Organismi modello APPENDICE. Batterio, Escherichia coli. Lievito gemmante, Saccharomyces cerevisiae. Muffa del pane, Neurospora crassa

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1 Orgnismi modello APPENDICE Btterio, Escherichi coli Lievito gemmnte, Scchromyces cerevisie Muff del pne, Neurospor crss Nemtode, Cenorhbditis elegns Arbett comune, Arbidopsis thlin Moscerino dell frutt, Drosophil melnogster Topo domestico, Mus musculus Gli uomini si distinguono dgli ltri orgnismi per le loro cpcità cognitive e per lo stupore nei confronti di ciò che li circond, ed è quest curiosità che ci port studire l vit. Come simo ftti? Come funzionimo? Per comprendere gli uomini e le ltre creture viventi, i ricerctori hnno studito un grnde vrietà di orgnismi viventi. Questi studi hnno portto molte scoperte, comprese lcune incredibili crtteristiche universli condivise d tutti gli esseri viventi. Tutti gli orgnismi usno gli stessi mminocidi, gli stessi nucleotidi e prticmente lo stesso codice genetico. Nell biologi molecolre c è qulcos di più del desiderio di soddisfre l nostr curiosità sul funzionmento dell vit. Cerchimo nche di comprendere le cuse delle mlttie e di pplicre le nostre conoscenze ll medicin, ll gricoltur e ll tecnologi. In questo libro diverse volte bbimo riportto precchi esempi di come bbimo cquisito informzioni sulle mlttie umne, le loro cuse e tlvolt su come ffrontrle, currle o prevenirle. Gli scienziti hnno scoperto gli ntibiotici per curre l mggior prte delle infezioni btteriche, sviluppto vccini per molti tipi d infezioni virli e oggi snno molto di più sul cncro e sono disponibili più terpie. L mggior prte di queste scoperte e progressi deriv dllo studio degli orgnismi modello. Pochi orgnismi costituiscono dei modelli per l comprensione dei processi vitli comuni Gli scienziti studino vri orgnismi. Qundo un specie prticolre viene scelt d molti lbortori per ricerche intense viene definit orgnismo modello. Questo interesse per un specie d prte di molti lbortori permette di ottenere un grnde quntità di informzioni che ci forniscono conoscenze pprofondite sulle funzioni di quell orgnismo vivente. L orgnismo è considerto un modello perché i ricerctori ipotizzno che quello che hnno ppreso su di esso srà vero nche per orgnismi ffini. Lo specifico orgnismo selezionto per uno studio dipende dl problem in esme. In questo libro, bbimo visto il contributo degli orgnismi modello ll nostr conoscenz di biologi molecolre e molti degli orgnismi utilizzti più frequentemente vengono pssti in rssegn in quest Appendice.

2 2 APPENDICE Orgnismi modello Dobbimo osservre, però, che volte, un orgnismo che si trov fuori dl cmmino trccito viene studito solmente d pochi lbortori, semplicemente per curiosità e nche questi studi possono vere un grnde imptto sull ricerc. Per esempio, Thermus quticus ci h fornito l Tq polimersi per l rezione cten dell polimersi (PCR; vedi Cpitolo 7 Come è stto scoperto). Lo studio di Tetrhymen thermophil h portto scoprire gli RNA ctlizztori (come i ribozimi; vedi Cpitolo 16). E gli studi di lcuni virus poco noti degli insetti, i bculovirus, hnno dto origine sistemi di espressione delle proteine ricombinnti oggi mpimente utilizzti (vedi Cpitolo 7). Foclizzre l ttenzione su pochi orgnismi diversi è importnte livello prtico perché ci sono molte più specie che scienziti. In effetti, fre di un orgnismo uno strumento scientifico per l ricerc non è semplice. Sono necessri molti nni di studio per comprendere l orgnismo e cquistre fmilirità con il suo ciclo vitle, l su corrett limentzione, l su crescit ottimle e le condizioni di conservzione. Prticolrmente dispendioso in termini di tempo è lo sviluppo di tecniche genetiche per l mnipolzione del genom dell orgnismo. Non ci sono procedure stndrd per questo; le tecniche genetiche sono per lo più specifiche per quell orgnismo e spesso vengono trovte per tenttivi ed errori. Quest è l rgione per cui è importnte che molti lbortori lvorino sullo stesso orgnismo e condividno le loro conoscenze. Un mss critic d interesse per un orgnismo modello port ll fine congressi internzionli, bnche dti online, e ll formzione di centri di stoccggio che mntengono e distribuiscono i ceppi. Perché fr tutti gli orgnismi esistenti l mondo ne sono stti scelti proprio lcuni? Le scelte sono spesso stte ftte con un buon dose di csulità. Tuttvi, lcune crtteristiche comuni sottolineno l utilità di un orgnismo come modello. Gli orgnismi modello devono vere un ciclo di vit rpido. Devono dr vit un mpi progenie, così che i ricerctori possno trovre e studire eventi genetici rri. Anche l dimensione è importnte, perché gli orgnismi grndi e l loro mpi progenie esurirebbero velocemente lo spzio di un lbortorio. Gli orgnismi modello dovrebbero potersi propgre velocemente usndo un fonte limentre semplice ed economic. Ci dovrebbe essere un modo conveniente per un conservzione lungo termine in modo d poter ccumulre i ceppi per studi successivi. L Tbell A.1 rissume lcune crtteristiche degli orgnismi modello qui descritti. Gli studi di genetic e delle vie metboliche dei primi nni del Novecento utilizzrono orgnismi pluricellulri complessi come le pinte, i moscerini dell frutt, i rtti e i topi. Poi i ricerctori si ccorsero che nche gli orgnismi unicellulri sono idonei per studi fondmentli sui geni e sul metbolismo cellulre. Negli nni Qurnt, microrgnismi come Escherichi coli, il lievito e Neurospor crss sono diventti i modelli più utili per l comprensione dell chimic di bse dell vit. Forniscono nche un mterile di prtenz migliore per i biochimici rispetto i tessuti nimli, perché gli orgnismi unicellulri sono un popolzione di cellule identiche, mentre i tessuti sono costituiti d tipi cellulri diversi. Nessun orgnismo modello può fornire le risposte tutte le domnde sull vit. Gli orgnismi unicellulri continuno dirci molto sugli spetti centrli dei processi fondmentli dell vit, come l repliczione cromosomic, l riprzione del DNA, l ricombinzione, l espressione genic, le vie di trsduzione del segnle e il controllo del ciclo cellulre. M gli orgnismi unicellulri non sono sufficienti per rispondere domnde sullo sviluppo degli orgnismi pluricellulri e sull mggior prte delle mlttie. Per questo vengono molto utilizzti il verme nemtode e il moscerino dell frutt, per scoprire come sono orgnizzti gli orgnismi pluricellulri e per i fondmenti di bse di come è determinto il pino di sviluppo corporeo nimle. Questi orgnismi ci forniscono nche informzioni su molti tipi di mlttie. Allo stesso modo, Arbidopsis thlin è stt scelt come orgnismo modello per lo sviluppo delle pinte. Fr tutti, il modello più utile per lo studio delle mlttie umne è il topo. Questo non è però il più semplice tr gli orgnismi modello. Per fcilità di llevmento e mnipolzione del DNA, il topo cre molte più difficoltà degli ltri orgnismi modello. Ottenere ceppi di topo geneticmente lterti è costoso e lungo. M uno dei grndi vntggi del topo è che il 99% dei suoi geni h degli omologhi nell uomo, e tr questi ci sono nche geni ssociti mlttie umne. Quindi, nonostnte le difficoltà, il topo è un modello interessnte per studire le mlttie che ci colpiscono. In quest Appendice presentimo un breve pnormic dei diversi orgnismi modello oggi in uso, spiegndo nche come hnno contribuito e continuno contribuire ll nostr comprensione dell vit. Come bbimo notto, nche molti ltri orgnismi hnno contribuito significtivmente ll nostr comprensione dei processi viventi, tr cui i btteriofgi e ltri virus, Tetrhymen thermophil (un protozoo), Schizoscchromyces pombe (un lievito che si divide per scissione), Xenopus levis (un rospo), e Brchydnio rerio (pesce zebr). Prim di entrre nei dettgli di prticolri orgnismi modello, descrivimo brevemente lcuni episodi di come, studindo gli orgnismi modello e utilizzndo l genomic e le tecniche di coltur cellulre, bbimo mplito le nostre conoscenze sulle mlttie umne.

