RNA Interference (RNAi)

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1 RNA Interference (RNAi) Double stranded RNA (dsrna) responsabile del silenziamento di geni da cui e derivato. SPECIFICO. E UN MECCANISMO NATURALE IN PIANTE, FUN GHI, INSETTI E MAMMIFERI FUNZIONI DELL RNAi Regola l espressione di geni codificanti Media la resistenza ai patogeni (virus e viroidi) E molto usato per il blocco della espressione genica artificiale ale

2 Cronologia: 1990 espressione di transgeni in petunia causa la pigmentazione variegata (Co-suppression) A variegated petunia. Upon injection of the gene responsible for purple colouring in petunias, the flowers became variegated or white rather than deeper purple as was expected.

3 Cronologia: in C. elegans il dsrna porta a silenziamento genico sequenza-specifico il silenziamento genico e stato trovato in molti eucarioti, tra cui D. melanogaster, M. musculus, C, elegans, H. sapiens.

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6 Ruoli noti o supposti dell RNAi Silencing di virus e sequenze ripetute Soppressione di elementi mobili in piante e C. elegans Divergenza evolutiva e speciazione in piante e invertebrati

7 Terminologia: dsrna: double stranded RNA, piu lungo di 30 nt shrna: short hairpin RNA, artificiali ma a forcina, espressi da un plasmide mirna: microrna, nt. Codificati da geni endogeni Sono precursori di forcine Possono riconosscere target perfettamente complementari (distruzione RNA=piante) o non perfettamente complememtari (blocco traduzione e\o TGS=animali) Tutti vengono processati in sirna sirna: short-interfering RNA, nt. Sia di origine esogena che endogena Derivati da dsrna Sono sequenza specifici Hanno un effetto di distruzione del mrna duraturo

8 Inizio RNAi: un processo bifasico Generazione di sirna e mirna maturi Esecuzione Silencing di geni target Degradazione del messaggero o inibizione della trascrizione COMPLESSO DI SILENZIAMENTO: ds sirnai (21-23bp) Proteine RISC (RNAi induced silencing complex)

9 1. Distruzione di RNA virali 2. Eliminazione dei trascritti da elementi mobili (trasposoni) e DNA ripetitivo 3. Blocco della sintesi s di proteine attraverso la produzione di small RNA 4. Inibizione della trascrizione 5. Uso sperimentale dei sirna per l inibizione dell espressione di geni target

10 La generazione di sirna endogeni o esogeni: un pathway comune

11 La distruzione del messaggero e la inibizione della traduzione: sirna e mirna

12 RNAi nelle cellule animali: Lin4 e let c. elegans sviluppo Lsy6 e mir C. elegans neurogenesi Bantam D. melanogaster-----proliferazione Mir D. melanogaster apoptosi Mir M. M musculus ematopoiesi

13 Biogenesi mirna Trascritti da geni endogeni come primary mirna Tagliati da Drosha in pre-mirna ~70nt forcina imperfetta (gia 3 overang) Esportati dal nucleo Tagliati da DICER in mirna maturi 21-25nt 2nt 3 overhangs, 5 P

14 - E una RNAse-III Drosha - - Processa pri-mirna in pre-mirna taglia 3 overhangs su pre-mirna - Riconosce il pri-mirna dalla forcina e dallo stelo citoplasma

15 Biogenesi sirna DICER taglia i dsrna in sirna 21-25nt dsrna esogeni o endogeni (virus, trasposoni) 2nt3 overhangs,5 P Amplificazione dei sirna (evidenza in piante e C. elegans) e persistenza del fenomeno (ecco perche sembra non dipendere dalla efficienza di trasfezione)

16 RISC ~ 250KDa Complesso RISC (RNAi induced silencing complex) COMPONENTI del complesso RISC : sirna o mirna endonucleasi esonucleasi??? Argonauta (AGO)

17 Dicer Taglia dsrna o pre-mirna Lascia delle caratteristiche ti 3 overhangs e 5 P e una RNAse-III Domini funzionali: Elicasi (deve svolgere!) PAZ dominio Domini RNAse-III in Tandem dsrna binding domain In piante ed in Drosophila sono state trovate DICER multiple (specificita di sequenza o di funzione???)

