Ruolo delle integrine b 2 LAVORI ORIGINALI/ORIGINAL ARTICLES. A. Midiri 1, A. Bellantoni 1, T. Ceraudo 1, A. Butera 1, M.G. Cianci 1, F.

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1 Ruolo delle integrine b 2 per batteri gram positivi nell induzione di TNF-a da parte di macrofagi murini Role of beta 2 integrins in murine macrophage TNF alpha induction by gram positive bacteria GIMMOC Vol. IV N o 3, 2000 Giornale Italiano di Microbiologia Medica Odontoiatrica e Clinica Vol. IV, N o 3, 2000 p Organo ufficiale della S.I.M.M.O.C. Copyright Riassunto. Al fine di identificare i recettori coinvolti nella risposta citochinica a batteri interi, cellule Raw 264.7, appartenenti ad una linea macrofagica murina, sono state pretrattate con anticorpi monoclonali diretti verso diversi recettori e stimolate con batteri interi uccisi al calore. Successivamente i surnatanti sono stati raccolti e saggiati per la presenza di TNF-a. La presenza di siero ed il trattamento con anticorpi anti- CD14 determinavano, rispettivamente, un aumento ed una diminuzione della produzione di TNF-a in seguito a stimolazione con E. coli. Al contrario, la risposta citochinica nei confronti di tutti i batteri grampositivi saggiati (streptococchi di gruppo A e B, L. monocytogenes e S. aureus) non veniva influenzata dalla presenza di siero o di anticorpi anti-cd14. Il pretrattamento con anticorpi monoclonali diretti versi il recettore di tipo III del complemento (anti-cd18/cd11b) bloccava il rilascio di TNF-a indotto dalla stimolazione con streptococchi uccisi al calore. La produzione di TNF-a indotta da L. monocytogenes o S. aureus diminuiva in seguito a pretrattamento con anticorpi monoclonali anti-cd11c, una delle due subunità del CR4 (CD18/CD11c). I nostri dati indicano differenze nel tipo di recettore utilizzato dai macrofagi nelle risposte citochiniche a batteri gram-negativi rispetto ai batteri gram-positivi. Inoltre, per questo ultimo tipo di batteri, le b 2 integrine sembravano giocare un ruolo fondamentale. Summary. Little is known of macrophage receptors involved in cytokine responses to whole bacteria. To identify these receptors, a murine macrophage line (RAW 264.7) was pretreated with different monoclonal antibodies and TNF-a was measured in culture supernatants after stimulation with whole heat-killed bacteria. Foetal calf serum and anti-cd14 antibodies significantly increased and decreased, respectively, TNF-a responses to the gram-negative Escherichia coli. Neither treatment, however, influenced responses to any of the gram-positive bacteria tested, including group A and B streptococci, Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus. Complement receptor type III (CR3 or CD18/CD11b) antibodies prevented TNF-a release induced by heat-killed group A or B streptococci. In contrast, the same antibodies had no effects when monocytes were stimulated with L. monocytogenes or S. aureus. Using either of the latter bacteria, significant inhibition of TNF-a release was produced by antibodies to CD11c, one of the subunits of CR4. Collectivey, our data indicate that different macrophage receptors appear to mediate cytokine responses to whole gram-negative and gram-positive bacteria. Using the latter as stimuli, b 2 integrins may have a prominent role in cytokine response. INTRODUZIONE Negli ultimi anni è stato osservato un notevole aumento dell incidenza delle sepsi causate dai batteri gram-positivi. Come conseguenza, in molti centri clinici, lo shock settico da gram-positivi è diventato ugualmente o più frequente rispetto a quello causato dai batteri gram-negativi (Bone, 1994). Molte delle manifestazioni dello shock settico sono state