3 APPENDICE Orgnismi modello 3 TABELLA A.1 Informzioni principli su sette orgnismi modello comuni E. coli S. cerevisie N. crss C. elegns A. thlin D. melnogster M. musculus Crtteristiche di bse Tipo di orgnismo Btterio unicellulre Eucriote, fungo scomicete unicellulre Hbitt nturle Intestino dell nimle Superficie delle pinte Eucriote, fungo scomicete filmentoso multinucleto Eucriote, verme nemtode Eucriote, pint ngiosperm Vegetzione mort Suolo Clim temperto globle Eucriote, insetto Eucriote, mmmifero Frutt mrci Abitzioni, cmpi Dimensione 1-2 μm 4-6 μm Irregolre 1 mm cm 2,5 mm 17 cm Riproduzione Fissione sessut; volte coniugzione Tempo di generzione Condizioni di crescit Asessut, gemmzione (mitosi); sessut, sporulzione (meiosi) Asessut, formzione di filmenti; sessut, sporulzione 20 minuti minuti 3-4 settimne (per riproduzione sessut) Cpsule Petri o colture liquide Fonte limentre Estrtto di lievito e brodo di triptoni; si possono usre terreni definiti Conservzione Stock congelti in glicerolo; cellule liofilizzte Cpsule Petri o colture liquide Estrtto di lievito, peptone; si possono usre terreni definiti Stock congelti in glicerolo; cellule liofilizzte Cpsule Petri, provette grdute o coltur liquid Mezzi completi o definiti (zuccheri, sli inorgnici, biotin e zoto) Spore congelte-nidre Sessut, uto- e cross-fecondzione; lcuni sessuti Sessut, uto- e cross-fecondzione Sessut, ccoppimento Sessut, ccoppimento 50 ore 6 settimne 12 giorni 9 settimne Cpsule Petri o colture liquide Btteri (E. coli) Cpsule Petri o piccoli vssoi orticoli Luce, cqu, fonte di zoto e ltri minerli (per esempio fertilizznti) Bottiglie o provette Gbbie Lievito e melss, frutt Sostnze vegetli Congelti 80 C Semi Propgzione vitle Embrioni congelti (segue)

4 4 APPENDICE Orgnismi modello TABELLA A.1 Informzioni principli su sette orgnismi modello comuni (continu) E. coli S. cerevisie N. crss C. elegns A. thlin D. melnogster M. musculus Sttistic genetic Dimensione del genom Numero di cromosomi bp bp bp bp bp bp bp 1 (ploide) 16 (ploide); 32 (diploide) 7 (ploide); 14 (diploide) 11 (diploide, mschio), 12 (diploide, ermfrodit) 10 (diploide) 8 (diploide) 40 (diploide) Numero di geni Geni simili ll uomo 8% 30% 6% 25% 18% 50% 99% Nomencltur genic convenzionle Nomencltur proteic convenzionle Sito web del genom dna GCN4 rg fem-3 AAO ry Cdc20 DnA Gcn4 rg FEM-3 AAO RY Cdc org org/nnottion/ genome/ neurospor/ MultiHome.html

5 APPENDICE Orgnismi modello 5 Per studire le mlttie umne si usno tre metodi Che cos determin un infrto, il dibete, le mlttie neurodegenertive o il cncro? Come possono queste o ltre mlttie essere prevenute, trttte o curte? Lo studio degli orgnismi modello è in genere il primo psso per comprendere i processi cellulri che possono essere modificti nelle mlttie umne. Usndo un omologo, possimo studire un mutzione che port un mltti umn in un orgnismo modello e cpire come l mutzione lteri processi molecolri, cellulri o dell orgnismo. Inoltre, i modelli murini sono spesso usti per vlutre pprocci terpeutici per le mlttie, come primo pssggio nello sviluppo di un frmco. Gli orgnismi modello sono spesso il primo psso per l comprensione delle mlttie umne, m l genomic umn e le colture cellulri possono fornire un comprensione ncor più profond. L disponibilità dell sequenz del genom umno complet è stt di enorme iuto si per l comprensione livello molecolre dei geni coinvolti nelle mlttie umne, che per gli studi bioinformtici sull evoluzione umn e sulle migrzioni (vedi Cpitolo 8). Importnti sono stti i progressi nell comprensione dell genetic delle mlttie umne. In prticolre, le persone cercno ttivmente opinioni mediche e scientifiche su un mltti e spesso possono costruire un lbero genelogico fmilire ndndo indietro per generzioni, che può fornire informzioni sull modlità di trsmissione dell mltti. In questo testo vi sono esempi di tutto ciò, come l emofili nell fmigli rele (vedi Figur 2.27), l nemi flciforme (vedi Approfondimento 2.1) e l Alzheimer esordio rpido (vedi Figur 8.11). L identificzione dei geni coinvolti nelle mlttie umne è un compito difficile m importnte e si st relizzndo sempre più velocemente. L conoscenz dell genetic coinvolt nell trsmissione di un mltti può iutre le coppie pinificre le loro fmiglie e d ffrontre le possibili mlttie che possono essere trsmesse i figli o lle figlie. Per i ricerctori, l conoscenz di un gene responsbile di un mltti può iutre sviluppre un trttmento o un cur. Un terzo modo con cui studimo noi stessi è medinte l coltivzione di specifiche cellule umne in vitro. Le cellule primrie, prese direttmente dl corpo e poi cresciute in coltur, muoiono di norm in 40 (o meno) generzioni. M le cellule ottenute dl tessuto tumorle hnno un controllo dell crescit lterto e spesso possono essere ftte crescere per un indefinito numero di generzioni; sono dette, quindi, immortlizzte. A volte le cellule possono essere perfino rimosse dl tessuto normle e poi immortlizzte in coltur medinte l infezione con prticolri virus. Con questi e ltri mezzi, vengono cresciuti e mntenuti in coltur molti tipi diversi di cellule di tessuti umni, tr cui gli eptociti (fegto), le cellule renli (rene), i fibroblsti (pelle), le cellule glili (tessuto nervoso), i linfociti (sngue) e i miociti (muscoli). Anlizzndo le cellule cncerose e gli genti di trsformzione, bbimo nche imprto molto sui geni coinvolti nel cncro (vedi Approfondimento 12.1). Gli studi di colture cellulri di cellule umne e di ltri primti hnno fornito importnti informzioni sui recettori di superficie, sul trffico proteico, sull infezione virle e sull riproduzione cellulre. Le cellule umne possono nche essere ftte crescere in quntità idonee gli studi biochimici (vedi Cpitolo 7). Gli studi recenti nel cmpo dell ricerc sulle cellule stminli sono promettenti per il trttmento di molte mlttie e per lo sviluppo di tessuti sostitutivi (vedi Cpitolo 22).