18 Dicer is an endoribonuclease in the RNase III family that cleaves doublestranded RNA (dsrna) and pre-microrna (mirna) into short double- stranded RNA fragments called small interfering RNA (sirna) about nucleotides long, usually with a two-base overhang on the 3' end. contains two RNase III domains and one PAZ domain (involved in RNA binding) catalyzes the first step in the RNA interference pathway and initiates formation of the RNA-induced silencing complex (RISC), whose catalytic component argonaute is an endonuclease capable of degrading messenger RNA (mrna) whose sequence is complementary to that of the sirna guide strand.

19 Argonauta Le proteine argonaute (l'accezione italiana argonauta è meno usata) sono la componente catalitica dell'rna-induced silencing complex (comunemente chiamato RISC), il complesso riboproteico responsabile del processo di silenziamento dell'espressione genica noto come RNA interference. Le argonaute sono infatti in grado di legare i frammenti di small interfering RNA (in particolare il filamento detto guida) e di svolgere attività endonucleasica contro gli mrna complementari allo stesso filamento guida. Le proteine sono anche responsabili della selezione del corretto filamento guida, nonché della degradazione di quello complementare. Le proteine sono state localizzate ad elevate concentrazioni in regioni del citoplasma cellulare note come corpi citoplasmatici. Le proteine argonaute finora individuate sono costituite di due domini. Un dominio detto PAZ all'estremità N-terminale ed uno PIWI al C-terminale. Il dominio PAZ è coinvolto nel legame all'rna. Tale ruolo è stato confermato dalla cristallizzazione di un domino PAZ legato ad una doppia elica di RNA di struttura tt simile il ad un sirna. Il dominio PIWI consiste di un canale carico positivamente, che gli conferisce le caratteristiche di RNA-binding protein, dal momento che l'acido ribonucleico è carico negativamente

20 RNA Dependent RNA Polymerase (RdRP) Copia uno strand e sintetizza ti dsrna ex novo (i sirna funzionano da primers sul messaggero ed il dsrna si amplifica) RdRP trovata in piante e C. elegans ma non in mammiferi e Drosophyla Puo spiegareladuratadelfenomenoperche e p g p la responsabile della amplificazione dei sirna

21 RNA Dependent RNA Polymerase (RdRP) RNA-dependent RNA polymerase (RdRP), or RNA replicase, is an enzyme that catalyzes the replication of RNA from an RNA template. This is in contrast to a typical RNA polymerase, which catalyzes the transcription of RNA from a DNA template. Viral RdRPs were discovered in the early 1960s from studies on mengovirus and polio virus when it was observed that these viruses were not sensitive to actinomycin i D, a drug that t inhibits cellular l DNA directed RNA synthesis.this lack of sensitivity suggested that there was a virus specific enzyme that could copy RNA from an RNA template and not from a DNA template

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23 RNA Induced Silencing Complex (RISC) E il complesso responsabile dell RNAi Responsabile sia della degradazione d di mrna che della inibizione della traduzione Non ben caratterizzato 4 sub??? Piu???? Attivita del complesso: Elicasi (svolge il ds sirna) Endonucleasi (rompe il mrna) homology seeking /RNA binding (cerca le regioni omologhe nei messaggeri) Incorpora preferenzialmente un solo strand del sirna Antisenso Lo riconosce attraverso AGO

24 RNA-Induced d Silencing i Complex (RISC) is a multiprotein complex that incorporates one strand of a small interfering RNA (sirna) or micro RNA (mirna). RISC uses the sirna or mirna as a template for recognizing complementary mrna. When it finds a complementary strand, it activates RNase and cleaves the RNA. This process is important both in gene regulation by micrornas and in defense against viral infections, which often use double-stranded RNA as an infectious vector

25 Inibizione della traduzione Imperfect match tra sirna o mirna in RISC ed il target mrna RISC usualmente lega 3 UTR Nature He and Hannon, 2004

