Come per l HBV, anche i test per la determinazione della carica virale di HCV presentano un LLOQ ed un LLOD, che possono coincidere o meno a seconda dei saggi. Di conseguenza, la metodica può riportare tre diversi livelli di viremia di HCV: 1) HCV-RNA non rilevato (non detected), 2) HCV-RNA rilevato ma sotto il limite di quantificazione (<LLOQ), 3) HCV rilevato e quantificato (>LLOQ) 24. Anche per l epatite C, riveste quindi un importante significato clinico la possibilità di rilevare HCV-RNA circolante ma non quantificabile, che riflette la presenza di una viremia residua, dal momento che la terapia antivirale punta al raggiungimento della SVR (Risposta Virologica Sostenuta), caratterizzata da HCV-RNA non rilevabile (<10-15 IU/mL) 24 settimane dopo la fine del trattamento 25, che corrisponde all eradicazione virale nel 99% dei casi. Tabella 2. Saggi disponibili per la quantificazione dell' HCV-RNA Saggio Metodo Volume di reazione (µl) LLOD (IU/mL) Intervallo lineare di quantificazione (IU/mL) Abbott RealTime HCV, Abbott Molecular Real-time PCR ( ) artus HCV RG RT-PCR Kit, Qiagen Real-time PCR ( ) artus HCV QS-RGQ Kit, Qiagen Real-time PCR (1, ) COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan HCV Test, Roche Molecular Systems COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan HCV Quantitative Test v2.0, Roche Molecular Systems Real-time PCR (6, ) Real-time PCR ( ) VERSANT Siemens HCV RNA 1.0 Assay (kpcr), Real-time PCR ( ) LLOD: Lower Limit Of Detection LigandAssay 19 (2)

4 Una accurata valutazione della carica virale di HCV è diventata particolarmente importante con l avvento dei nuovi regimi di trattamento, che aggiungono all utilizzo del PegIFN-α e della ribavirina anche un inibitore della proteasi virale (boceprevir e telaprevir) per il trattamento di pazienti infetti dal genotipo 1 di HCV 26. Determinazione del genotipo e della farmacoresistenza L identificazione del genotipo virale rappresenta il principale fattore in grado di influenzare la durata e il successo terapeutico e può essere predittivo per la progressione dell infezione a carico del fegato. Come riportato per HBV, sono disponibili diversi saggi per la determinazione del genotipo di HCV; alcuni di questi si basano su un analisi diretta della sequenza del 5 NC, altri fanno ricorso ad un analisi di ibridazione inversa utilizzando probes specifici per la regione 5 NC, altri ancora sfruttano tecniche di Real Time PCR per l amplificazione delle regioni 5 UTR e NS5B 27. Dal momento che il maggior limite di questi saggi è la difficoltà nel rilevare la presenza di più genotipi virali nello stesso campione, attualmente sono in corso studi per la genotipizzazione di HCV basata su PCR multiplex 28. Il genotipo virale, come consigliato dalle linee guida, deve essere determinato prima dell inizio del trattamento farmacologico, poiché è determinante per le decisioni terapeutiche e per il dosaggio della ribavirina; questo perchè i genotipi 1 e 4 sono più resistenti al trattamento con pegifn-α e ribavirina rispetto ai genotipi 2, 3 e 6. Nonostante la recente introduzione nella pratica clinica degli inibitori della proteasi virale di HCV (DAAs), i test di farmacoresistenza attualmente non vengono raccomandati nella pratica clinica, perché i risultati sembrerebbero non avere impatto sulle decisioni in merito al trattamento, in quanto varianti virali sono presenti in quasi tutti i pazienti prima dell inizio della terapia e le tecniche molecolari disponibili nei laboratori di diagnosi, come quelle basate sul metodo di Sanger, non sono abbastanza sensibili da metterle in evidenza Inoltre, alcuni studi hanno osservato che la presenza di tali varianti minoritarie all inizio della terapia non sembrerebbe inficiare il successo terapeutico quando l inibitore della proteasi è combinato con il pegifn-α e la ribavirina 31. I test di resistenza sono tuttavia largamente utilizzati nei protocolli clinici per lo studio dei DAAs, e a scopo di ricerca, nei pazienti in fallimento, per caratterizzare la natura e la dinamica della popolazione virale selezionata e per identificare sostituzioni aminoacidiche selezionate dai DAAs. Per effettuare tali analisi vengono attualmente utilizzati metodi di sequenziamento molto sensibili, come il NGS (Next Generation Sequencing). CONCLUSIONI Attualmente diverse tecniche di biologia molecolare vengono utilizzate di routine nei laboratori diagnostici per individuare e monitorare le infezioni croniche da HBV e HCV. In particolare si fa riferimento a tecniche di Real Time PCR e TMA, tecniche molto sensibili, che limitano il rischio di contaminazione ma che richiedono personale specializzato e laboratori dedicati. Sarebbe auspicabile nel futuro prossimo migliorare i limiti di sensibilità di tali metodiche sia per la quantificazione dell HBV-DNA che dell HCV-RNA. È infatti clinicamente rilevante individuare livelli di HBV DNA >10 8 IU/mL per i pazienti immunotolleranti, ma anche riuscire ad abbassare ulteriormente il valore LLOQ per l identificazione delle epatiti occulte. Per quanto riguarda invece l epatite C, è necessario investigare ulteriormente il significato clinico del valore LLOD, poiché non ancora indicativo per decisioni terapeutiche. Negli ultimi anni poi, si stanno studiando nuove promettenti tecnologie per la rilevazione del genoma e del core virale, che utilizzano nanoparticelle d oro 32 o piccole molecole di cattura come gli aptameri ; è inoltre in corso di studio, per l utilizzo nella diagnosi delle infezioni da HCV, il nuovo metodo di amplificazione LAMP (Loop- Mediated Isothermal Amplification), più semplice, rapido e specifico della Real Time PCR 35. Per quanto riguarda invece il sequenziamento del genoma virale, per l identificazione del genotipo e sottotipo e per l individuazione di mutazioni associate a farmacoresistenza, si fa ricorso nella diagnostica a tecniche non ancora molto sensibili, come quelle basate sul metodo di Sanger, meno costose e complesse del NGS, il cui utilizzo rimane ristretto a scopi di ricerca. L introduzione del NGS nella pratica diagnostica offrirebbe sicuramente nuove opportunità ma, oltre a personale e laboratori specializzati, richiederebbe anche l introduzione di nuove figure professionali, quali i bioinformatici, e complicherebbe l interpretazione tecnica e clinica. BIBLIOGRAFIA 1. Ciotti M, Marcuccilli F, Guenci T, et al. Evaluation of the Abbott RealTime HBV DNA assay and comparison to the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan 48 assay in monitoring patients with chronic cases of hepatitis B. J Clin Microbiol. 2008;46: Caliendo AM, Valsamakis A, Bremer JW et al. 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