Si osserva il comportamento dei protoni La proteina è in soluzione
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- Giacinta Biagi
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1 Risonanza magnetica nucleare Si osserva il comportamento dei protoni La proteina è in soluzione
2 Risonanza magnetica nucleare Si osserva il comportamento dei protoni La proteina è in soluzione Si assegnano le risonanze agli amino acidi Si misurano distanze I vincoli derivati si usano per ricostruire la struttura.
3 Risonanza magnetico nucleare I protoni hanno un momento angolare di spin Si comportano come piccoli magneti e si allineano con o contro un campo magnetico Bo I magneti interagiscono l uno con l altro S N S N
4 Anche 13C e 15N hanno un momento angolare di spin
5 La magnetizzazione puo essere trasferita tra 1, 13 C e 15 N Bo C N C C Chemical Shifts J-couplings (attraverso i legami) Dipolar couplings (attraverso lo spazio)
6 C N C C C N C C C N C C C N C C Chemical Shifts J-couplings (attraverso i legami) Dipolar couplings (attraverso lo spazio)
7 Alcuni nuclei hanno spin semi-intero e- I nuclei con numero di massa dispari hanno spin semi-intero 13 C, 1, 31 P I = 1/2 17 O ii = 5/2 I nuclei con numero di massa pari e carica pari hanno spin 0 12 C I nuclei con numero di massa pari a carica dispari hanno spin interi 2 spin I = 1
8 Il passaggio di corrente attraverso un solenoide induce un campo magnetico e- e- Un campo magnetico variabile induce una corrente in un solenoide. e- e-
9 L introduzione di un nucleo con spin ½ in un campo magnetico da origine a una magnetizzazione netta kungo l asse del campo magnetico. Grande magnete esterno Magnetizzazione allineata lungo l asse Z del campo magnetico Bo
10 Si produce un campo B1 con un piccolo solenoide in un tubo NMR posizionato all ntermo di un magnete esterno potente. B 1 Questo induce una magnetizzazione netta lungo l asse x del campo magnetico Bo
11 Magnete NMR. B 1 Bo Tubo NMR e- e-
12 Quando si applica B1, la magnetizzazione ruota intorno al piano XY z Bo y x
13 Quando B1 viene spento, la magnetizzazione netta si rilassa con una costante di tempo T 1 z T 1 Bo y x T 1 e la costante di rilassamento longitudinale
14 Funzioni esponenziali y y = e -x/t x y y = 1- e -x/t x Mz Mz = Mo (1- e -t/t1 ) t
15 Gli spin individuali precessano intorno all asse del campo magnetico z Bo y x Frequenza di precessione o di Larmor ωo = -γ Bo (Mz)
16 Dopo che la magnetizzazione e ruotata nel piano XY dal campo B1, si produce un impulso nel solenoide. z y Bo y x x
17 I vettori di magnetizzazione individuali che si muovono nel piano XY rappresentano un campo magnetico variabile che induce una corrente in un solenoide di rivelazione y y x x
18 Il segnale NMR e la trasformata di Fourier della corrente oscillante indotta nel solenoide di rivelazione y x - y - x y time x frequency
19 Chemical Shifts
20 Gli spin nucleari producono un piccolo campo magnetico che si oppone al campo magnetico esterno. 1 ha un piccolo chemical shift (15ppm)