26 Degradazione mrna Complementarieta perfetta tra sirnaomirnanelrisced il target mrna Cleavage by RISC Slicer activity

27 Inibizione della traduzione Imperfect match tra sirna o mirna in RISC ed il target mrna RISC usualmente lega 3 UTR

28 Degradazione mrna Complementarieta perfetta tra sirna o mirna nel RISC ed il target mrna Cleavage by RISC Slicer activity Potrebbe essere Dicer? Novina and Sharp, 2004c

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30 Altri effetti dell RNAi: il trascriptional gene silencing (TGS) RNAi agisce anche a livello trascrizionale via modificazioni della cromatina [Volpe et al., 2002] Piante, C. elegans, Drosophyla Punti di connessione con i fenomeni citoplasmatici Argonauta e presente sia in RISC che in RIST Complesso RITS RNA-induced d initiation iti of transcriptional ti silencing RITS media la formazione di eterocromatina in maniera sequenza specifica Si spiega il silenziamento genico sequenza specifico ma non la Si spiega il silenziamento genico sequenza specifico ma non la ereditarieta dell RNAi

31 Ac -acetylated histones; mc-methylated Cytosine HDAC -histone deacetylases: Pol II- RNA polymerase GTF- general transcription factors HAT -histone acetyltransferases; MBD -methylated DNA binding domain Nakao M, 2001

32 la regolazione del silencing da RNAi (TGS) coinvolge la metilazione i su lisina i 9 dell istone H3 I piccoli RNA trascritti che danno luogo all TGS sono nelle ripetizioni eterocromatiniche dei centromeri la delezione di geni coinvolti nel pathway dell RNAi (AGO, Dicer, etc) impediscono il TGS di trasgeni inseriti nella eterocromatina Il silencing della eterocromatina e l RNAi sono pathways correlati

33 Il silenziamento della eterocromatina: modificazioni degli istoni Acetilazione e metilazione delle lisine della parte N-terminale degli istoni H3 and H4 174 bp of Metilazione Acetilazione metilazioni TRASCRIZIONE acetilazioni

34 Modello di funzionamento del TGS mediato da sirna RNA omologhi alle ripetizioni centromeriche sono processati in sirna I sirna reclutano delle metilasi istoniche (tipo Clr4 per H3) La Lys 9 dell H3 viene metilata e il repressore Swi6 si lega e reprime ogni trascrizione

35 le sequenze ripetute vengono trascritte nei due sensi e si formano gli shrnas le metilasi Chromo legano i sirna formatisi e li portano in prossimita del DNA omologo si metilano gli istoni H3 nella K9 si potrebbe metilare il DNA NE DERIVA UNA STRINGENTE INIBIZIONE DELLA TRASCRIZIONE Swi6: eterocromatin tin protein EREDITABILE E SEQUENZA SPECIFICA

36 Transcriptional gene silencing

37 A: le sequenze ripetute vengono trascritte nei due sensi e si formano gli shrnas Le metilasi Chromo legano i sirna formatisi e li portano in prossimita del DNA omologo Si metilano gli istoni H3 nella K9 si potrebbe metilare il DNA (questo lavoro lo conferma) NE DERIVA UNA STRINGENTE INIBIZIONE DELLA TRASCRIZIONE Nelle piante il procedimento e stato proposto: p EREDITABILE E SEQUENZA SPECIFICA Jenuwein, T Science 297:

38 I sirna come tool per la modulazione della espressione genica

39 dimensioni sirna (21-22nt) mediano la repressione dell espressione in mammiferi i L introduzione di sirna piu lunghi da processare poi in shrna previene effetti aspecifici Supply via trasfezione transiente La persistenza dell effetto non e stata sempre osservata Non e noto il funzionamento

40 Regole empiriche per il design di un buon sirna 21nt long, 2nt 3 overhangs Scartare introni e UTR Scartare regioni con contenuto di GC >50% Usare criteri di BLAST molto stringenti per screenare le banche dati per evitare anche mismatched, annealing e inibizioni aspecifiche

41 Regole empiriche per il design di un buon sirna - 21nt long, 2nt 3 overhangs - Scartare introni e UTR - Scartare regioni i con contenuto di GC >50% - Usare criteri di BLAST molto stringenti i per screenare le banche dati per evitare anche mismatched annealing e inibizioni aspecifiche Mittal, 2004

