Introduzione ai gradienti. Francesca Benevelli Bruker Italia Viale Lancetti 43 MILANO

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1 Introduzione ai gradienti Francesca Benevelli Bruker Italia Viale Lancetti 43 MILANO

2 PROGRAMMA COSA E UN GRADIENTE SPETTROSCOPIA NMR CON GRADIENTI GRADIENTI DI SPOILING ESPERIMENTI CON SELEZIONE DI COERENZA MEDIANTE GRADIENTI: COSY COSYDF HMQC HSQC HMBC SOPPRESSIONE SEGNALE SOLVENTE MEDIANTE GRADIENTI 2

3 Cos è un gradiente? Il gradiente di campo magnetico statico (B 0 ) è un campo magnetico, la cui intensità dipende dalla posizione. Questo campo si somma al campo magnetico statico. G(r) = δb(r)/δr 3

4 Cos è un gradiente? Negli spettrometri NMR tipicamente si ha un gradiente lungo la sola direzione z. Applicando il gradiente, spin posti a diverse coordinate z risentono di campi magnetici diversi: B(z) = B 0 + z G z Cioè precedono a frequenze di Larmor diverse: ω(z) = γ B(z) = γ [B 0 + z G z ]. 4

5 Cos è un gradiente? L applicazione del gradiente rende la velocità di precessione dipendente dalla posizione del nucleo. In altri termini, si introduce una marcatura spaziale. 5

6 Impulso di gradiente In spettroscopia NMR quando si parla di un gradiente tipicamente si fa riferimento a un impulso di gradiente (PFG=Pulse Field Gradient). Vediamo quali grandezze dobbiamo definire quando si applicano i gradienti in spettroscopia (GRASP= GRAdient SPectroscopy) NMR. Schematicamente: S G k τ d

7 Impulso di gradiente S G k τ d Intensità (Gk). Durata (τ), ordine di grandezza ms. Delay di stabilizzazione (d), ordine di grandezza µs. Forma (S).

8 Cos è un gradiente? A questo punto possiamo capire cosa succede non solo alla velocità di precessione, ma anche alla fase della magnetizzazione. φ(z) = ω(z) τ = γ B(z) τ = γ [B 0 + z G z ] τ = γ B 0 τ + γ z G z τ φ G (z) = γ z G z τ Dopo un gradiente di durata τ e intensità G z anche la fase della magnetizzazione degli spin dipende dalla loro posizione z. 8

9 GRADIENT ECHO Cosa succede applicando due gradienti uguali e contrari? Il gradiente provoca la perdita di fase della magnetizzazione, che può essere rifocalizzata da un secondo gradiente. G2 SI PUO DIMOSTRARE APPLICANDO LA FORMULA PRECEDENTE: φ G (z) = γ z G z τ G1 φ G1 (z) = γ z G1 z τ φ G2 (z) = γ z G2 z τ x y x y x y = - γ z G1 z τ = -φ G1 (z) 9

10 Cos è un gradiente? Facendo riferimento alla magnetizzazione trasversale, cioè coerenza singolo quantica, abbiamo visto che : φ G (z) = γ z G z τ Essendo la velocità di precessione proporzionale all ordine di coerenza p, la precedente relazione si estende a una generica coerenza di ordine p nel modo seguente: φ G (z) = γ z G z τ p 10

11 A cosa servono i gradienti In spettroscopia i gradienti di campo hanno varie funzioni: 1. Imaging (es. Gradient Shimming) 2. Distruggere magnetizzazioni non desiderate (spoil gradient, es. Noesy) 3. Selezionare dei cammini di coerenza 4. Sopprimere segnali indesiderati (es. soppressione del solvente) 5. Misurare coefficienti di diffusione 11