6 6 APPENDICE Orgnismi modello Btterio, Escherichi coli Escherichi coli è un btterio unicellulre, che risiede normlmente nell intestino nimle e in genere non è dnnoso, nche se esistono rre vrietà tossiche. E coli è piccolo (microscopico), si riproduce Jnice Hney Crr/CDC velocemente per scissione, formndo colonie di cloni sulle pistre di gr, producendo decine di milioni di cellule in un giorno e può crescere nche sui mezzi liquidi, producendo un numero incredibile di cellule figlie, un crtteristic importnte per studi di eventi genetici rri. E. coli h un solo cromosom circolre, e studire i mutnti è molto più fcile in un orgnismo ploide che diploide, perché non ci sono geni dominnti mscherre l mutzione. Fenotipi mutnti comuni sono l resistenz i btteriofgi, l cpcità di crescere su lcune fonti di crbonio, l resistenz gli ntibiotici e l dimensione e form dell coloni. E. coli fornisce nche un ricc e uniforme fonte di mterile di prtenz per studi biochimici. Quindi, lo studio di E. coli combin l forz dell genetic con il potere dell biochimic per comprendere i processi vitli livello molecolre. E. coli non è un eucriote e quindi h poc omologi con gli uomini. Questo limit l su utilità nello studio di tutti i processi trnne di quelli cellulri di bse. Per esempio, E. coli è privo di nucleosomi e nell mggior prte le sue proteine non sono modificte. Le proteine eucriotiche espresse in E. coli trsformto volte non funzionno, perché richiedono modificzioni post-trduzionli che il btterio non riesce compiere. I primi studi con E. coli come orgnismo modello L unione dell biochimic e dell genetic rese E. coli un ricc risors per l scopert di nuove informzioni. Il fmoso test di fluttuzione di Slvdor Luri e Mx Delbruck nel 1943 dimostrò che E. coli mut spontnemente per diventre resistente l btteriovirus e trsmette quest resistenz l fgo ll nuov progenie, rendendo quindi E. coli un sistem modello per comprendere l ntur e l funzione dei geni. L scopert d prte di Joshu Lederberg e Edwrd Ttum che E. coli v incontro un sort di incrocio e crossing over (coniugzione del DNA medit dl plsmide F) rende possibile lo scmbio del DNA e i sggi di complementzione e rende E. coli un vlido modello per l genetic. Nel 1952, Alfred Hershey e Mrth Chse usrono E. coli per dimostrre che il DNA è il mterile genetico del fgo T2 (vedi Cpitolo 2, Come è stto scoperto). Nel 1958, Mtthew Meselson e Frnk Sthl selezionrono E. coli per i loro studi, per dimostrre che l repliczione del DNA vviene con un meccnismo semiconservtivo (vedi Figur 11.1). Nello stesso nno, Arthur Kornberg e i suoi collbortori pubblicrono i risultti sull purificzione e l crtterizzzione dell prim DNA polimersi scopert (vedi Cpitolo 11, Come è stto scoperto). Frncis Crick e Sydney Brenner usrono l genetic di E. coli per stbilire l tripl ntur del codice genetico nel Nel 1966 il codice genetico er stto descritto d Mrshll Nirenberg, Heinrich Mtthei, Gobind Khorn e i loro collbortori, usndo oligonucleotidi sintetici ed estrtti di E. coli (vedi Cpitolo 17). Il lvoro di Frnçois Jcob e Jcques Monod con gli studi dettgliti dell operone lc vev perto un er completmente nuov dell ricerc sull regolzione genic (vedi Cpitolo 20 e Cpitolo 5, Come è stto scoperto). L identificzione di plsmidi in E. coli e delle tecniche per mneggirli ci h portto nell er dell tecnologi del DNA ricombinnte. I plsmidi continuno essere degli strumenti mervigliosi per le biotecnologie, dl vlore ncor incommensurbile (vedi Cpitolo 7). Ciclo vitle Come l mggior prte dei btteri, E. coli si riproduce per scissione binri (Figur A.1). Mn mno che l cellul cresce, percepisce qundo h rggiunto l dimensione giust per inizire l repliczione. I cromosomi duplicti si distribuiscono i poli opposti dell cellul. L citochinesi divide l cellul metà, formndo due cellule figlie, ciscun delle quli contiene un cromosom identico. L intero processo richiede solmente 20 minuti circ 37 C, l tempertur corpore medi dei mmmiferi. Quindi in ppen 24 ore su un pistr Petri contenente un mezzo completo si form un coloni grnde e visibile, con milioni di btteri identici. Grosse quntità di E. coli possono essere cresciute nche in un coltur liquid in un giorno. Tecniche genetiche Per un descrizione complet di molte di queste tecniche vedi Cpitolo 7. Mutgenesi L frequenz di mutzione in E. coli può essere umentt con sostnze chimiche o con l luce UV. Le cellule mutnti possono essere selezionte in bse l fenotipo oppure ricercte medinte pistrtur delle repliche su mezzi di coltur diversi.

7 APPENDICE Orgnismi modello ni positivi (cellule che soprvvivono in condizioni in cui il mutnte non soprvvive) possono poi essere sequenziti per identificre il gene di complementzione. E. coli DNA Il ciclo si ripete Repliczione del DNA Espressione di un protein ricombinnte L crescit ve- loce e non costos di E. coli f di questo orgnismo il veicolo più mpimente usto per l espressione e l purificzione di proteine estrnee. Queste in genere sono espresse d geni posti su plsmidi presenti in un elevto numero di copie. L espressione è indott usndo elementi di regolzione derivnti d promotori ben noti di E. coli e di fgi. Formzione delle cellule figlie E. coli come orgnismo modello i nostri giorni Citochinesi Seprzione dei filmenti di DNA FIGURA A.1 Il ciclo vitle di Escherichi coli. Plsmidi E. coli possiede molti plsmidi nturli che pos- sono portre del DNA estrneo nell cellul. Questi plsmidi sono utili i ricerctori per fr esprimere delle proteine, come vettori nvett, o per costruire e sequenzire grossi genomi. Mcchine multiproteiche Gli studi biochimici e struttur- li stnno oggi descrivendo i dettgli tomici di strutture e processi di trsferimento dell informzione che un tempo erno sconosciuti. Tr questi ci sono l struttur e l funzione dell pprto di repliczione del DNA, delle proteine di riprzione e ricombinzione del DNA, dell regolzione dell RNA polimersi e dell struttur e dell chimic del ribosom. Queste strutture e processi multiproteici si trovno si nei btteri che negli eucrioti, m sono esemplificti nell semplice cellul di E. coli. Studi citologici I processi possono essere visulizzti nel- Introduzione di DNA Medinte trsformzione chimic o con l elettroporzione, E. coli può essere reso in grdo di ccettre del DNA estrneo. Le cellule trsformte con un plsmide contenente un gene per l resistenz ll ntibiotico possono essere selezionte e mntenute ggiungendo l ntibiotico l mezzo di coltur. le cellule viventi di E. coli grzie ll uso di proteine di fusione fluorescenti. Per esempio, studi recenti di questo tipo hnno permesso di rilevre le proteine coinvolte nell repliczione del cromosom e il loro movimento lungo il cromosom durnte l repliczione. Tecnologi del DNA ricombinnte E. coli detiene un po- Knockout genico I plsmidi privi di un origine di replic- zione m contenenti un gene che conferisce resistenz un ntibiotico possono essere selezionti per essere integrti in un cromosom btterico. L integrzione di norm viene ottenut con l ricombinzione omolog, utile per l delezione genic, o knockout. sizione centrle nell tecnologi del DNA ricombinnte. I suoi plsmidi sono mpimente usti come vettori nvett per mplificre e mntenere le librerie di DNA di ltri orgnismi. E. coli è ncor uno dei veicoli più utilizzti per l espressione e l purificzione di proteine estrnee. Biologi dei sistemi Il suo genom piuttosto piccolo f Complementzione Quest tecnic viene spesso utilizz- t per dimostrre che un mutzione si trov in un gene prticolre e consiste nell ggiunt di un gene wild-type che ristbilisc l funzione. L nlisi di complementzione delle cellule mutnti può essere effettut con plsmidi che contengono un copi wild-type del gene d interesse. L nlisi di complementzione di mutzioni sconosciute spesso utilizz un libreri di plsmidi genomici. I clo- di E. coli un sistem interessnte in cui tentre studi di biologi dei sistemi. Sono stti costruiti chip di DNA per esminre l rispost di ogni trscritto in molte condizioni diverse. L funzione di circ il 35% dei geni di E. coli è ncor sconosciut e un rccolt genomic di knockout dei geni di questo btterio st permettendo di ssegnre un funzione questi geni e di identificre nuove reti di interzioni geniche.