messe in relazione all eccessivo rilascio di citochine proinfiammatorie in seguito all interazione tra cellule dell ospite e prodotti microbici (Verhoef and Mattsson, 1995). Una migliore conoscenza dei meccanismi di attivazione cellulare che sono alla base della patogenesi della sepsi potrebbe essere utile per l allestimento di terapie alternative. A tutt oggi sono stati condotti numerosi studi sui meccanismi di attivazione cellulare indotti dal lipopolisaccaride, il principale componente dei batteri gram-negativi. L attivazione dei fagociti mononucleati, indotta dal LPS, comporta il legame al recettore cellulare CD14, una glicosil-fosfatidilinositol-proteina mancante della porzione intracitoplasmatica (Ulevitch and Tobias, 1 Istituto di Microbiologia, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di Messina. A. Midiri 1, A. Bellantoni 1, T. Ceraudo 1, A. Butera 1, M.G. Cianci 1, F. Genovese 1 * *Autore di riferimento: F. Genovese

2 164 GIMMOC Vol. IV N o 3, 2000 Midiri et al. 1995). L affinità del legame del LPS con il CD14 viene fortemente aumentata in presenza di una proteina serica definita LPSbinding protein (LBP) il che può spiegare l effetto potenziante del siero (Wright et al., 1990). Recentemente é stato visto che i segnali di attivazione cellulare indotti dal LPS potrebbero essere trasdotti non solo dal CD14 ma anche dal recettore del complemento di tipo III (CR3), una b 2 integrina costituita dall associazione di due subunità (CD11b/CD18) legate non covalentemente e che si trova su monociti, neutrofili e cellule NK (Zarewych et al., 1996). Infatti il CR3 può legarsi alla LPB ed, in presenza di siero ed LPS, associarsi con il CD14 sulla membrana cellulare. Anche il CR4, un altra b 2 integrina (CD11c/CD18), può essere coinvolta in assenza di siero nella trasduzione del segnale originatosi in seguito all interazione con LPS (Ingalls and Golenbock, 1995). L identità dei recettori cellulari che sono in grado di trasdurre i segnali indotti dall interazione con i batteri gram-positivi é stata studiata solo recentemente. Infatti é stato visto che il peptidoglicano, un componente della parete sia dei batteri grampositivi che di quelli gram-negativi, e l acido lipoteicoico, presente solamente nella membrana dei gram-positivi, sono capaci di esercitare la loro azione attraverso il recettore CD14 (Cleveland et al., 1996; Gupta et al., 1996). Tuttavia relativamente poco si conosce sui meccanismi coinvolti negli effetti prodotti dai batteri interi. Il presente studio è stato condotto allo scopo di identificare i recettori macrofagici coinvolti nella risposta citochinica ai batteri interi, focalizzando in particolare la nostra attenzione su differenti tipi di batteri gram-positivi. A tal fine sono stati determinati gli effetti esercitati dal pretrattamento con anticorpi monoclonali anti-cd14, anti-cr3 ed anti-cr4 sulla produzione di tumor necrosis factor alfa (TNF-a) da parte di cellule appartenenti ad una linea macrofagica murina (RAW 264.7). I nostri dati indicano che le b 2 integrine possono svolgere un ruolo importante in questo tipo di risposte. Viceversa il recettore CD14 media le risposte ai batteri gram-negativi ma non a quelli gram-positivi. MATERIALI E METODI Batteri uccisi al calore. COH-1, un ceppo capsulato di streptococco di gruppo B (SGB) di tipo III, è stato gentilmente fornito dal dott. Craig Rubens (Università di Washington, Seattle). Streptococco di gruppo A (SGA), Stafilococcus aureus, Listeria monocytogenes ed Escherichia coli provenivano da isolati clinici recenti. Tutti questi batteri sono stati ottenuti mediante centrifugazione di colture cresciute in fase logaritmica in brodo Todd-Hewitt. I