12 A cosa servono i gradienti In spettroscopia i gradienti di campo hanno varie funzioni: 1. Imaging (es. Gradient Shimming) 2. Distruggere magnetizzazioni non desiderate (spoil gradient, es. Noesy) 3. Selezionare dei cammini di coerenza 4. Sopprimere segnali indesiderati (es. soppressione del solvente) 5. Misurare coefficienti di diffusione 12

13 GRADIENTI DI SPOIL Per gradiente di spoiling si intende un gradiente che viene applicato per DEFOCALIZZARE L ORDINE DI COERENZA NON DESIDERATO. Questi gradienti vengono principalmente applicati quando è attesa solo coerenza di ordine 0 sulla quale il gradiente non ha alcun effetto: φ G (z) = γ z G z τ p = 0 Di seguito analizziamo due esempi: - l effetto di un gradiente durante il relaxation delay - l effetto di un gradiente durante il mixing time di un esperimento NOESY 13

14 GRADIENTI DI SPOIL Effetto del gradiente durante il RELAXATION DELAY (VEDI LEZIONE: Introduzione ai processi di rilassamento nella spettroscopia NMR T. Beringhelli) π/2 RF RD G p

15 GRADIENTI DI SPOIL Effetto del gradiente durante il MIXING TIME in esperimento NOESY π/2 π/2 π/2 RF RD t 1 τ m G p

16 A cosa servono i gradienti In spettroscopia i gradienti di campo hanno varie funzioni: 1. Imaging (es. Gradient Shimming) 2. Distruggere magnetizzazioni non desiderate (spoil gradient, es. Noesy) 3. Selezionare cammini di coerenza 4. Sopprimere segnali indesiderati (es. soppressione del solvente) 5. Misurare coefficienti di diffusione 16

17 SELEZIONE DI COERENZA CON PFG Gli impulsi di RF consentono di cambiare il livello di coerenza. La combinazione di impulsi e delay consente di creare diversi cammini di coerenza. In genere la stessa sequenza consente di creare molti percorsi di coerenza, anche se si vuole selezionare solo quello (o solo quelli) che porta all osservabile desiderata. Gli impulsi di gradiente posso essere usati, in alternativa ai cicli di fase, per selezionare uno specifico cammino di coerenza. A tale scopo è necessario che sia verificata la seguente condizione: Σ i φ i = Σ (γ i p i G i τ i ) = 0 γ = rapporto giromagnetico, dipende dal tipo di nucleo p = ordine di coerenza G τ = integrale del gradiente 17

18 SELEZIONE DI COERENZA CON PFG Supponendo di applicare gradienti di uguale durata τ la suddetta condizione diventa: Σ i φ i = τ Σ i (γ i p i G i ) = 0 Quindi per esperimenti ETERONUCLEARI deve essere verificata la condizione: Σ i (γ i p i G i ) = 0 Quindi per esperimenti OMONUCLEARI deve essere verificata la condizione: Σ i (p i G i ) = 0 18

19 SELEZIONE DI COERENZA CON PFG Per capire in che modo più gradienti agiscono sulla magnetizzazione analizziamo l effetto della combinazione di un GRADIENT ECHO e di uno SPIN ECHO RF π G z p

20 COSY RF π/2 π/2 RD t 1? G Percorso di coerenza echo +1 p 0-1 Percorso di coerenza antiecho +1 p 0-1 G1 G2 Determinare il rapporto G1:G2 che consente di selezionare il percorso di coerenza echo Φ E = p 1E *G 1E + p 2E *G 2E = 0 Φ E = 1*G 1E 1 *G 2E = 0 G 1E - G 2E = 0 Φ TOT = p 1 *G 1 + p 2 *G 2 Φ TOT = p 1 *G 1 + p 2 *G 2 = 0 G 1E = G 2E 20

21 COSY selezione coerenza echo / antiecho COSY su acido pamoico in DMSO, solo regione aromatica. ppm 6.5 ppm ppm ppm 21

22 COSY selezione coerenza echo / antiecho Hz COSY su acido pamoico in DMSO. Solo regione aromatica Hz Hz Hz -194 Hz Hz 194 Hz H z 310 H z Hz 22