8 8 APPENDICE Orgnismi modello Lievito gemmnte, Scchromyces cerevisie Scchromyces cerevisie è un fungo scomicete microbico, usto per secoli dgli uomini per fre il pne, l birr e il vino. Generlmente gli scienziti lo chimno lievito gemmnte, m è detto nche lievito del pne, lievito di bir- Almy r o semplicemente lievito. Il lievito h molte crtteristiche che lo rendono dtto come orgnismo modello. È un orgnismo unicellulre ploide, si riproduce velocemente nei terreni liquidi, form colonie clonli sulle pistre di gr e può essere conservto congelto. Come per E. coli, queste crtteristiche fnno del lievito un eccellente orgnismo modello per studire l genetic e l biochimic di processi vitli fondmentli, come l repliczione, l trscrizione e l trduzione. Però, differenz di E. coli, il lievito è un eucriote dotto di tutti gli orgnelli intrcellulri, come i mitocondri e il nucleo, h il DNA compttto nell cromtin e un struttur citoscheletric. Quindi S. cerevisie è un modello dtto per studire meccnismi unici degli eucrioti, come il controllo del ciclo cellulre, l regolzione delle proteine medinte fosforilzione, l struttur cromosomic e l funzione mitocondrile. Il genom di S. cerevisie è lungo solmente 12 Mbp e contiene circ 6000 geni. Contiene nche omologhi di molti geni umni responsbili di mlttie e questo lo rende un modello per l comprensione delle funzioni di bse dei prodotti genici coinvolti in lcune mlttie; inoltre questi omologhi indicno come lcune mlttie umne derivino dll distruzione di processi vitli piuttosto semplici e fondmentli. Però, il lievito unicellulre non serve come modello di sviluppo e le molte mlttie umne che derivno d mutzioni che provocno difetti dello sviluppo non possono essere studite nel lievito, limitndone l utilità nell ricerc medic. L ntur ploide del lievito rende possibili lcuni utili studi di mutzione. Il lievito viene nche fcilmente trsformto con il DNA esogeno. Il DNA si integr frequentemente nel cromosom per ricombinzione omolog, rendendo possibile l costruzione di ceppi knockout per un gene specifico. L fcilità dell genetic, unit ll fcilità di crescit, f di S. cerevisie, come di E. coli, un orgnismo modello che combin perfettmente gli studi genetici con quelli biochimici. I primi studi con il lievito come orgnismo modello Il lievito è stto un orgnismo modello per più di cento nni e, di ftto, h dto origine ll biochimic modern. Louis Psteur dimostrò che il lievito ferment lo zucchero d lcool e CO 2, e stbilì che l fermentzione è un forz vitle che non può essere seprt dgli orgnismi viventi. Nel 1897, Edurd Buchner notò csulmente che un estrtto di cellule di lievito fermentv e chimò l sostnz fermentnte zimsi. Studi successivi dimostrrono che l zimsi er di ftto un miscel di molti enzimi differenti. Il suffisso si è usto per molti nomi di enzimi nche oggi. Ciclo vitle Il lievito gemmnte può esistere si llo stto ploide che diploide (Figur A.2). Entrmbe le cellule ploidi e diploidi si possono riprodurre sessulmente per gemmzione. Il sesso in S. cerevisie è determinto di prodotti del gene del locus del tipo sessule (MAT), per il qule esistono due lleli, e (vedi Figur 13.22). Aploidi di tipi sessuli diversi possono essere incrociti per formre dei diploidi pistrndoli insieme. Il lievito diploide / può essere convertito llo stto ploide in terreni che lo inducono sporulre, ndndo incontro meiosi per produrre quttro spore ploidi contenute in un sco. L tetrde di spore può essere disseziont con un micromnipoltore e ciscun fenotipo ploide può essere nlizzto dopo che le spore sono cresciute formndo delle colonie. Tecniche genetiche Mutgenesi Gli studi mutzionli in S. cerevisie sono semplificti dll su cpcità di crescere come ploide. Il lievito può essere replicto su pistr per studire i fenotipi mutnti per l cpcità di crescere su fonti di crbonio differenti e per cercre l presenz di geni letli condizionli (per esempio geni che, se mutti, permettono ll orgnismo di crescere solmente prticolri temperture). Complementzione Il lievito ploide può essere incrocito per produrre cellule diploidi per l nlisi di complementzione dei mutnti ploidi. Le mutzioni nei geni essenzili possono essere mntenute portndoli llo stto diploide. Qundo un diploide con un mutzione in un gene essenzile v incontro sporulzione, due delle quttro spore non srnno vitli. L isolmento di tutti e quttro i prodotti dell meiosi in un sco è utile per l nlisi dell ricombinzione durnte l meiosi. Introduzione del DNA Il DNA può essere introdotto in S. cerevisie per brsione chimic o fisic dell spess prete cellulre. Il DNA linere, con un mrctore selezionbile ed estremità omologhe l cromosom, s integr f-

9 APPENDICE Orgnismi modello 9 Tetrde di spore Asco di S. cerevisie FIGURA A.2 Il ciclo vitle di Scchromyces cerevisie. Sporulzione (meiosi) Gemmzione ploide (mitosi) Gemmzione ploide (mitosi) / / / Gemmzione diploide (mitosi) / / cilmente nel genom per ricombinzione omolog. Quest configurzione può portre le estremità ricombinre con le sequenze loro omologhe nel cromosom di lievito, sostituendo il gene d interesse con un mrctore selezionbile e distruggendo il gene. Mrctori selezionbili L selezione nel lievito è effettut principlmente con gli uxotrofi, ceppi che sono privi di un gene che codific un enzim di un vi dell biosintesi degli mminocidi e quindi richiedono quell mminocido per crescere. Le cellule vengono ftte crescere in mezzi definiti privi di quell mminocido or essenzile. Solmente le cellule che hnno cquisito il mrctore e quindi sono in grdo di sintetizzre l mminocido prtire d mterile grezzo soprvvivernno. Per l selezione possono nche essere usti mrctori di resistenz i frmci. Plsmidi Il DNA può nche essere mntenuto nel lievito come plsmide circolre, usndo un fr le tnte origini cromosomiche note come ARS (utonomously replicting sequence, sequenz di repliczione utonom). Gli YAC (yest rtificil chromosome, cromosomi rtificili di lievito) possono mntenere inserti molto grndi (d 300 kbp 1 Mbp), e questo è utile nei progetti di sequenzimento Incrocio del genom (vedi Figur 7.7). Inoltre, S. cerevisie è dotto di un plsmide nturle di 2 m che può essere usto per mntenere nell cellul il DNA esogeno. Il lievito come orgnismo modello i nostri giorni Meccnismi fondmentli di trsmissione dell informzione L struttur semplice e unicellulre, l cpcità di crescere in grndi quntità per studi biochimici e l fcilità dell mnipolzione genetic, tutto ciò rende il lievito idele per lo studio di meccnismi dettgliti dei processi fondmentli, quli l repliczione, l regolzione genic, l riprzione del DNA, l trscrizione, l trduzione e l ricombinzione. Il ciclo di divisione cellulre Qundo il lievito si divide, l gemm è visibile l microscopio così come i cmbimenti di form nelle diverse fsi del ciclo cellulre. L ccumulo di cellule mutte, bloccte nell fse gemmnte, è stto usto come fenotipo trmite il qule identificre diversi mutnti del ciclo cellulre (cdc), utili per l dissezione genetic e biochimic del ciclo cellulre. Gli uomini hnno omologhi di molti dei geni del ciclo cellulre scoperti nel lievito. Le vie di trsduzione del segnle Il lievito è un modello per lo studio delle vie di trsduzione del segnle, come quelle coinvolte nelle risposte di ccoppimento i feromoni prodotti d cellule di tipi sessuli opposti. Ricombinzione meiotic Dto che S. cerevisie produce un sco con quttro spore derivnti d un sol cellul, i ricerctori possono seguire gli eventi che vvengono durnte l meiosi. Questo h portto modelli molecolri dettgliti dell ricombinzione meiotic. Biologi dei sistemi Uno degli scopi dell biologi dei sistemi consiste nel comprendere l mggior prte delle interzioni genetiche, fisiche e molecolri dei 6000 geni di lievito. Allo stesso modo lo studio delle interzioni genetiche tr i knockout di questi geni st portndo ll scopert di nuove vie. Gli pprocci proteomici sono stti usti per le prime volte nel lievito. È stto determinto il numero delle copie intrcellulri di qusi tutte le proteine di lievito su tutto il genom. Sono stte determinte nche le interzioni protein-protein e protein-rna livello globle, usndo le tecniche del doppio ibrido e del triplo ibrido (vedi Cpitolo 7) e l spettrometri di mss dei complessi proteici. Gli studi di biologi cellulre sono fcilitti d un libreri di mrctori proteici fluorescenti posti, nel genom di lievito, in ogni cornice di lettur pert. Inoltre, il lievito è usto come sistem di espressione proteic per lo studio di geni esogeni.