42 Efficienza in vitro dei sirna Si devono spesso utilizzare molti sirna sullo stesso gene per ottenere RNAi notevoli Si possono usare mix originati in vitro da uno stesso dsrna Recombinant Dicer usata per tagliare

43 Due meccanismi per generare i sirna di 22 bp Sintesi chimica di sirna di 22 bp, bypass della Dicer Introduce imperfect hairpin i RNA into cells Trasfezione con plasmidi che producono RNA interfering (based on mrna sequence) and lunghi, Dicer produce i frammenti di 22 bp sirna let Dicer make mirna

44 RNAi stabile nei mammiferi Metodi basati su vettori plasmidici Espressione del senso e dell antisenso Produzione stabile di un sirna con 3 overhangs Espressione di pre-mirna che diviene un shrna con 3 overhangs ed infine un sirna Si possono utilizzare vettori inducibili e\o tessuto specifici

45 Predizione di mirna nel genoma dei vertebrati MiRscan [Lim et al., 2003] Controlla la presenza di potenziali mirna con strutture hairpin Sono stati trovati 188 loci in H. sapiens. Ma mentre nelle piante i mirna sono perfettamente complementari, negli animali DEVONO contenere quanche zona non appaiata.

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47 CONCLUSIONI: L RNAi inibisce l espressione genica in due modi: degradazione del messaggero e silencing trascrizionale (metilazione istoni e metilazione DNA) La metilazione del DNA mediata da sirna e un fenomeno generale e spiega la ereditarieta del TGS legato al RNAi Il TGS puo essere indotto artificialmente mediante sirna NON SI SA NIENTE su come avviene

48 RNA interfering: riflessioni la metilazione indotta dai sirna fornisce una possibile spiegazione della persistenza del fenomeno della interferenza sull espressione (ereditata dopo divisione mitotica) E un fenomeno additivo (ma il ruolo del capping non doveva essere di protezione da RNAsi?) E probabile che possa avere un ruolo importante in: A) speciazione: cromosomi materni e paterni diversi dopo accoppiamento di individui di specie diverse interfertili mancanza di silenziamento i di uno dei due alleli li un nuovo fenotipo si manifesta B) vigore dell ibrido: gli ibridi possono perdere il silenziamento di trasposoni (su entrambi gli alleli) aumentata espressione di alcuni geni acquisizione di vigore C) perdita di imprinting di geni

49 Il controllo dell espressione genica Transfezioni cellulari Knockout genici e fenotipici

50 TRASFEZIONI Transienti o stabili Transienti (24-72 h) Analisi rapida Non necessita di markers di selezione Stabile Analisi con tempi lunghi (2 mesi per la trasfezione) Richiede dei markers di selezione nel vettore plasmidico (neomycin/g418, dihydrofolate reductase,hygromycin) Utile per studi di espressione condizionata o inducibile

51 TRASFEZIONI I metodi usati dipendono dalle cellule utilizzate HeLa, HEK 293T, COS7, HL60 Lipofezione: alta efficienza, non tossico e.g. Lipofectamine Plus (Invitrogen) Precipitazione in fosfato di calcio: semplice ma bassa efficienza DEAE-dextrano semplice: alta efficienza, utile solo per espressione transiente Elettroporazione: alta efficienza, altissima mortalita cellulare, solo per espressione stabile Trasfezione retrovirale: molto efficiente, richiede tempo e molto lavoro e.g. defective adenovirus

52 Scelta dei geni reporter per le trasfezioni CAT (chloramphenicol acetyltransferase) Trasferisce il 14 C-acetile sul cloramfenicolo, detection mediante thin layer chromatography h ed autoradiografia GAL (β-galactosidase) Idrolizza dei galottosidi incolori e li traforma in prodotti cromogeni. Test mediante cambio di colore SEAP (secreted human placental alkaline phosphatase) p saggio basato sulla fosfatasi alcalina, molto sensibile perche associata a substrato luminescente LUC (luciferase) Ossida una luciferina che emette fotoni. Si contano I fotoni emessi mediante un luminometro. GFP (green fluorescent protein) Fluoresce se irradiata con luce UV Si osserva al microscopio a fluorescenza o si misura la fluorescenza in un fluorimetro. Ne esistono molte isoforme diverse con colori diversi.