23 COSY RF G Picchi assiali π/2 π/2 RD t 1 +1 p 0-1 G1 G2? Analizzare quale effetto ha sui picchi assiali il rapporto dei due gradienti determinato per la selezione del percorso di coerenza echo. Φ AX = p 1AX *G 1 + p 2AX *G 2 G 1 = G 2 Φ AX = 0*G 1 1 *G 2 = G 2 Φ AX 0 23

24 COSYDF Spesso all esperimento COSY è preferibile la variante con filtro doppio quanto, in quanto offre i seguenti vantaggi: I picchi diagonali sono in parte cancellati I segnali che non hanno accoppiamenti omonucleari (cioè i singoletti) sono eliminati. Solitamente l esperimento è phase sensitive con conseguente migliore risoluzione rispetto all esperimento, ma. π/2 π/2 π/2 RF RD t 1 G 24

25 GRADIENTI ED ESPERIMENTI PHASE SENSITIVE Negli esperimenti phase sensitive è necessario mantenere durante il tempo di evoluzione sia +p che p. Il gradiente consente di selezionare un solo percorso di coerenza. Come si possono fare esperimenti phase sensitive con gradienti? NON si applicano gradienti durante t 1 Si ripete l esperimenti due volte selezionando alternativamente +p e p. 25

26 COSYDF Phase sensitive RF π/2 RD t 1 π/2 π/2? G p Determinare i rapporti che devono avere i 2 gradienti indicati nello schema in modo da poter effettuare l esperimento in modo phase sensitive. Φ TOT = p 1 * G 1 + p 2 * G 2 = 0 Φ TOT = 2 * G 1-1 * G 2 = 0 Φ TOT = 0 2 * G 1 = G 2 26

27 COSYDF Phase sensitive Per semplicità finora abbiamo trascurato eventuali evoluzioni della magnetizzazione (o più generalmente, coerenza) durante il gradiente indipendenti dal gradiente stesso. In particolare l evoluzioni per chemical shift e/o per accoppiamento scalare possono determinare la distorsione della fase del segnale. Si rende quindi spesso necessario modificare la sequenza inserendo opportunamente impulsi di RF e/o di gradiente. 27

28 COSYDF Phase sensitive Questa è una variazione classica della sequenza precedente. π/2 π/2 π π/2 π? RF RD t 1 τ τ τ τ Cosa è cambiato rispetto a prima? G τ τ p

29 Esperimenti correlazione inversa Tra gli esperimenti che hanno maggiormente giovato dell introduzione dei gradienti ci sono gli esperimenti di eterocorrelazione 1 H-X. Storicamente le prime eterocorrelate prevedevano l acquisizione diretta del nucleo X. Il vantaggio principale è che non è necessario sopprimere il segnale dei 1 H legati a nuclei non attivi all NMR, per esempio nel caso di 13 C l 99% della magnetizzazione. Successivamente sono stati introdotti esperimenti con acquisizione su 1 H detti esperimenti inversi. Questi esperimenti sono HSQC, HMQC e HMBC. 29

30 Strategia esperimenti correlazione inversa 1. Si parte da magnetizzazione 1 H 2. Si trasferisce la magnetizzazione 1 H al nucleo X, mediante accoppiamento J (INEPT e simili) 3. Evoluzione in X 4. Si ri-trasferisce magnetizzazione ad 1 H 5. Si osserva 1 H Vantaggi: Si parte da magnetizzazione robusta ( 1 H) Si osserva 1 H Svantaggi: Bisogna eliminare tutto il segnale 1 H non accoppiato a X (per esempio 13 C). Sono richieste caratteristiche strumentali ottimali (impulsi esatti, strumentazione stabile). 30