batteri sono stati uccisi tramite trattamento al calore (60 C per 45 min.), seguito da ripetuti lavaggi con acqua distillata sterile e liofilizzazione. Reagenti. I seguenti anticorpi monoclonali (Mabs) sono stati purificati mediante cromatografia per affinità (Gamma G bind Sepharose, Pharmacia Biotech, Milano, Italia), come precedentemente descritto (Mancuso et al., 1997), dai surnatanti di coltura dei seguenti ibridomi cellulari: (anti-cd18); (anti-cd11b); (anti- CD11c). Tutti questi ibridomi sono stati acquistati dalla American Tissue Culture Cells (ATCC; Rockville, MA). Gli anticorpi anti-cd14 sono stati acquistati dalla Pharmigen (San Diego, California). Le IgG 1 e le IgG 2 di ratto utilizzate come controllo ed il LPS di S. enteritidis furono ottenute dalla Sigma Chimica (Milano, Italia). Le IgG di hamster di controllo sono state purificate da campioni di siero normale mediante cromatografia per affinità. Colture cellulari. La linea cellulare di macrofagi murini RAW veniva coltivata in RPMI 1640 (Life Technologies, Milano) contenente il 10% di siero fetale bovino scomplementato (FCS; Celbio, Milano) ed incubate a 37 C in 5% di CO 2. Per gli esperimenti di stimolazione le cellule venivano piastrate in un volume di 5 ml alla concentrazione di 1 X 10 6 /pozzetto in piastre da 6 e lasciate ad incubare per una notte. Il giorno successivo le cellule non aderenti venivano aspirate mentre quelle rimaste adese al fondo del pozzetto venivano lavate due volte con il terreno di coltura ed incubate per 1 h con i vari anticor-

3 GIMMOC Vol. IV N o 3, pi monoclonali o le IgG di controllo, alle concentrazioni indicate, prima dell aggiunta degli stimoli. Dopo 6 h d incubazione, i surnatanti venivano raccolti e conservati a -70 C fino a quando non venivano saggiati per la presenza di TNF-a. Alla fine degli esperimenti la vitalità cellulare, come determinato dal test di esclusione del trypan-blue, era >90%. In alcuni esperimenti al fine di studiare gli effetti dei componenti sierici, le cellule venivano coltivate con gli stimoli in presenza di FCS inattivato al calore. Dosaggio del TNF-a. Questa citochina è stata saggiata mediante un test di citotossicità. Per misurare la bioattività è stata utilizzata una linea cellulare di fibroblasti murini denominata WEHI 164 clone 13, sensibile al TNF-a. Per l esecuzione del test le cellule venivano distribuite in micropiastre a 96 pozzetti alla concentrazione di 5x10 4 /pozzetto. Per ciascun campione erano testate otto diluizioni seriali (da 1:5 a 1:640) in duplicato. Il test era calibrato con uno standard costituito da TNF-a murino ricombinante (attività specifica 20 U/ml, Genzyme, Cinisello Balsamo, Italia), e veniva esattamente eseguito come descritto (Teti et al., 1993). In alcuni campioni di plasma, la attività del TNF-a era totalmente inibita da una diluizione 1:1000 di siero anti-tnf-a murino (Genzyme) ma non da siero normale di coniglio. Esposizione dei dati ed analisi statistica. I livelli di TNF-a sono stati espressi come medie ± le deviazioni standards di tre osservazioni indipendenti, ciascuna condotta su campioni in duplicato. Le differenze nei livelli di citochine sono state valutate tramite un metodo di analisi della varianza e test di Student- Newmann-Keuls. Le differenze sono state considerate significative quando i valori di P erano <0.05. RISULTATI Produzione di TNF-a da parte di macrofagi murini stimolati con batteri interi. Le cellule RAW sono state largamente impiegate per analizzare la produzione di mediatori infiammatori in seguito a stimolazione con LPS. Poco o nulla si conosce sull azione esercitata dai batteri interi, soprattutto da quelli grampositivi, in seguito