53 Trasfezioni Il DNA deve attraversare il citoplasma e spesso ingolfa I lisosomi e solo in parte riesce a raggiungere il nucleo L inibizione delle funzioni lisosomali mediante trattamento con clorochina aumenta la efficienza di trasfezione TRASFEZIONE SEPARATE DI 2 PLASMIDI -> DIFFERENTE SITO DI INTEGRAZIONE NEL DNA TRASFEZIONE DI 2 PLASMIDI CONTEMPORANEAMENTE -> STESSO SITO DI INTEGRAZIONE RICOMBINAZIONE OMOLOGA MOOOOLTO BASSA, INTEGRAZIONE PER RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA

54 Trasferimento genico in colture cellulari in vitro

55 Come studiare la funzione dei geni Gene Approccio genetico Transcript AAAAA gene knock-out Protein - specie specifico - tanto t tempo e lavoro

56 Come studiare la funzione dei geni gene Approccio epigenetico Transcript AAAAA Protein Anticorpi neutralizzanti - limitato a proteine extracellulari - risultati difficili da predire ed interpretare

57 Come studiare la funzione dei geni gene Approccio epigenetico Transcript AAAAA Protein espressione di dominanti negativi - applicazioni molto vaste

58 Come studiare la funzione dei geni gene Approccio epigenetico Transcript AAAAA Protein oligonucleotidi Antisenso RNAi

59 IL KNOCK-OUT OUT FENOTIPICO: facciamo fuori la proteina, non il gene! RNA o DNA antisenso RNA interfering

60 RNA o DNA antisenso

61 Small RNA interference interferenza con la espressione mediata da piccoli RNA di b (sirna) E al momento la tecnica piu potente per l analisi della funzione delle proteine knockdown fenotipico in cellule di mammifero in coltura L RNAi e un meccanismo naturale per il silenziamento genico posttrascrizionale sequenza specifico

62 Proprieta degli RNAi dsrna (non ssrna) e il responsabile del silenziamento E un silenziamento che influenza gli esoni e non gli introni E MOOOOLTO potente (poche molecole di RNAi per cellula sono sufficienti) Persistente (influenza molte replicazioni)

63 Mechanism of RNAi: Gene Silencing directed d by ~22nt RNAs dsrna processamento ~22nt sirnas mrna bersaglio riconoscimento copia degradazione + processamento amplif ficazion ne sirnas secondari Propagazio one alle suc ccessive ge enerazioni

64 Limitazioni dell uso del silenziamento tramite sirna Risposta transiente (~3-7 gg) Problemi di traduzione (tipo cellulare, refrattorieta alla lipofezione) MOLTO UTILIZZATI E DANNO GRANDI RISULTATI

65 RNAi in vivo ESEMPIO Silenziamento della lamina in cellule umane mediante lipofezione di sirna Nature :

66 Due meccanismi per utilizzare il silenziamento genico Sintesi chimica di sirna di 22 bp, bypass della Dicer Trasfezione con plasmidi che producono RNA interfering lunghi, Dicer produce i frammenti di 22 bp sirna shrna Introduce imperfect hairpin i RNA into cells (based on mrna sequence) and let Dicer make mirna

67 Lentivirus e adenovirus

68 Lentivirus Appartengono alla famiglia dei Retroviridae. Il genoma è costituito da due copie di RNA a singolo filamento. Instaurano in genere infezioni croniche con lungo periodo di incubazione. i A differenza degli altri retrovirus possono infettare cellule proliferanti e post-mitotiche. Il DNA virale può integrarsi nel DNA della cellula ospite

69 Lentivirus HIV-1 è uno dei 4 retrovirus umani più conosciuti altri retrovirus umani sono HIV-2 HTLV-1 HTLV-2 Infezione da HIV è responsabile della Sindrome da Immunodeficienza Acquisita (AIDS)