31 ESPERIMENTI DI CORRELAZIONE ETERONUCLEARE Negli esperimenti di correlazione eteronucleare uno specifico cammino di coerenza può essere selezionato utilizzando impulsi di gradiente di uguale durata purché sia verificata la condizione: Σ (γ i p i G i ) = 0 γ = rapporto giromagnetico (dipende dal tipo di nucleo) p = ordine di coerenza G = integrale del gradiente Per calcolare correttamente il rapporto tra gradienti bisogna considerare i livelli di coerenza di entrambi i nuclei e può essere conveniente definire un livello di coerenza p : p = p( 1 H) + p(x) γ(x)/γ( 1 H) 31

32 HMQC 1 H? Sapendo che γ( 1 H) rad/t*s e X t 1 γ( 13 C) rad/t*s, determinare i rapporti G1:G2:G3 che consentono G di selezionare il cammino G1 G2 G3 di coerenza echo e quello 1 H antiecho nell esperimento HMQC 1H-13C. 13 C

33 HMQC 1 H? X t 1 Sapendo che γ( 1 H) rad/t*s e γ( 13 C) rad/t*s, determinare i rapporti G G1 G2 G3 G1:G2:G3 che consentono di selezionare il cammino di coerenza echo e quello antiecho 1 H nell esperimento HMQC 1H-13C. 13 C Φ TOT = [γ H p 1H + γ C p 1C ] * G 1 + [γ H p 2H + γ C p 2C ] * G 2 + [γ H p 3H + γ C p 3C ] * G 3 = 0 Φ TOT = [4γ C p 1H + γ C p 1C ] * G 1 + [4γ C p 2H + γ C p 2C ] * G 2 + [4γ H p 3H + γ C p 3C ] * G 3 = 0 Φ TOT = [4γ C (1) + γ C (1)] * G 1 + [4γ C (-1) + γ C (1)] * G 2 + [4γ H (-1) + γ C (0)] * G 3 = 5 G 1-3 G 2-4G 3 =0 G 1 = G 2 5G 2-3G 2-4G 3 =0 2G 2 =4G 3 G 2 =-2G 3 G 1 :G 2 :G 3 = 2:2:1 Φ TOT = [4γ C (1) + γ C (-1)] * G 1 + [4γ C (-1) + γ C (-1)] * G 2 + [4γ H (-1) + γ C (0)] * G 3 = 3G 1-5G 2-4G 3 =0 G 1 = G 2 3G 2-5G 2-4G 3 =0-2G 2 =4G 3 G 2 =-2G 3 G 1 :G 2 :G 3 = 2:2:-1 33

34 HSQC Hetero Single Quantum Coherence I τ τ τ τ S τ τ GARP inept t 1 retro-inept t 2 1 H 13 C 13 C 1 H t 1 t 2 34

35 HSQC Hetero Single Quantum Coherence 1 H τ τ τ τ? Sapendo che γ( 1 H) X t 1/2 t 1/ rad/t*s e γ( 15 N) rad/t*s, si calcoli il INEPT 1 H --> X INEPT X ---> 1 H rapporto G1:G2 per un esperimento HSQC 1 H- 15 N G G 1 G 2 Φ TOT = [γ H p 1H + γ N p 1N ] * G 1 + [γ H p 2H + γ N p 2N ] * G 2 = 0 γ( 1 H)/γ( 15 N) = Φ TOT = [-10 γ N p 1H + γ N p 1N ] * G 1 + [-10γ N p 2H + γ N p 2N ] * G 2 = 0 Φ TOT = [-10 γ N( *(0) + γ N *(-1)] * G 1 + [-10 γ N *(-1) + γ N * (0)] * G 2 = 0-1 G G 2 = 0 G 1 = 10 G 2 Φ TOT = [-10 γ N( *(0) + γ N *(1)] * G 1 + [-10 γ N *(-1) + γ N * (0)] * G 2 = 0 G G 2 = 0 G 1 = - 10 G 2 35

