Effetto Overhauser Nucleare

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1 Effetto Overhauser Nucleare Mario Piccioli Magnetic Resonance Center CERM Department of Chemistry University of Florence, taly Spin isolato β α ntensità 1

2 Due spin isolati 1 Due spin isolati 1 Se gli unici meccanismi sono e

3 Due spin isolati SATURO SEGNALE 8 8 Due spin isolati NVERTO SEGNALE 1-3

4 Due spin isolati 3 SATURO PARZALMENTE Due spin isolati 3 SATURO PARZALMENTE Se W 1 sono gli unici meccanismi operativi, le intensità di due segnali sono indipendenti Alterare la popolazione di uno spin non ha nessun effetto su un altro spin

5 Due spin isolati 3 SATURO PARZALMENTE Consideriamo cosa succede quando ci sono altre strade possibili.. Due spin isolati W 1 5

6 Due spin isolati 8 W 1 Due spin isolati W 1

7 Due spin isolati W 8 Due spin isolati W W Quando sono operativi w e w le intensità di due spin sono dipendenti l una dall altra 8 Dipendendo dai due meccanismi, é possibile TRASFERRE intensità di segnale da uno spin all altro ed anche, alterare l intensità complessiva dello spettro 7

8 Due spin isolati SATURO SEGNALE W W 1 Due spin isolati W W 8 SATURO SEGNALE SE TUTT MECCANSM SONO OPERATV SE VENE MANTENUTO SATURATO 8 8

9 Due spin isolati 5 W W 7 SATURO SEGNALE SE TUTT MECCANSM SONO OPERATV 8 Due spin isolati 5 W 5 W 7 SATURO SEGNALE SE TUTT MECCANSM SONO OPERATV 7 9

10 Due spin isolati 5 SATURO SEGNALE SE TUTT MECCANSM SONO OPERATV W 5 W 7 7 l Segnale diminuisce di intensità per effetto della saturazione di Due spin isolati SATURO SEGNALE RLASSA TRAMTE TUTT MECCANSM COMPRESO W (non mantengo saturazione ) W W 8 8 1

11 Due spin isolati SATURO SEGNALE 3 RLASSA TRAMTE TUTT MECCANSM COMPRESO W (non mantengo saturazione ) W 5 W 7 9 Mentre Rilassa per W ed ritorna all equilibrio.. Due spin isolati SATURO SEGNALE RLASSA TRAMTE TUTT MECCANSM COMPRESO W (non mantengo saturazione ) 5 W W 7 1 Mentre Rilassa per W ed ritorna all equilibrio W puo contribuire SA ad alterare che ad accellerare il rilassamento di 11

12 Due spin isolati SATURO SEGNALE 3 RLASSA TRAMTE TUTT MECCANSM COMPRESO W (non mantengo saturazione ) W W 9 Mentre Rilassa per W ed ritorna all equilibrio W puo contribuire SA ad alterare che ad accellerare il rilassamento di Ogni volta che sono operativi i meccanismi W e W l rilassamento dello spin é influenzato dalla presenza dello spin L intensità della transizione dello spin é alterata da un cambio delle popolazioni dello spin Questo é l effetto NOE 1

13 Effetto Overhauser Nucleare Considerazioni quantitative Mario Piccioli Magnetic Resonance Center CERM Department of Chemistry University of Florence, taly Nuclear Overhauser Effect: definizione La variazione frazionaria di intensità di un segnale, per effetto della saturazione di un altro segnale, η () = ( z - z )/ z A B A-B 13

14 Nuclear Overhauser Effect: definizione La variazione frazionaria di intensità di un segnale, per effetto della saturazione di un altro segnale, η () = ( z - z )/ z A B Variazione percentuale A-B Nuclear Overhauser Effect: Utilità-1 n determinate condizioni, l effetto NOE è una funzione della distanza tra i due spin B θ µ r µ η τ r c Lo studio quantitativo dell effetto NOE puo portare alla determinazione delle distanze internucleari in soluzione Essenziale per ottenere strutture 1

15 Esempio Esempio 15

16 Nuclear Overhauser Effect: Utilità- L effetto NOE tra due spin a distanza fissa puo dare informazioni sul tempo di correlazione B θ µ r µ η τ r c Essenziale per ottenere informazioni sulla mobilità del sistema studiato Esempio CutA1 H H N C C O N C 1