all interazione con questo tipo di cellule. Per questo motivo le cellule macrofagiche sono state stimolate con varie concentrazioni di batteri interi ed i surnatanti raccolti dopo 6 h d incubazione. Come si può vedere nella Tabella I le cellule producevano quantità significative di TNF-a in maniera dosedipendente in risposta a tutti i tipi di batteri interi utilizzati in questo studio. Stimolazione con E. coli e LPS. Per determinare se il CD14, il CR3 (CD18/CD11b) o il CR4 (CD18/CD11c) sono coinvolti nella produzione di TNF-a da parte dei batteri interi, i macrofagi murini sono stati pretrattati con gli anticorpi monoclonali (100 µg/ml) anti-cd14, anti-cd18, anti- CD11b o anti-cd11c prima dell aggiunta dei batteri uccisi al calore. La Tabella II mostra che il siero aumentava il rilascio di TNF-a indotta da E. coli (p<0.05). Inoltre, la produzione di TNF-a in risposta ad E. coli era significativamente inibita dall anticorpo anti-cd14 sia in assenza che in presenza di siero. Il pretrattamento con anti-cd18 o anti-cd11b determinava una moderata, ma significativa (p<0.05) inibizione della produzione di Tabella I Rilascio di TNF-a da parte di cellule RAW in seguito a stimolazione con LPS e batteri interi. Concentrazione LPS E. coli SGB SGA S. aureus Listeria (µg/ml) 1 14,3 ± 4,1 16 ± 4,3 18,3 ± 6,2 16,9 ± 5,6 15,3 ± 5,2 13,3 ± 5, ± 14 53,3 ± ± ± ± 15 54,3 ± ± ± ± ± 36,5 142 ± 36,5 150 ± 35 Ruolo delle integrine b 2 per batteri gram positivi nell induzione di TNF-a da parte di macrofagi murini Role of beta 2 integrins in murine macrophage TNF alpha induction by gram positive bacteria

4 166 GIMMOC Vol. IV N o 3, 2000 Midiri et al. Tabella II Effetto del siero e di anticorpi monoclonali sulla produzione di TNF-a in cellule RAW stimolate con E.coli e LPS. Stimolo a Siero (+/-) b pretrattamento c TNF-alfa (U/ml) E.coli + IgG di controllo 263 ± 57 + anti-cd14 59 ± 15 d + anti-cd ± 28 d + anti-cd11b 132 ± 22 d + anti-cd11c 227 ± 51 E.coli IgG di controllo 128 ± 29 anti-cd14 50 ± 11 d anti-cd18 93 ± 23 anti-cd11b 89 ± 22 anti-cd11c 61 ± 12 d LPS + IgG di controllo 257 ± 52 + anti-cd14 45 ± 16 d + anti-cd18 90 ± 23 d + anti-cd11b 98 ± 23 d + anti-cd11c 194 ± 44 LPS IgG di controllo 114 ± 24 anti-cd14 38 ± 14 d anti-cd18 97 ± 22 anti-cd11b 95 ± 18 anti-cd11c 90 ± 17 a E.coli e LPS sono stati utilizzati alla concentrazione, rispettivamente, di 50 e 10 µg/ml. b Le cellule sono state trattate in presenza del 10% di FCS. c I diversi anticorpi monoclonali e le IgG di controllo sono stati utilizzati alla concentrazione di 100 µg/ml. d Significativamente (p<0.05) differente rispetto ai controlli in seguito ad analisi della varianza e test di Student- Newmann-Keuls. Tabella III Effetto del siero e di anticorpi monoclonali sulla produzione di TNF-a in cellule RAW stimolate con SGB e SGA Stimolo a Siero (+/-) b pretrattamento c TNF-alfa (U/ml) SGB + IgG di controllo 178 ± 34 + anti-cd ± 40 + anti-cd18 44 ± 15 d + anti-cd11b 58 ± 11 d + anti-cd11c 162 ± 40 SGB IgG di controllo 158 ± 39 anti-cd14 14 ± 26 d anti-cd18 30 ± 14 d anti-cd11b 54 ± 22 d anti-cd11c 132 ± 28 SGA + IgG di controllo 164 ± 26 + anti-cd ± 23 + anti-cd18 41 ± 15 d + anti-cd11b 54 ± 16 d + anti-cd11c 148 ± 23 SGA IgG di controllo 140 ± 26 anti-cd ± 26 anti-cd18 35 ± 11 d anti-cd11b 49 ± 12 d anti-cd11c 134 ± 28 a I batteri sono utilizzati alla concentrazione di 50 µg/ml. b Le cellule sono state trattate in presenza del 10% di FCS. c I diversi anticorpi monoclonali e le IgG di controllo sono stati utilizzati alla concentrazione di 100 µg/ml. d Significativamente (p<0.05) differente rispetto ai controlli in seguito ad analisi della varianza e test di Student- Newmann-Keuls.