10 10 APPENDICE Orgnismi modello Muff del pne, Neurospor crss L muff del pne, Neurospor crss, è un fungo scomicete filmentoso. È stto uno dei primi microrgnismi eucriotici utilizzto per studi genetici. All incirc il 75% di tutti i funghi è scomiceto; l restnte Woodfll Wild Imges/Photoshot prte è dt di bsidiomiceti (funghi). Circ il 90% degli scomiceti è filmentoso (ovvero multinucleto, come spiegto meglio di seguito), mentre il resto è costituito d lieviti unicellulri. Il genom di N. crss (spesso detto semplicemente Neurospor) è dto d circ 43 Mbp e geni, prgonbile l moscerino dell frutt per complessità genomic. L lott tr funghi filmentosi e btteri h prodotto importnti ntibiotici, inclus l penicillin. Queste molecole orgniche complesse non si trovno d nessun ltr prte in ntur e, in ccordo con ciò, più del 40% dei geni di Neurospor non h un controprte simile in nessun ltro orgnismo studito. L nicchi ecologic occupt di funghi filmentosi comprende molti tipi di mterili biologici in decomposizione. Questo può spiegre perché Neurospor può crescere su fonti di crbonio e zoto insolite, il che probbilmente si riflette nell presenz di ltri geni insoliti. Un crtteristic unic di Neurospor è l disposizione delle spore prodotte dll meiosi di un solo nucleo diploide nell pposito involucro (sco). Le spore sono disposte linermente nell ordine in cui sono stte prodotte con le divisioni meiotiche. Con l possibilità di seprre le spore precismente e di studirle singolrmente, i ricerctori hnno un modello idele per l nlisi dell ricombinzione meiotic. Neurospor è interessnte nche per lo studio di numerosi meccnismi di silenzimento genico, lcuni dei quli esistono nche negli eucrioti pluricellulri. I primi studi con Neurospor come orgnismo modello All inizio Neurospor è stto un modello importnte per il suo stto ploide, l su crescit veloce, l produzione di milioni di spore per coloni e l fcilità di coltur su terreni semplici e definiti. Negli nni Qurnt, l cpcità di sintetizzre tutte le biomolecole essenzili prtire d terreni di coltur dll composizione not h velocemente portto Neurospor ll riblt, come modello idele in cui studire l genetic delle vie metboliche conservte in tutte le cellule. Un importnte not storic è stto l uso di Neurospor d prte di George Bedle e Edwrd Ttum negli studi che hnno portto ll ipotesi un gene-un polipeptide. Questo lvoro h dto l vvio un nuov er dell genetic molecolre e ll uso dei microrgnismi in studi di genetic (vedi Figur 2.23). Ciclo vitle Il ciclo vitle sessuto di Neurospor inizi con le spore ploidi rilscite di microconidi e di mcroconidi (Figur A.3, in lto). Qundo l spor ploide germin, dll estremo in crescit si llung un proiezione tubolre che port ll formzione di un micelio, contenente le ife rmificte. L crescit vviene medinte l repliczione e divisione dei nuclei ploidi e non è ccompgnt dll formzione di setti cellulri. L crescit è veloce, fino 10 cm in un solo giorno. Sulle pistre Petri, l rete comptt di filmenti produce un coloni. Di ftto quest rete di ife in un coloni è essenzilmente un sol grnde cellul continu, con molti nuclei ploidi. L coloni ploide sporul formndo i scchi dei conidi e un coloni può produrre milioni di spore. Due diversi lleli del gene del tipo sessule, MATA e MAT, controllno il ciclo sessule di Neurospor. Le spore contengono l llele MATA o MAT e il conttto tr le colonie dei diversi tipi sessuli port ll fusione dell prete cellulre seguit dll fusione dei nuclei ploidi. I nuclei diploidi ottenuti vnno velocemente incontro divisioni meiotiche e ogni nucleo diploide produce quttro spore ploidi in un sco (Figur A.3, in bsso). Le spore ploidi vnno incontro un ltr divisione mitotic, producendo otto spore disposte secondo l loro origine cellulre, e s impilno in fil ll interno di un sco lungo e sottile. Più schi sono contenuti in un struttur dett peritecio. Ogni spor nel peritecio è ploide e può formre un ltr coloni di Neurospor. Ci vogliono circ 3-4 settimne per pssre d spor, if ploide, nuclei diploidi, e per tornre indietro ll produzione di spore. Tecniche genetiche Mutgenesi Neurospor può essere mutgenizzt trttndo le spore con rdizioni ionizznti. Le spore irrdite vengono ftte germinre in un terreno completo e lscite sporulre, producendo un grnde quntità di spore. Le spore possono essere poi nlizzte per l presenz di mutzioni. Introduzione del DNA Neurospor ssume fcilmente il DNA del plsmide esogeno grzie l meccnismo di trsformzione. Il DNA deve integrrsi nel genom per poter essere ereditto stbilmente. L ntibiotico igromicin può

11 APPENDICE Orgnismi modello 11 Asessuto (ploide) Micelio Mcroconidi (multinucleti) e microconidi (uninucleti) Dispersione Knockout genico Il modo per produrre uno specifico knockout in Neurospor è insolito. Con un processo qunto pre specifico di questo orgnismo, un cellul con un gene duplicto, qundo viene incrocit v incontro un processo detto RIP (repet-induced point muttion; mutzione puntiforme indott dll ripetizione). L RIP vviene nei nuclei ploidi delle cellule premitotiche; il DNA ripetuto viene cercto e distrutto medinte l introduzione di trnsizioni d GC AT, su entrmbe le copie del gene duplicto. Questo processo port di ftto un ceppo knockout. Sporulzione Non ppen i cromosomi di Neurospor segregno durnte l meiosi, le cellule figlie si dispongono linermente su un sse lungo. L frequenz di crossing over può essere ust per mppre l distnz di un locus llelico mutnte dl centromero. Sessuto (diploide) Il conttto tr colonie MATA e MATα produce cellule diploidi 2n Meiosi 1 Meiosi 2 Sviluppo dell sco Mitosi Germinzione n A A A A Singolo sco con 8 spore ploidi Peritecio con più schi FIGURA A.3 Il ciclo vitle di Neurospor crss. [Fonte: (Micelio) d Neurospor: Contributions of Model Orgnism by Rolnd Dvis Oxford University Press, Inc. Fotogrfi per gentile concessione di Mtthew L. Springer, University of Cliforni, Sn Frncisco. (Germinzione) M. G. Roc et l., Eukryot. Cell 4: , (Asco singolo) Per gentile concessione di Nmboori B. Rju, Stnford University. (Peritecio) Per gentile concessione di Louise Glss.] essere usto per selezionre l Neurospor con un trnsgene. A differenz del lievito, l inserzione del DNA in Neurospor vviene rrmente per ricombinzione omolog; l inserzione è più spesso csule e senz lcun bersglio. Neurospor come orgnismo modello i nostri giorni Ricombinzione meiotic Come bbimo visto, Neurospor, prtire d un solo evento meiotico, impcchett le proprie spore con un disposizione (nell sco) che rispecchi l ordine di segregzione cromosomic durnte l meiosi. Quest crtteristic rende Neurospor un sistem interessnte per gli studi di ricombinzione d crossing over durnte l meiosi. Ritmi circdini Neurospor segue un ritmo circdino giornliero nell formzione delle spore dei conidi. Queste sono visibili occhio nudo e, quindi, il fenotipo di un comportmento ritmico può essere studito nelle pistre Petri o in tubi grduti, lunghe provette in cui si può misurre l crescit rpid delle ife. Perché esist questo ritmo in Neurospor non è chiro, m è un modello utile per l comprensione delle bsi molecolri del comportmento ritmico. Meccnismi di silenzimento Neurospor è dott di lmeno tre meccnismi di silenzimento diversi, che probbilmente si sono evoluti come difese genomiche contro il DNA invsore, come i trsposoni e i virus. Il silenzimento meiotico è un processo trmite il qule un gene non ppito, rilevto durnte l meiosi, viene silenzito. L inibizione dett quelling vviene nelle cellule ploidi e rivel le sequenze duplicte. L RIP rivel le sequenze duplicte subito prim dell meiosi, mutndo d GC d AT entrmbe le copie dell sequenz duplict. Il silenzimento meiotico e l RIP sembrno essere meccnismi specifici di Neurospor, mentre il quelling sembr essere correlto ll interferenz d RNA.