17 Esempio CutA1 τ c is different depending on internal mobility Mobility ps-ns N-terminal: Unstructured β-hairpin: Recognition Site Nuclear Overhauser Effect: Utilità-3 Nel caso di un Effetto NOE tra eteroatomi (saturazione di 1H ed osservazione di uno spettro 13C, l effetto Noe determina un aumento di intensità di tutti i segnali in ragione del loro rapporto giromagnetico η () γ / γ Nuclear Overhauser Enhancement mportante nella spettroscopia 13 C 17

18 Esempio EQUAZON DEL SSTEMA A DUE SPN W η () = ( z - z )/ z W 1 d z /dt = - ( z - z ) ρ - ( z - z ) σ d z /dt = - ( z - z ) ρ - ( z - z ) σ 18

19 EQUAZON DEL SSTEMA A DUE SPN W η () = ( z - z )/ z W d z /dt = - ( z - z ) ρ - ( z - z ) σ 1 d z /dt = - ( z - z ) ρ - ( z - z ) σ Saturo il segnale e lo mantengo saturato Sistema all equilibrio e non cambia nel tempo z (t) = d z /dt = d z /dt = STEADY STATE NOE EQUAZON DEL SSTEMA A DUE SPN W η () = ( z - z )/ z W d z /dt = - ( z - z ) ρ - ( z - z ) σ 1 d z /dt = - ( z - z ) ρ - ( z - z ) σ? 19

20 α W EQUAZON DEL SSTEMA A DUE SPN STEADY STATE NOE W η () = ( z - z )/ z d z /dt = - ( z - z ) ρ - ( z - z ) σ 1 d z /dt = - ( z - z ) ρ - ( z - z ) σ d z /dt = d z /dt = z (t) = ( z - z ) ρ = z σ ( z - z )/ z = σ / ρ ( z - z )/ z = σ / ρ ( z / z ) α 1 STEADY STATE NOE W η () = ( z - z )/ z W η () = σ / ρ ( z / z ) Se e sono due spin omonucleari con spin 1/ (es 1 H) η () = σ / ρ

21 saturated NOE difference spectra Quanto vale il NOE omonucleare? η () = σ / ρ saturated Dipende dal valore di σ e di ρ ρ = W + +W and σ S = W - W COSA SONO W, W,? 1

22 Probabilità di transizione W W 1 Le probabilità di transizione dipendono dal quadrato della energia di interazione relativamente al meccanismo che causa la transizione, moltiplicato per la funzione densità spettrale

23 Probabilità di transizione W W 1 Probabilità di Transizione = 3 K τ c 1+ω τ c nterazione dipolo-dipolo B θ µ r µ K= (1/1)(µ /π) ħ γ γ /r νπ=ω 3

24 Probabilità di Transizione = = 3 K 3 K τ c 1+ω τ c τ c 1+ω τ c W = K τ c 1+(ω -ω ) τ c W = η () = K τ c 1+(ω +ω ) τ c σ W - W = ρ W + + W = Probabilità di Transizione 3 K τ c 1+ω τ c slow motion fast motion ω τ c >1 ω τ c <1 3 τ K c = 3 K τ c 1+ω τ c W = K τ c 1+(ω -ω ) τ c W K τ c W = η () = K τ c 1+(ω +ω ) τ c σ W - W = ρ W + + W K τ c 1 =

25 La dipendenza da r K è relativo all interazione dipolare tra i due spin l interazione dipolare dipende dai γγr -3 che va tutto al quadrato B θ µ r µ NOE and molecular weight 5

26 NOE in real life Se considerassimo un sistema a due spin isolato, il NOE in effetti NON conterrebbe nessuna informazione strutturale, dal momento che il termine distanza-dipendente compare sia in s che in r e come tale viene semplificato. Ma Nessun sistema a due spin é davvero considerabile un sistema puramente dipolare Nessun sistema a due spin é davvero considerabile un sistema isolato Contributo di altri meccanismi di rilassamento σ η () = (ρs + ρ * ) r * si somma al rilassamento dipolare ed il suo effetto é di diluire contributo del rilassamento del dipolo isolato, determinando una diminuzione dell effetto NOE. Tipicamente NON dipende dal campo magnetico ne dalle dimensioni della molecola Poiché NON dipende da r, la conseguenza di questo contributo é di introdurre nelle equazioni del NOE una dipendenza dalla distanza