36 Si può aumentare la sensibilità? Per aumentare la sensibilità si può modificare la sequenza aggiungendo impulsi e delay che permettono di rifocalizzare cammini di coerenza che si perdono nella sequenza base. Molto utile per campioni diluiti o per nuclei poco sensibili ( 15 N). A volte compaiono artefatti COSY. I S GARP 36

37 HSQC Sensitivity Improvement y 1H τ τ τ τ φ y X t 1 /2 t 1 /2 INEPT 1 H --> X Sensitive Improvement G Fino a t 1 la sequenza e identica alla precedente ; durante t1 evolvono gli operatori IzSy e IzSx. Nell esperimento phase sensitive vengono alternativamente acquisiti modulati in seno e in coseno, ma per ogni esperimento uno solo dei due porta a magnetizzazione osservabile in t 2. Dal momento che il blocco di impulsi e delay che consentono di ottenere questo guadagno è inserito tra i due gradienti il rapporto G 1 :G 2 non cambia rispetto alla sequenza descritta nella diapositiva precedente. 37

38 Sensitivity Improvement In rosso: riga da spettro hsqcetgpsi In blu: riga da spettro hsqcetgp ppm 38

39 HMBC Heteronuclear Multi Bond Correlation 1H ( 1 J) (J lr )? X G 1 H 13 C t 1 G1 G2 G Sapendo che γ( 1 H) è circa 4 volte quello del 13 C determinare quali rapporti G1:G2:G3 consentono di selezionare il cammino di coerenza antiecho nell esperimento HMBC 1 H- 13 C 39

40 HMBC Heteronuclear Multi Bond Correlation 1H ( 1 J) (J lr )? X G 1 H 13 C t 1 G1 G2 G Sapendo che γ( 1 H) è circa 4 volte quello del 13 C determinare quali rapporti G1:G2:G3 consentono di selezionare il cammino di coerenza antiecho nell esperimento HMBC 1 H- 13 C Φ TOT = [γ H p 1H + γ C p 1C ] * G 1 + [γ H p 2H + γ N p 2C ] * G 2 + [γ H p 3H +γ C p 3C ]*G 3 = 0 Φ TOT = [4γ C p 1H + γ C p 1C ] * G 1 + [4γ C p 2H + γ N p 2C ] * G 2 + [4γ C p 3H +γ C p 3C ]*G 3 = 0 Φ TOT = [4γ C (1) + γ C (1)] * G 1 + [4γ C (-1) + γ N (1)] * G 2 + [4γ C (-1)+γ C (0)]*G 3 = 0 Φ TOT = [5γ C ] * G 1 + [-3γ C ] * G 2 + [-4γ C ]*G 3 = 0 5* G 1-3* G 2-4*G 3 = 0 G 1 :G 2 :G 3 = 5:4:3 40

41 A cosa servono i gradienti In spettroscopia i gradienti di campo hanno varie funzioni: 1. Imaging (es. Gradient Shimming) 2. Distruggere magnetizzazioni non desiderate (spoil gradient, es. Noesy) 3. Selezionare cammini di coerenza 4. Sopprimere segnali indesiderati (es. soppressione del solvente) 5. Misurare coefficienti di diffusione 41

42 WATERGATE La sequenza WATERGATE per la soppressione del segnale del solvente può essere realizzata pulsando selettivamente sull acqua, per esempio con un impulso profilato selettivo oppure con un treno di impulsi binomiali. Nella schema sottostante è rappresentato il secondo caso. Un treno di impulsi binomiali chiama genera: una rotazione di 0 on resonance (solvente) e a frequenze multiple di d (1/d=2 ) una rotazione di 180 off resonance. π RF G z 42

43 WATERGATE RF G z π ? 2 Verificare che applicando due gradienti uguali si ottiene l eliminazione del segnale ON RESONANCE ON RESONANCE? Determinare il valore da utilizzare per un campione in acqua il cui spettro protonico copre un finestra spettrale da 0 a 12 ppm lavorando con uno spettrometro 500 MHz. 43