12 12 APPENDICE Orgnismi modello Nemtode, Cenorhbditis elegns Per gentile concessione di Wormtls ( I piccoli microrgnismi unicellulri, come E. coli e il lievito, sono modelli di incredibile successo per lo studio livello cellulre dell chimic fondmentle dei processi vitli, m per studire l complessità dello sviluppo e del sistem nervoso servono modelli pluricellulri. Nel 1960, Sideny Brenner si rese conto che er il momento di porsi delle domnde sul sistem nervoso e su come un orgnismo pluricellulre si formi prtire d un sol cellul. Brenner decise di usre come modello per studire questi rgomenti un verme nemtode, un piccolo metzoo trslucido. Cenhorbditis elegns è un membro dell fmigli Rhbditide dei nemtodi, m, differenz di ltri membri dell fmigli, non è ptogeno o prssit di ltri nimli. C. elegns è un buon scelt come modello di sviluppo nimle perché cresce velocemente e, in funzione dell tempertur, si può sviluppre d uovo d dulto sessulmente mturo in 2 1 / / 2 giorni. I vermi sono fcili d crescere su pistre di gr con E. coli come fonte di nutrimento, e possono perfino essere congelti per un conservzione lungo termine. Gli ermfroditi di C. elegns si possono utofecondre, un crtteristic che permette di ottenere velocemente mutnti omozigoti prtire d un popolzione di vermi mutgenizzti. I mschi, che si formno in piccol percentule, possono ccoppirsi con gli ermfroditi, formndo dei ceppi con nuove combinzioni di mutnti, un spetto essenzile di qulunque orgnismo modello genetico. Inoltre, C. elegns è trsprente, e questo permette di vedere ogni cellul durnte lo sviluppo. Anche se l ermfrodit contiene solmente 959 cellule somtiche, il nemtode è molto complesso ed è dotto di un sistem nervoso, di muscoli, di sistemi digestivi e riproduttivi e mostr un serie di comportmenti utili per gli studi di genetic neurologic. Ciscun verme produce centini di discendenti, permettendo l ricerc di mutnti per tutti i tipi di cmbimenti morfologici e comportmentli. I primi studi con C. elegns come orgnismo modello Per porre le fondment degli studi sullo sviluppo di un orgnismo pluricellulre, Brenner e ltri hnno mppto l posizione di tutte le 959 cellule presenti nel verme ermfrodit, ricostruendo immgini trtte d fettine di tessuto. Durnte lo sviluppo, ciscun cellul migrtori si muove verso un posizione precis nell nimle. Ulteriori studi hnno portto i ricerctori scoprire che circ il 12% delle cellule muore sempre durnte lo sviluppo e che l morte cellulre è progrmmt geneticmente. Oggi sppimo che l morte cellulre progrmmt è importnte per lo sviluppo di orgnismi superiori, tr cui l uomo, e che difetti in questo processo possono portre llo sviluppo del cncro. Uno dei primi esempi di C. elegns come modello di sviluppo è dto dgli studi sull vulv. Lo sviluppo di questo orgno di 22 cellule è stto studito intensmente, perché le sue singole cellule sono fcilmente visibili l microscopio. Le ricerche per identificre i difetti nello sviluppo dell vulv sfruttno il ftto che le uov fecondte nell utero devono essere deposte nell vulv per poi schiudersi l di fuori del corpo. Se l vulv h difetti di sviluppo, le uov non possono essere depositte e si schiudono ll interno. Il microscopio evidenzi molti vermi interni ll mdre ( volte si prl di un scco di vermi ). Utilizzndo questo evidente fenotipo mutto, i ricerctori hnno identificto molti geni che controllno lo sviluppo dell vulv, tr cui geni pprtenenti un vi di fosforilzione conservt che controll l crescit cellulre. Gli omologhi di lcuni di questi geni nei mmmiferi codificno soppressori tumorli e oncogeni. L morte cellulre progrmmt nello sviluppo di C. elegns port ll morte di un delle due cellule dell progenie che derivno dll divisione cellulre durnte diversi stdi di sviluppo. Questo meccnismo è essenzile in diversi stdi dello sviluppo ffinché l progenie cellulre soprvvissut si sviluppi correttmente. In C. elegns ci sono numerosi esempi di morte cellulre progrmmt, molti dei quli vvengono durnte lo sviluppo del sistem nervoso. L morte cellulre progrmmt è importnte nche nello sviluppo embrionle umno, come, per esempio, nell rimozione di tessuto tr le dit. Ciclo vitle In C. elegns ci sono due sessi, ermfrodit e mschio. Gli ermfroditi sono dotti di due copie del cromosom X. Un piccol percentule di cellule germinli dell ermfrodit (dllo 0,05% ll 1,0%) v incontro un nondisgiunzione dei cromosomi X durnte l meiosi, formndo dei gmeti detti gmeti X-nulli, e quindi un progenie (mschile) X0. Gli ermfroditi sono molti di più dei mschi e quindi l mggior prte dell progenie è prodott per utofecondzione, l qule in genere dà origine uov fecondte che vnno incontro un ciclo vitle più stdi (Figur A.4). Dopo l embriogenesi, che richiede circ 12 ore 25 C, le uov si schiudono, producendo delle lrve lunghe 80 mm. L lrv inizile contiene 558 cellule. Lo sviluppo procede ttrverso quttro stdi lrvli (d L1 L4) seprti d mute. L mut finle port vermi dulti sessulmente mturi. L intero processo

13 APPENDICE Orgnismi modello 13 Adulto Uovo 25 C Duer L1 (12 h) di inserimento csule di un trsposone. L integrzione del DNA in un gene d interesse può essere cerct medinte PCR usndo un primer interno l trsposone e un ltro primer che ibrid con il gene in esme. Interferenz d RNA L interferenz d RNA, originrimente scopert nel nemtode, può essere ust per silenzire l funzione di un gene introducendo RNA doppio filmento omologo l gene in esme (vedi Cpitolo 22). L4 (9 h) L2 (7 h) C. elegns come orgnismo modello i nostri giorni richiede circ 52 ore 25 C. Gli dulti vivono pprossimtivmente 15 giorni. In condizioni di stress, le lrve L2 possono entrre in un fse dormiente, l lrv duer che può soprvvivere per diversi mesi, spettndo che le condizioni migliorino. Tecniche genetiche L3 (7 h) FIGURA A.4 Il ciclo vitle di Cenorhbditis elegns. [Fonte: (Uovo) Center for Cell Dynmics. (L1-L4 e Duer) ristmpto per gentile concessione di Wormtls ( (Adulto) Per gentile concessione di In Chin-Sng, PhD, Queen s University, Kingston, Ontrio.] Mutgenesi I vermi possono essere mutgenizzti con trttmenti chimici o irrdizioni. I vermi mutnti possono essere osservti direttmente l microscopio, per cercre l presenz di lterzioni fenotipiche che determinno un comportmento o uno sviluppo berrnte, l incpcità di lcune cellule di ndre incontro morte cellulre progrmmt, un spetttiv di vit modifict, l incpcità delle lrve di entrre nello stdio duer. Autofecondzione e fecondzione incrocit L utofecondzione port d un solo ermfrodit circ 300 discendenti e permette di ottenere velocemente, prtire d singoli vermi mutnti, lleli mutnti recessivi. Anche se i mschi vengono prodotti solo rrmente, questi forniscono un opportunità di produrre nuovi ceppi genetici incrocindoli con un ermfrodit. Introduzione di DNA Negli studi di trsformzione, del DNA ricombinnte linere viene iniettto direttmente nell gonde prim che si formino le uov. Rri eventi d integrzione portno ereditre stbilmente più trnsgeni. Rrmente si h un integrzione per ricombinzione omolog. Knockout genico L distruzione per mezzo di un trsposone sopprime l funzione di un gene. Negli orgnismi dotti di trsposoni ttivi, le mutzioni insorgono per eventi Vie di trsduzione del segnle L morte cellulre progrmmt e lo sviluppo dell vulv utilizzno vie di trsduzione del segnle che sono utili modelli per le vie di segnlzione umne. Gli studi eseguiti sullo sviluppo di C. elegns continuno rivelre crtteristiche importnti di questi processi. Mlttie umne C. elegns h molti geni omologhi geni umni responsbili di mlttie, compresi quelli che pprtengono ll vi del segnle dell insulin, così come i geni coinvolti nelle mlttie crdiche, renli e neurologiche. Lo studio di questi geni dovrebbe portre comprendere le bsi delle mlttie umne. Invecchimento Gli studi genetici dell lrv duer hnno portto identificre un serie di geni che, qundo vengono ttivti nell dulto, umentno significtivmente l durt dell vit del verme. L presenz di omologhi di questi geni in ltri nimli h ovvie impliczioni nello studio dell invecchimento. Controllo dell espressione genic bsto sull RNA Gli studi sull interferenz d RNA (scoperti per l prim volt nel nemtode) hnno portto identificre dei mirna coinvolti nell espressione genic. Inftti, è noto che i mirna possono regolre l espressione genic si nelle pinte che negli nimli. Neurosviluppo Il sistem nervoso di C. elegns rppresent l orgno più grosso dell nimle e comprende più di un terzo delle sue cellule (302 neuroni e 56 cellule glili). A differenz delle connessioni neuronli dei vertebrti, ltmente rmificte, l connettività dei neuroni in C. elegns è piuttosto semplice, con circ 5000 sinpsi e 2000 giunzioni neuromuscolri. Le nomlie comportmentli sono fcili d osservre e possono essere mppte con precisione su specifiche reti neuronli. L conoscenz dell connettività neuronle complet permette i ricerctori di studire come viene guidt l crescit dell ssone e come si formno le sinpsi. Inoltre, C. elegns h molte clssi di neuroni differenti che permettono studi genetici sul differenzimento neuronle.