27 Contributo di altri meccanismi di rilassamento Se ρ * diventa dominante rispetto a ρ S, allora succede che η () = σ σ = = A (ρ S + ρ * ) ( ρ * ) τ c r ij Presenza di nuclei quadrupolari o di centri paramagnetici (O, radicali, ioni metallici S ) Paramagnetic molecules Fe S cluster in HiPP proteins 7

28 NOE in Paramagnetic molecules The hyperfine interaction with electron spin S quenches the NOE effect! H C H S Fe NOE in real life Oltre al fatto che esistono contributi al rilassamento non dovuti ad accoppiamenti dipolari, in un sistema reale un sistema a due spin non é mai isolato, ma gli spin sono sempre molti di piu 8

29 NOE in un sistema multi spin Se ho un terzo spin, X, ed esso é accoppiato dipolarmente con, l termine ρ X contribuisce al rilassamento di R = ρ S +ρ X n un generico sistema dove é accoppiato con S e con altri n spins R = ρ S +Σρ X Sistema a 3 spin β w 1 α β β w 1 w 1 β w 1 α β α 9

30 Sistema a 3 spin β w 1 α β β w 1 w 1 β w 1 α α W S e W S β Sistema a 3 spin β w 1 α β β w 1 w 1 β w 1 α α W K e W K β 3

31 Sistema a 3 spin β w 1 α β β w 1 w 1 β w 1 α α W S e W S β W K e W K l NOE di un sistema multispin puo essere trattato come la somma di sistemi a due spin NOE in un sistema multi spin η () = σ ρ ss NOE in un sistema a due spin [ σ X ] η () = ΣρX X 1 σ Σ (X-X ) ss NOE in un sistema multi spin Se c é un terzo spin X accoppiato con, l intensità del NOE diminuisce perché: ρ X contribuisce al denominatore σ X trasferisce l effetto su X 31

32 Esempio 1D riferimento A 1D segnale saturato B σ 1D NOE differenza B-A Se il NOE ha segno positivo Esempio 1D riferimento A 1D segnale saturato B σ σ X 1D NOE differenza B-A Se il NOE ha segno positivo 3

33 Esempio 1D riferimento A 1D segnale saturato B σ 1D NOE differenza B-A Se il NOE ha segno negativo Esempio 1D riferimento A 1D segnale saturato B σ σ X 1D NOE differenza B-A Se il NOE ha segno negativo 33

34 Effetto del rilassamento l contributo ρ diventa piu importante a peso molecolare basso ρ =.5 s -1 ρ =. s -1 ρ = s -1 Effetto del rilassamento ρ =.5 s -1 3

35 35

36 NOE STEADY STATE L esperimento Steady state deve essere utilizzato se nel sistema studiato ci sono fonti di rilassamento efficaci o se vogliamo cercare di ottenere il maggior numero possibile di informazioni qualitative sugli accoppiamenti dipolari n generale, non è l esperimento piu appropriato per ottenere una dipendenza quantitativa da r ij -, che spesso è l obiettivo di un esperimento NOESY Ma per modificare l equazione del NOE basta modificare le condizioni dell esperimento EQUAZON DEL SSTEMA A DUE SPN W STEADY STATE NOE η () = ( z - z )/ z W d z /dt = - ( z - z ) ρ - ( z - z ) σ 1 d z /dt = - ( z - z ) ρ - ( z - z ) σ Saturo il segnale e lo mantengo saturato Sistema all equilibrio e non cambia nel tempo z (t) = d z /dt = d z /dt = ( z - z )/ z = σ / ρ ( z / z ) 3