5 GIMMOC Vol. IV N o 3, Tabella IV Effetto del siero e di anticorpi monoclonali sulla produzione di TNF-a in cellule RAW stimolate con S.aureus e Listeria. Stimolo a Siero (+/-) b pretrattamento c TNF-alfa (U/ml) S.aureus + IgG di controllo 169 ± 36 TNF-a solamente in presenza di siero. Viceversa l anticorpo anti-cd11c diminuiva la risposta citochina ad E. coli solo in assenza di siero. I risultati ottenuti quando veniva utilizzato LPS come stimolo confermavano in linea di massima quelli avuti con il batterio intero eccetto che per quanto riguarda il pretrattamento delle cellule con l anti- CD11c che non aveva alcun effetto sull attivazione da parte di LPS sia in presenza che in assenza di siero (Tabella II). + anti-cd ± 16 + anti-cd ± 22 + anti-cd11b 137 ± 24 + anti-cd11c 68 ± 13 d S.aureus IgG di controllo 152 ± 25 anti-cd ± 29 anti-cd ± 26 anti-cd11b 137 ± 34 anti-cd11c 61 ± 13 d Listeria + IgG di controllo 147 ± 21 + anti-cd ± 25 + anti-cd ± 28 + anti-cd11b 122 ± 24 + anti-cd11c 60 ± 15 d Listeria IgG di controllo 135 ± 25 anti-cd ± 24 anti-cd ± 23 anti-cd11b 120 ± 20 anti-cd11c 53 ± 12 d a I batteri sono utilizzati alla concentrazione di 50 µg/ml. b Le cellule sono state trattate in presenza del 10% di FCS. c I diversi anticorpi monoclonali e le IgG di controllo sono stati utilizzati alla concentrazione di 100 µg/ml. d Significativamente (p<0.05) differente rispetto ai controlli in seguito ad analisi della varianza e test di Student- Newmann-Keuls. Stimolazione con batteri gram-positivi. Sia in assenza che in presenza di siero (Tabella III), l anti-cd18 inibiva quasi completamente la produzione di TNF-a da parte di SGA e SGB (p<0.05). Sebbene meno efficace rispetto all anti-cd18, anche l anti-cd11b era significativamente inibitorio nei confronti di entrambe le specie di streptococci. Al contrario né il siero né l anticorpo anti-cd14 mostravano alcun effetto sul rilascio di TNF-a indotto da questi batteri (Tabella III). Gli effetti di questi anticorpi anti-cr3 erano altamente specifici poiché essi non influenzavano il rilascio di TNF-a da parte di S. aureus e L. monocytogenes (Tabella IV). Il rilascio di questa citochina in seguito a stimolazione con quest ultimi batteri gram-positivi veniva inibito in maniera moderata ma significativa (p<0.05) dall anticorpo anti-cd11c. Come mostrato nella tabella IV anche in questo caso né il siero né l anti-cd14 avevano effetto sulla produzione di TNF-a indotta da S.aureus e L. monocytogenes. DISCUSSIONE Sebbene le manifestazioni cliniche e fisiopatologiche dello shock settico siano simili indipendentemente dall eziologia, fino ad oggi sono stati condotti pochi studi sui recettori cellulari e sui meccanismi di trasduzione del segnale attivati dai batteri gram-positivi rispetto ai numerosi studi condotti con LPS. I dati presentati in questo lavoro mettono in evidenza l esi- Ruolo delle integrine b 2 per batteri gram positivi nell induzione di TNF-a da parte di macrofagi murini Role of beta 2 integrins in murine macrophage TNF alpha induction by gram positive bacteria

6 168 GIMMOC Vol. IV N o 3, 2000 Midiri et al. stenza di differenze a livello recettoriale nelle risposte alle varie specie batteriche saggiate. Infatti il recettore CD14 appare svolgere un ruolo importante nella induzione di TNF-a da parte di E. coli e LPS mentre le b 2 integrine sembrano coinvolte nella risposta citochinica nei confronti dei batteri gram-positivi. Il fatto che i batteri gram-positivi non svolgono la loro azione induttiva attraverso il recettore CD14 é evidenziato nei nostri esperimenti per prima cosa dalla mancata inibizione della produzione di TNF-a ottenuta quando i macrofagi venivano pretrattati con anti-cd14 e stimolati successivamente con le varie specie di batteri