70 Adenovirus Membri della famiglia degli Adenoviridae, presenta più di 50 sierotipi Genoma virale di 36 kb di DNA a doppio filamento Infettano cellule post-mitotiche in tessuti altamente differenziati (vie respiratorie ed intestinali, occhi e tratto urinario) Non si integrano, ma vengono mantenuti in forma episomica. Relativamente facile produrli in grandi quantità (titolo elevato) Colpiscono cellule epiteliali (apparati respiratorio e intestinali) Responsabili del 4-5% delle malattie respiratorie diagnosticate clinicamente cam nt (faringite, bronchite, polmonite)

71 Struttura Adenovirus Simmetria icosaedrica Privi di envelope Composti da: 252 capsomeri di cui 240 esoni e 12 pentoni La Fibra è una glicoproteina responsabile dell attacco del virus al recettore della cellula ospite. Fibra Pentone Core Esone DNA

72 Virus come vettori Data la capacità intrinseca di penetrare le cellule, ogni virus può essere potenzialmente usato come veicolo per introdurre geni estranei in cellule bersaglio

73 Principi generali per la costruzione di un vettore virale Packaging Vettore di trasferimento 1. Identificazione delle sequenze necessarie alla replicazione ed alla fase di incapsidazione 2. Rimozione delle sequenze dispensabili 3. Clonaggio del gene di interesse nel vettore di trasferimento 4. I geni necessari alla produzione di virioni sono assemblati in uno o più costrutti, separati dal vettore di trasferimento 5. Il vettore di trasferimento ed i costrutti packaging vengono introdotti nella cellula packaging per la produzione dei virioni ricombinanti

74 Vettori retrovirali difettivi per replicazione Linea cellulare di packaging LTR: trascrizione del genoma virale, poliadenilazione, replicazione, integrazione Psi: sequenza necessaria per il packaging Virus difettivo integrato LTR Psi -Gag Pol Env LTR In grado di sintetizzare le proteine del virus ma non di fare il packaging LTR Plasmide Psi Gag Pol LTR + LTR LTR Virus difettivo integrato Psi - Gag Pol Env LTR Psi Gag Pol LTR + Transgene Transgene Particelle virali ricombinanti

75 La produzione dei vettori adenovirali avviene in cellule l della linea cellulare l HEK293) 293 cell E1A ITR Ψ transgene VA E2B E3 E4 ITR E1B L1 L2 L3 L4 L5 nucleo

76 Classificazione dei Vettori Virali Non Virali Retrovirus Liposomi Lentivirus Lipoplessi Adenovirus Lipidi Lpd cationici-dna catonc Adeno-associati Polimeri cationici-dna Herpes virus DNA plasmidico nudo Poxvirus

77 Caratteristiche ideali del vettore Sicuro (non patogenico) Efficiente i (trasdurre un numero di cellule l elevato) Facile da produrre Raggiungere facilmente il tessuto bersaglio Permettere l espressione per lungo tempo e a livelli appropriati della proteina ricombinante Capace di incorporare DNA di varie dimensioni Non avere componenti che inducono risposta immunitaria

78 Bio-sicurezza dei vettori virali Per essere considerati sicuri i vettori virali devono essere difettivi, ossia mancanti di uno più geni essenziali per la replicazione. Un vettore virale difettivo deve: 1. Trasdurre le cellule l bersaglio e trasportare t il DNA ricombinante (transgene) nel sito cellulare dove può essere espresso 2. Essere incapace di replicarsi e di trasmettersi ad altre cellule o ad altri individui.

79 Principi generali per la generazione di un vettore virale Vettore virale Espressione gene terapeutico citoplasma nucleo Cellula l bersaglio La mancanza della sequenza di packaging nel costrutto per la generazione delle proteine strutturali determina la formazione di un vettore virale contenente soltanto il gene Ricombinante. Il vettore così generato non potrà replicarsi.