44 WATERGATE RF G z π ON RESONANCE? Verificare che applicando due gradienti uguali si ottiene l eliminazione del segnale ON RESONANCE. Φ TOT = p 1 * G 1 + p 2 * G 2 Φ TOT = p 1 * G 1 + p 2 * G 1 = G 1 * (p 1 +p 2 ) Φ TOT = G 1 *(1+1) = 2 G

45 WATERGATE RF G z π ? Determinare il valore da utilizzare per un campione in acqua il cui spettro protonico copre ON RESONANCE un finestra spettrale da 0 a 12 ppm lavorando con uno spettrometro 500 MHz. La frequenza della trasmittente sarà posta in risonanza con il segnala dell acqua a 4.7 ppm. E quindi l intera finestra spettrale dovrà essere di 14.6 ppm cioè 7300 Hz per coprire fino a 12 ppm. Quindi: 2 = 1/d = 1/2d = 1/7300 = s = 137 µs 45

46 RIFERIMENTI SEQUENZE COSY M. von Kienlin, C.T.W. Moonen, A. van der Toorn, and P.C.M. van Zijl, Rapid Recording of Solvent-Suppressed 2D COSY Spectra with Inherent Quadrature Detection Using Pulsed Field Gradients, J. Magn. Reson. 93, (1991). COSY con FILTRO DOPPIO QUANTO A.L. Davis, E.D. Laue, J. Keeler, D. Moskau, and J. Lohman, Absorption-Mode Two-Dimensional NMR Spectra Recorded Using Pulsed Field Gradients, J. Magn. Reson. 94, (1991) HMQC J. Ruiz-Cabello, G.W. Vuister, C.T.W. Moonen, P. van Gelderen, J.S. Cohen, and P.C.M. van Zijl Gradient-Enhanced Heteronuclear Correlation Spectroscopy. Theory and Experimental Aspects, J. Magn. Reson. 100, (1992). R.E. Hurd and B.K. John, Gradient-Enhanced Proton-Detected Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence Spectroscopy J. Magn. Reson.91, (1991). J.M. Tyburn, I.M. Brereton, and D.M. Doddrell, Coherence Selection in Gradient-Enhanced, Heteronuclear Correlation Spectroscopy J. Magn. Reson. 97, (1992). 46

47 RIFERIMENTI SEQUENZE HSQC M. Sattler, M.G. Schwendinger, J. Schleucher, and C. Griesinger, Novel Strategies for sensitivity enhancement in heteronuclear multidimensional NMR Experiments employing pulsed field Gradients J. Biomol. NMR, 6, (1995). M. Sattler, P. Schmidt, J. Schleucher, O. Schedletzky, S.J. Glaser, and C. Griesinger, Novel Pulse Sequences with Sensitivity Enhancement for In-Phase Coherence Transfer Employing Pulsed Field Gradients, J. Magn. Reson. B108, (1995 ) G. Kontaxis, J. Stonehouse, E.D. Laue, and J. Keeler The Sensitivity of Experiments Which Use Gradient Pulses for Coherence-Pathway Selection, J. Magn. Reson. A, 111, (1994). HMBC R.E. Hurd and B.K. John, Gradient-Enhanced Proton-Detected Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence Spectroscopy J. Magn. Reson. 91, (1991). WATERGATE M. Piotto, V. Saudek, and V. Sklenar, Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions, J. Biomol. NMR, 2, (1992). 47

48 E ORA? Dall introduzione del concetto di gradiente alla sua applicazione in esperimenti NMR piuttosto sofisticati Spero di aver stimolato la curiosità di applicare questi concetti per risolvere problemi veri immagino che qualche dubbio sia rimasto, insieme a qualche domanda su come impostare l esperimento su uno spettrometro. Allora: anna.minoja@bruker.it francesca.benevelli@bruker.it corrado.dallacosta@bruker.it claudia.napoli@bruker.it formazione@bruker.it 48

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