14 14 APPENDICE Orgnismi modello Arbett comune, Arbidopsis thlin Pistillo (crpelli) Stigm Stilo Anter Petli Sepli (Whorl 1) Petli (Whorl 2) Stmi (Whorl 3) Crpelli (Whorl 4) FIGURA A.5 Antomi del perigonio del fiore di Arbidopsis thlin. [Fonte: Per gentile concessione del Prof. Dr. Sbine Zchgo.] Arbidopsis thlin è un ngiosperm, un dicotiledone dell fmigli dell senpe (Brssiccee) che comprende i più fmiliri broccoli, cvolo e rpnello. Arbidopsis è considert generlmente un erbcci e non h importnz economic, m le sue crtteristiche l rendono specile come modello spe- Nigel Cttlin/Almy rimentle. Arbidospis è piuttosto piccol; pertnto possono essere ftte crescere molte pinte in uno spzio ristretto. H un ciclo vitle breve, circ 5-6 settimne dl seme l fiore e ogni pint è cpce di utoimpollinzione, producendo miglii di semi per mpi studi di mpptur genetic. Inoltre, il genom di Arbidopsis h un dimensione di meno del 5% del genom del mis (2500 Mbp) e di meno dell 1% di quello del grno ( Mbp). Molti lbortori nel mondo studino Arbidospis e molti centri di stoccggio pubblici conservno scorte di semi di linee mutnti e vrinti nturli di Arbidopsis dette ecotipi, così come risorse genomiche. Arbidopsis rppresent un modello per quel che rigurd fisiologi, sviluppo, genetic e struttur di tutte le pinte. È nche un modello di come le pinte intergiscono con l mbiente e di come percepiscono l lunghezz del giorno, il freddo, l ridità e l presenz di sle e di come rispondono i ptogeni. Potremmo spettrci che ci sino molte differenze tr le pinte e gli nimli nell genetic dei progrmmi di sviluppo. Però gli studi sullo sviluppo dell coron (whorl) del fiore mostrno uno stretto collegmento con gli nimli. L coron del fiore è formt d quttro nelli concentrici (Figur A.5). L nello esterno (whorl 1) è costituito d quttro sepli; il whorl 2 d quttro petli, il 3 d sei ntere e quello interno d due crpelli che si fondono, formndo il pistillo. Lo studio delle pinte con mutzioni omeotiche h mostrto un lterzione nell identità dei whorl. Per esempio, in un mutnte, i crpelli si ritrovno nel whorl 1 l posto dei sepli. Questo comportmento genetico ricord le mutzioni nei geni omeotici in Drosophil, in cui gli rti si estendono d segmenti del corpo scorretti. Inoltre, come in Drosophil, i geni omeotici di Arbidopsis codificno fttori di trscrizione che giscono trmite l formzione di grdienti di concentrzione nell embrione in vi di sviluppo (vedi Cpitolo 22). I primi studi con Arbidopsis come orgnismo modello Arbidopsis è stto ggiunto piuttosto di recente l gruppo di orgnismi modello, ed è diventto un modello ffermto solmente negli nni Ottnt. Nel 1907, Friedrich Libch h identificto il numero di cromosomi di Arbidopsis e nel 1940 h proposto di usre quest pint come orgnismo modello. Con l iuto di Albert Krnz, Libch h rccolto e orgnizzto molti ecotipi, che hnno contribuito ll collezione ttule di 750 ceppi di Arbidopsis. Il nscere di un comunità scientific dedit ll ricerc su Arbidopsis divenne chiro con l pubbliczione di un bollettino nei primi nni Sessnt, e con l prim Conferenz Internzionle su Arbidopsis tenutsi nel Negli nni Ottnt, Arbidopsis er uno tr i numerosi modelli vegetli tr i quli er nche compreso il mis, un modello genetico ben consolidto. Con lo sviluppo dell trsformzione medit dl T-DNA (vedi più vnti) nel 1986, Arbidopsis è diventto velocemente il modello principle per l ricerc vegetle. Ciclo vitle Arbidopsis h un ciclo vitle comune delle pinte (Figur A.6). Come in molte ngiosperme, si le cellule germinli mschili che quelle femminili risiedono nello stesso fiore e l utofecondzione (utoimpollinzione) vviene fcilmente. Le pinte possono ndre incontro nche un fecondzione incrocit (impollinzione incrocit). Ciscun pint produce molti fiori che insieme possono produrre più di semi. Il ciclo vitle completo, dll germinzione del seme l nuovo rccolto di semi, richiede d 5 6 settimne, con lo sviluppo di rdici, foglie, fiori, e ll fine i semi.