80 Vettori Lentivirali Particelle virali ibride difettive per la replicazione costituite i da: 1. Un set minimo di proteine strutturali derivate da HIV 1 2. L envelope di un virus non correlato (VSV or MLV), pseudotipizzazione i i per espandere il tropismo 3. Un genoma contenente: t una cassetta di espressione per il transgene affiancata da sequenze cis regolatorie di HIV 1 non sono presenti geni per l espressione di proteine virali

81 Vettore lentivirale di ultima generazione CMV ψ GAG RRE polya PRO POL RSV REV polya SD SA Costrutti d incapsidazione CMV CMV SD SA VSV-G polya Costrutto codificante il pericapside RSV GA RRE cppt GA Ψ SD SA RRE hpgk egfp Wpre Costrutto di trasferimento SIN (Self-inactivating) Oltre alla delezione di parte dell LTR in 5, si va ad agire sulla regione U3 al 3 LTR nella qu eliminati la TATA box e i siti di legame per i fattori di trascrizione Sp1 e NF-kB. Il DNA prov sintetizzato ha entrambe le LTR inattive.

82 Produzione del vettore lentivirale CMV VSV-G polya CMV Ψ SD SA GAG PRO POL RRE polya SD SA Envelope RSV GA SD RRE GA SA cppt RRE hpgk egfp Wpre Costrutto di trasferimento RSV REV polya Costrutti d incapsidazione Trasfezione transiente Raccolta a 24 e 48 ore Cellule 293T Titolazione per diluizioni seriali Concentrazione per ultracentrifugazione Cellule HeLa

83 Vettori Lentivirali Vantaggi Elevata efficienza i di trasduzione e persistenza di espressione genica stabile Rimozione di quasi tutti i geni virali Svantaggi Difficoltà nel produrli ad un titolo elevato Possono ricombinarsi con eventuale virus wild type nel paziente e generare nuovi agenti infettivi

84 Vettori Adenovirali Infettano cellule post-mitotiche in tessuti altamente differenziati Vettori Ad possono essere preparati ad alto titolo (10 12 infectious units/ml) Cassette di espressione di grosse dimensioni possono essere inserite nei vettori Ad (fino a 36 kb) Gli Adenovirus non integrano nel DNA della cellula ospite.

85 Tipi di vettori adenovirali Di prima generazione(fg-ad) Delezioni delle regioni E1/E3 Vettori RDA (replicant deficient adenovirus) La funzione E1 è fornita dalle cellule 293 Svantaggi Comparsa di vettori RCA (replication competent adenovirus) Bassi livelli di espressione in vivo Alta tossicità ità epatica Limitata durata di espressione

86 Tipi di vettori adenovirali Di seconda generazione Delezioni delle regioni E1 e/o E3 + E2 e/o E4 Vettori RDA Funzioni E2 and E4 complementate in linee cellulari 293 derivate (e.g., g C2) Assenza di replicazione in vivo e perdita di contaminazione RCA Svantaggi Bassi livelli di espressione in vivo Tossicità epatica non ridotta Durata di espressione non migliorata

87 Tipi di vettori adenovirali Helper dependent La produzione di questo tipo di virus utilizza cellule trasfettate stabilmente con E1 ed una ricombinasi chiamata CRE, che è in grado di tagliare il segnale di impacchettamento del virus helper contente tutti i geni virali tranne E1,e che ha la funzione di provvedere alla trascrizione di tutte le proteine del capside del vettore helper dependent. Il virus helper al contrario non può impacchettarsi in quanto mancante del segnale di impacchettamento poiché escisso dalla proteina CRE. Parks R.J. et al.; PNAS. Vol 93. pp Nov. 1996

88 A che categoria appartengono i vettori virali? Virus: entrano nella categoria dei Microorganismi ossia ogni entità microbiologica cellulare o non cellulare capace di replicarsi o di trasferire materiale genetico. Vettori Virali: Microorganismi geneticamente modificati (MOGM): microrganismi m il cui materiale genetico è stato modificato in un modo che non avviene in natura, di solito mediate tecnica del DNA-ricombinate. Nella stessa categoria rientrano le cellule l di packaging. D.Lgs. 626/94 Art. 74 Si definisce "AGENTE BIOLOGICO" qualsiasi microorganismo anche se geneticamente modificato, coltura cellulare ed endoparassita umano che potrebbe provocare infezioni, i i allergie o intossicazioni.