grampositivi. Lo stesso pretrattamento, invece, bloccava quasi completamente la risposta citochinica causata da E. coli. Inoltre il siero era capace di incrementare il rilascio di TNF-a da parte di E. coli ma non dai batteri gram-positivi. I nostri dati concordano con quelli ottenuti in precedenza (Cauwels et al., 1997) dove é stato visto che il recettore CD14 non é coinvolto nelle risposte verso pneumococchi interi. Il mancato coinvolgimento del CD14 è sorprendente poiché é stato dimostrato che componenti di batteri gram-positivi ubiquitari e quantitativamente importanti come peptidoglicano, pareti cellulari e LTA possono legarsi al CD14 ed iniziare fenomeni di attivazione cellulare attraverso una via CD14-dipendente (Cleveland et al., 1996; Gupta et al., 1996; Medvedev et al., 1998). Queste osservazioni possono trovare una giustificazione nel fatto che questi componenti potrebbero non essere espressi sulla superficie batterica in una posizione o in quantità sufficienti ad attivare le cellule dell ospite. Alternativamente la differente grandezza fra antigeni solubili e particolati potrebbe causare la selezione di recettori diversi. Nel presente studio gli anticorpi anti- CD18 ed anti-cd11b erano altamente efficaci nell inibire la produzione di TNF-a in seguito alla stimolazione delle cellule macrofagiche con SGA e SGB, ma lo stesso effetto inibitorio non veniva registrato con altri batteri gram-positivi. Viceversa gli anticorpi anti-cr4 diminuivano il rilascio di TNF-a da parte di stafiloccochi e listeria ma non degli streptococchi. I nostri dati sugli SGB sono in linea con studi precedenti che mostrano che il recettore CR3 può mediare la produzione di ossido nitrico da parte di macrofagi murini stimolati con SGB (Goodrum et al., 1994). Allo stato attuale, il coivolgimento del CR3 nell induzione di citochine da parte di SGA non è mai stato osservato prima di noi. I nostri dati quindi possono essere utili in relazione alla capacità degli SGA di indurre nel corso di infezioni invasive un rilascio massivo di citochine con conseguente shock fulminante. Potrebbe essere interessante determinare se il legame degli SGB al CR3 possa essere bloccato senza influenzare la capacità di questo recettore di mediare le interazioni cellula-cellula coinvolte nelle difese dell ospite quale la diapedesi dei neutrofili (Wright et al., 1989). Ciò potrebbe essere possibile se gli SGB ed i ligandi naturali del CR3 sulla cellula dell ospite si complessano a siti differenti sulla molecola del CD18. In conclusione, i nostri dati indicano che recettori diversi, sono coinvolti nell induzione del TNF-a da parte di differenti tipi di batteri. Questi dati potrebbero essere utili per individuare strategie terapeutiche alternative allo scopo di prevenire la produzione di mediatori proinfiammatori. Ulteriori studi sono, tuttavia, necessari per accertare la rilevanza clinica di queste ricerche. BIBLIOGRAFIA Bone R.C. Gram positive organisms and sepsis. Arch. Intern. Med. 154: 26-31, Cauwels A., E. Wan, M. Leismann and E. Tuomanen. Coexistence of CD14-dependent and independent pathways for stimulation of human monocytes by gram-positive bacteria. Infect. Immun. 65: , Cleveland M.G., J.D. Gorham, T.L. Murphy, E. Tuomanen and K.M. Murphy. Lipoteichoic acid preparation of gram-positive bacteria induce interleukin-12 throught a CD14-dependent pathway. Infect. Immun. 64: , Goodrum K.J., L.L. McCornick and B. Schneider. Group B streptococcus-induced nitric oxide production in murine macrophages is CR3 (CD11b/CD18)-dependent. Infect. Immun. 62: , Gupta D., T.N. Kirkland, S. Viriyakosol and R. Dziarski. CD14 is a cell-activating receptor for bacterial peptidoglycan. J. Biol. Chem. 271: , 1996.

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