21 Gli elettroni hanno spin ½ e quindi producono un piccolo campo magnetico che si oppone a quello estermo.
22 Ppm = parti per millione 400 Mz 100 Mz 30 Mz 1 13 C 15 N 15 ppm 1 ppm = 400 z 15 ppm = 6000 z 1 (15 ppm).
23 Gli elettroni schermano gli spin nucleari dal campo esterno B0. Questo da origine a una riduzione della distanza energetica tra i due livelli. Questo è il chemical shift. b b C-O C 3 a a C-O C 3 frequenza
24 b b 100,010,000 z 100,000,000 z a a C-O C3 Reference = 100,005,000 z
25 I nuclei con diversi chemical shifts e frequenze di Larmor ruotano intorno all asse z a velocita differenti. T2 e la costante di tempo con cui i vettori di magnetizzazione si defasano nel piano XY. y -5,000 z below reference C3 reference frequency C-O C 3 x C-O +5,000 z above reference frequency
26 Chemical Shifts J-couplings (through bond) Dipolar couplings (through space) Struttura C N C C T1 relaxation T2 relaxation Dinamica
27 Eseprimento mono dimensionale π /2 Acquisizione t 1 Trasformata di Fourier t 1 -> f 1 f 1
28 Esperimento monodimensionale π /2 Acquire Sui usano le trasformate di Fourier per risolvere le varie frequenze t 1 Fourier Transform t 1 -> f 1 f 1
29 Esempio
30 Nuclear Overhauser Effect (NOE) 4 Ang s i
31 NOE RF 4 Ang A saturazione s i RF
32 NOE RF 4 Ang s i RF
33 NOE RF 4 Ang s i Spin di interesse
34 Esperimento bidimensionale π /2 π /2 Acquire t 1 t 2 Trasformata di Fourier t 1 -> f 1 e t 2 -> f 2 f 1 f 2
35 Esperimento bidimensionale π /2 π /2 Acquire t 1 t 2 Cambia t 1 Colleziona una serie di spettri 1D π /2 π /2 Acquire t 1 t 2 π /2 π /2 Acquire t 1 t 2
36 Esperimento bidimensionale t 1 Cambia t 1 Colleziona una serie di spettri 1D f 2 Qui le intensita verdi e blu non cambiano in funzione di t1
37 Esperimento bidimensionale t 1 Cambia t 1 Colleziona una serie di spettri 1D Invece qui le intensita verdi sono modulate da t1 f 2
38 Esperimento bidimensionale t 1 Trasformata di Fourier in t 1 f 2
39 Passaggi Proteina pura (0.3 ml, mm; ~ 10 mg) 2. Assegnameno delle risonanze 3. Vincoli sulle distanze 4. Lunghezza legami, angoli etc. 4. Ricostruzione struttura
40 Quindi... Possiamo derivare delle distanze approssimate fra protoni Le distanze possono essere usate per ricostruire la struttura (MD, Distance geometry)
41 L ensemble NMR Non si calcola una singola struttura, ma generano un insieme di strutture compatibili con I dati. Risultato ideale: Soddisfa tutti I vincoli Rappresenta l;insieme delle strutture permesse Somiglia ad una proteina!
42 Metodi distance geometry (DG) restrained molecular dynamics (rmd) simulated annealing (SA) hybrid methods
43 Partire da conformazioni diverse Punti di partenza
44 DG--Distance geometry Si usano I vincoli per generare una matrice di distanze La matrice e incompleta, si possono usare le diseguaglianze triangolari piu la chiralita Deve essere combinata con metodi energetici per generare strutture ragionevoli
45 rmd--restrained molecular dynamics Si aggiunge un termine al potenziale che tiene conto dei vincoli V total = V bond + V angle + V dihedr + V vdw + V coulomb + V NMR
46 Termine di pseudo energia Per esempio: K NOE (r ij -r iju ) 2 if r ij >r ij u V NOE = 0 if r ijl <r ij < r ij u K NOE (r ij -r ij1 ) 2 if r ij <r ij l
47 NMR Ensemble
48 Esempio di pseudopotenziale V NOE 0 r ij l r ij u
49 Precisione delle strutture NMR (Risoluzione?) RMSD delle strutture sovrapposte (a cooppia o media) Una buona struttura ~15-20 vincoli per residuo ma soprattutto 3-5 per residuo che siano a lungo raggio
50 Structural Statistics Tables Lista dei vincoli, # e tipo Energia calcolata Accordo delle strutture con i vincoli RMSD
51 Risultato
52 Risultato
53 NMR exchange
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