89 Rischio biologico dei vettori virali Il rischio biologico è la possibilità che ha un agente biologico, situato in origine all esterno dell organismo, sia in grado di penetrarvi e provocare danni più o meno gravi sia nei confronti della salute dei lavoratori che della popolazione generale. Vanno prese in considerazione alcune caratteristiche principali specifiche dei microrganismi: Infettività: ità capacità di un microorganismo i di penetrare e moltiplicarsi li i nell ospite Patogenicità: capacità di produrre malattia a seguito di infezione Trasmissibilità: capacità di un microorganismo di essere trasmesso da un soggetto infetto ad un soggetto suscettibile Neutralizzabilità: la disponibilità di efficaci misure profilattiche per p p p prevenire la malattia o terapeutiche per la sua cura

90 Classificazione dei microorganismi infettivi per classidi rischio 1. Un microorganismo che difficilmente è causa di malattia nell uomo e negli animali (nessun rischio o basso rischio collettivo) 2. Un patogeno che può causare malattia nell uomo o negli animali, ma che difficilmente pone un serio pericolo per il personale di laboratorio, la collettività, il bestiame o l ambiente. L esposizione in laboratorio può causare infezione, esistono misure preventive e terapie efficaci ed il rischio di diffusione dell infezione è limitato. 3. Agente con possibilità di diffusione, può causare malattie gravi nell uomo, di norma sono disponibili efficaci misure profilattiche o terapeutiche. 4. Patogeno con elevato rischio di propagazione, può provocare malattie gravi nell uomo, non sono disponibili efficaci misure profilattiche o terapeutiche. LA CLASSIFICAZIONE DEI VETTORI VIRALI IN UNA DELLE CLASSI DI RISCHIO VA ANALIZZATA CASO PER CASO E DIPENDE DAL TIPO DI PROTEINA RICOMBINANTE CHE VIENE ESPRESSA.

91 e misure di precauzione e prevenzione da adottare devon ridurre al minimo i i livelli lli di: Esposizione Individuale Contaminazione ambientale Affinché questo avvenga è necessario mantenere SEMPRE una buona pratica di laboratorio E importante ricevere un training adeguato alla classe E importante ricevere un training adeguato alla classe di protezione in cui si deve operare

92 PRECAUZIONI STANDARDS 1. Conoscenza del vettore che si sta usando 2.Utilizzo del camice 3.Utilizzo dei guanti 4. Conoscenza delle cappe di aspirazione

93 PRECAUZIONI STANDARDS 5. Evitare utilizzo di strumenti o di oggetti taglienti 6. Attenzione nella manipolazione e nel trasporto di campioni biologici 7. Smaltimento appropriato dei rifiuti sanitari speciali (liquidi e solidi) 8. Pulizia e disinfezione ambientale

94 Bio sicurezza vettori lentivirali I vettori di ultima generazione hanno un rischio ridotto di riattivazione da ricombinazione Ridotto rischio di mutagenesi inserzionale Bio sicurezza vettori adenovirali Incapaci di inserirsi nel genoma della cellula ospite Possibile rischio di trasmissione tramite aerosol Ridotta possibilità di formazione di virus ricombinanti competenti per la replicazione

95 Vettori Lentivirali, come ridurre il rischio? Utilizzare i vettori di terza generazione: Più sicuri degli altri vettori. Classe 2. Esprimono proteine virali che non sono patogene Mantenere una buona pratica di laboratorio Pulire e decontaminare a e le superfici di lavoro Autoclavaggio e sterilizzazione chimica sono misure efficaci La maggioranza dei disinfettanti i ti sono sufficienti per eliminarli

96 Vettori Adenovirali, come ridurre il rischio? Utilizzare vettori che hanno dl delezioni importanti. Classe 2 Non contengono geni virali che possono essere patogeni I sistemi di ultimi generazione contengono solo alcuni geni virali Sono resistenti ia molti lidetergenti e stabili a temperatura ambiente. Usare disinfettanti i i più efficaci i 5% Fenolo 05%I 0.5% Ipoclorito di Sodio

97 Nonostante i vettori adenovirali e lentivirali l siano considerati sicuri, i è consigliabile usare SEMPRE tutte le dovute precauzioni per ridurre a zero tutti i possibili rischi.