37 TRUNCATED NOE W η () = ( z - z )/ z α W d z /dt = - ( z - z ) ρ - ( z - z ) σ 1 d z /dt = - ( z - z ) ρ - ( z - z ) σ Saturo il segnale e lo mantengo saturato z (t) = d z /dt = NON Aspetto che il sistema arrivi al nuovo equilibrio e non cambi nel tempo d z /dt ( z - z )/ z = σ / ρ ( z / z ) (1-exp(- ρ t)) Steady state vs. truncated NOE l NOE che si crea dipende dal tempo di saturazione η (S) = [σ (S) / ρ ] (1-exp(- ρ t)) Steady state: il segnale è saturato per un tempo lungo rispetto al T 1 del segnale su cui si osserva NOE Troncato: l tempo di saturazione è corto rispetto al T 1 del segnale su sui si osserva NOE Se t è corto rispetto a r η (S) = σ (S) t otteniamo una misura diretta di s (S) 37

38 Buildup del NOE σ t σ / ρ (1-exp(- ρ t)) Buildup del NOE η=σ η=σ t=ktr - η i / η ik =(r /r K ) - 38

39 Applicazioni di STEADY STATE NOE Se sono in un sistema eteronucleare, posso saturare tutti i segnali Se sono in un sistema omonucleare, la saturazione è un esperimento selettivo e non banale. TRANSENT NOE W η () = ( z - z )/ z α W d z /dt = - ( z - z ) ρ - ( z - z ) σ 1 d z /dt = - ( z - z ) ρ - ( z - z ) σ nverto il segnale invece di saturarlo z () = - z ( ) Lo lascio evolvere nel tempo NON Aspetto che il sistema arrivi al nuovo equilibrio e non cambi nel tempo d z /dt d z /dt d z /dt d z /dt z (t) ( z - z )/ z = (exp(-(ρ -σ () )t) (1-exp(- σ () t)) 39

40 TRANSENT NOE η () = ( z - z )/ z W W 1 TRANSENT NOE η () = ( z - z )/ z W W 1 -

41 TRANSENT NOE η () = ( z - z )/ z W W 1 - Transient NOE When a selective 18 pulse is applied at the frequency of one of the spins. Then the decay of the system to equilibrium is observed. η () = (exp(-(ρ -σ () )t) (1-exp(- σ () t)) 1

42 d z /dt d z /dt z (t) TRANSENT NOE ( z - z )/ z = (exp(-(ρ -σ () )t) (1-exp(- σ () t)) Se le velocità di rilassamento di e sono uguali n un sistema a due spin isolato, il NOE dipende da σ ρ ρ t t è il tempo che durante il quale il sistema evolve per effetto delle eq differenziali di cui sopra d z /dt d z /dt z (t) TRANSENT NOE Se ρ e ρ sono diverse η () = (σ/d)(exp(-(r +D)t)- (exp(- (R D t)) D = [(1/)(R R ) + σ ] R = (1/)(R +R )

43 d z /dt d z /dt z (t) TRANSENT NOE η () = (σ/d)(exp(-(r +D)t)- (exp(- (R D t)) D = [(1/)(R R ) + σ ] R = (1/)(R +R ) ( z - z )/ z = (exp(-(ρ -σ () )t) (1-exp(- σ () t)) d z /dt d z /dt z (t) TRANSENT NOE η () = (σ/d)(exp(-(r +D)t)- (exp(- (R D t)) D = [(1/)(R R ) + σ ] R = (1/)(R +R ) 3

44 Transient NOE With steady state NOE, have to continuously irradiate the system to achieve saturation. This is fine for small molecules but with larger molecules, get spin diffusion: The energy that is transferred from nuclei to nuclei S is then transferred to other nuclei. This will give signal enhancement even for nuclei far away from the center of irradiation. For larger molecules, the amount of time that the spins are saturated must be limited (otherwise get spin diffusion). Also, working on one proton at a time for larger molecules would be time consuming. Have to do a D experiment where all proton are studied. NOE Transiente vs NOE Steady State

45 Esperimenti omonucleari NOESY Attraverso un accoppiamento dipolari tra due nuclei dello stesso tipo é possibile trasferire la magnetizzazione da uno spin ad un altro attraverso l effetto NOE Tutti gli spin del sistema trasferiscono nello stesso esperimento Non é necessario eccitare selettivamente un segnale alla volta, ma tutti sono eccitati nello stesso esperimento NOE non selettivo AA Diagonale AB Cross peak Spettri NOESY Protein MW ca. 1 Small molecule MW ca H H- 1 H NOESY 1 H 5

46 NOE Buildup during the mixing time Fast motion Slow motion