15 APPENDICE Orgnismi modello 15 Giorno 45 Sviluppo del seme e senescenz Giorno 40 Giorno 30 Infiorescenz Giorno 23 Gemm il primo fiore Tecniche genetiche Giorno 0 Seme Giorno 1 Germinzione Giorno 11 Giorno 2 Comprs dell ipocotile e dei cotiledoni Giorno 3 Sviluppo dell rdice Giorno 7 Sviluppo dell fogli FIGURA A.6 Il ciclo vitle di Arbidopsis thlin. [Fonte: C. Dougls et l., Plnt Cell 13: , Copyright 2001, Americn Society of Plnt Biologists.] Mutgenesi Le pinte possono essere mutgenizzte trttndo i semi con rdizioni ionizznti o mutgeni chimici. Le pinte che sono omozigoti recessivi per i geni mutti possono essere fcilmente ottenute con l utofecondzione. Complementzione Arbidopsis fiorit può essere utofecondt o incrocit con ltre pinte con tecniche simili quelle uste d Gregor Mendel, in cui le ntere vengono tglite, permettendo quindi il controllo dell impollinzione e l incrocio genetico (vedi Cpitolo 2). Introduzione del DNA L trsformzione con il DNA ricombinnte è medit dl T-DNA (DNA di trsferimento) di Agrobcterium tumefciens, che normlmente s inserisce nei cromosomi in modo csule. A. tumefciens è un btterio grm-negtivo che cus tumori nelle pinte. Contiene un plsmide di 200 kbp che induce il tumore (Ti), il qule include geni che fcilitno il trsferimento replictivo del DNA in un cellul vegetle. Un volt introdotto nell cellul vegetle, il plsmide integr un prticolre segmento del suo DNA, il T-DNA, nel genom dell pint. Qundo nel T-DNA si trov del DNA ricombinnte, nche questo viene inserito nel genom. Knockout genico L ricombinzione omolog di DNA trnsgenico, determinndo un knockout genico, vviene solo rrmente nelle pinte e normlmente non viene ust negli studi dei vegetli. Però sono disponibili vste collezioni di mutnti di Arbidopsis sequenziti e nei centri di stoccggio è possibile ordinre inserzioni specifiche in singoli geni. Interferenz d RNA Un funzione genic in Arbidopsis può essere elimint con efficci utilizzndo l RNAi (vedi Cpitolo 22). Arbidopsis come orgnismo modello i nostri giorni Evoluzione dell pint I qusi 750 differenti ceppi di Arbidopsis sono molto diversi per sviluppo e form (per esempio per l form dell fogli, il tempo di fioritur, l setosità e l resistenz lle mlttie) e sono stti usti per spiegre l evoluzione delle crtteristiche e le risposte dell pint ll mbiente. Sensibilità ll luce Le pinte hnno molte risposte diverso ll luce e Arbidopsis è un modello genetico per lcune di queste. Un tipic rispost è quell di pssre dll produzione di foglie quell di fiori. Arbidopsis fiorisce qundo l lunghezz del giorno ument ed è un modello per l sensibilità ll luce del giorno. Inoltre, un ridott luce nel periodo di germinzione dei semi port un crescit ltert cus di un modificzione di sviluppo progrmmt che port piccole pinte con un sistem rdicle ridotto. Arbidopsis è stt ust come modello per comprendere l genetic che controll come l luce influenzi questo sviluppo precoce. Un ltro processo sensibile ll luce in Arbidopsis in studio è il modo in cui l pint evit l ombr. Ritmi circdini Come potremmo spettrci per orgnismi con uno stile di vit immobile e dipendenti dll luce, le pinte mostrno forti ritmi circdini. Arbidopsis è un modello eccellente per studire le bsi genetiche dei ritmi circdini e l ntur del misterioso oscilltore ritmico. Resistenz dell pint i ptogeni Le pinte sono dotte di un mpi gmm di strtegie per soprvvivere lle condizioni di stress, come l invsione di ptogeni, e Arbidopsis è un modello per lo studio dei ptogeni e l difes contro di essi. Tr queste difese ci sono le molecole ntimicrobiche, lo sviluppo di brriere fisiche e l induzione dell morte cellulre progrmmt. Genetic di sviluppo delle pinte Come orgnismo pluricellulre, Arbidopsis h un mpi vrietà di orgni e tipi tissutli, ciscuno dotto di un propri genetic di sviluppo. Le ree di studio dello sviluppo comprendono l crescit dell fogli, l formzione dell coron dei fiori, dei semi e delle rdici, lo sviluppo del tessuto vscolre, l embriogenesi e il pino di sviluppo del fiore.

16 16 APPENDICE Orgnismi modello Moscerino dell frutt, Drosophil melnogster Per gentile concessione di Mrcos Teixeir de Freits Simo tutti bituti considerre il moscerino dell frutt come un fstidio cosmopolit, m Drosophil melnogster h un stori lung 100 nni come importnte orgnismo modello per studi di genetic e dello sviluppo. Il corpo del moscerino dell frutt è diviso in segmenti diversi che formno tre sezioni principli: l test, il torce e l ddome. Le sezioni corporee sono rcchiuse in un dur cuticol di chitin, secret dlle cellule epidermiche sottostnti, e sono ricche di prticolri ntomici (indentzioni, peli) che servono come mrctori fenotipici per gli studi di genetic. I primi studi con Drosophil come orgnismo modello Nel 1908 Thoms Hunt Morgn cercv un orgnismo idoneo per gli studi di genetic nimle. A quel tempo i finnzimenti per l scienz erno ridotti e quindi ll fine decise di concentrrsi sull Drosophil, in qunto economic e fcile d crescere. Nel 1910, dopo due nni di studi senz successo, Morgn trovò un mschio con un mutzione spontne che cusv occhi binchi (quest mosc normlmente h gli occhi rossi). Studi elegnti e dettgliti di quest unico mutnte hnno dimostrto che i geni si trovno sui cromosomi, che ogni gene h due lleli, che gli lleli si distribuiscono in mnier indipendente durnte l meiosi e che i geni posti su cromosomi diversi si ssortiscono in mnier indipendente. Queste e ltre scoperte importnti hnno rfforzto le leggi di Mendel nel contesto fisico dei geni loclizzti sui cromosomi (vedi Cpitolo 2). Il moscerino dell frutt è stto nche il primo orgnismo per il qule si è ottenut un mpp genetic. Alfred Sturtevnt, uno studente del lbortorio di Morgn, mppò l distnz reltiv tr i geni lungo i cromosomi in funzione delle loro frequenze di ricombinzione per crossing over. Clvin B. Bridges portò ncor più vnti questi studi identificndo l posizione estt dei geni lungo i cromosomi politenici. Questi cromosomi gignti, posti nelle ghindole slivri del moscerino dell frutt, sono costituiti d gruppi di cromosomi impcchettti insieme e sono crtterizzti d schemi di bndeggio unici qundo vengono colorti (Figur A.7). Bridge identificò più di 5000 bnde disposte secondo uno schem tipico. Non si s perché si formino i cromosomi politenici, m potrebbero essere collegti l ruolo dell ghindol slivre di secrezione dell involucro dell pup durnte l metmorfosi. Molte mutzioni bste sull ricombinzione sono stte identificte con bnde mncnti o con posizioni in cui i FIGURA A.7 Cromosom politenico d insetto. [Fonte: S. F. Werle et l., Cn. J. Zool. 82: , 2004, Fig , NRC, Cnd.] cromosomi si erno invertiti permettendo di mppre i geni su un cromosom, così come di stbilire l posizione dei geni sui cromosomi. Ciclo vitle Le mosche hnno un breve ciclo vitle diploide (12 giorni) (Figur A.8). Il sesso nelle mosche è determinto dl numero di copie di cromosom X, non dl cromosom Y (XX è femmin e il rro X0 è mschio), nche se il cromosom Y è necessrio ll produzione dello sperm. All incirc un giorno dopo l ccoppimento, l femmin inizi deporre centini di uov. Le divisioni nucleri nell embrione sono le più rpide di qulunque ltro orgnismo Pup Prepup Femmin 3 stdio lrvle Ciclo vitle di Drosophil melnogster Mschio Embrione 1 stdio lrvle 2 stdio lrvle FIGURA A.8 Ciclo vitle di Drosophil melnogster. [Fonte: Prof. Dr. Christin Klmbt, Westflische Wilhelms-Universitt Munster, Institut fur Neuor- und Verhltensbilogie.]

17 APPENDICE Orgnismi modello 17 pluricellulre e le uov si schiudono in un giorno circ. Il bco pss ttrverso tre stdi lrvli, seprti d mute che richiedono circ 5 giorni. Le lrve contengono i dischi imginli di tessuto destinti trsformrsi nelle ppendici dell mosc dult (come gli occhi, le ntenne, le zmpe, le li, le ltere, cioè li modificte che funzionno come stbilizztori del volo) e le prti dell bocc. Le ghindole slivri del terzo stdio lrvle secernono l involucro dell pup, in cui l metmorfosi vviene in 3 1 / / 2 giorni fino ll mosc dult. Le mosche vivono pprossimtivmente 30 giorni. Tecniche genetiche Mutgenesi Le mosche possono essere mutgenizzte esponendole lle rdizioni ionizznti o nutrendole con sostnze chimiche mutgene. Le mutzioni che portno cmbimenti nel colore dell occhio, nell form dell l o di prti del corpo possono essere identificte medinte l osservzione visiv. Introduzione di DNA Per inserire il DNA ricombinnte viene usto un processo noto come trsformzione dell elemento P, di norm usto per studire gli effetti dell espressione proteic sugli elementi di controllo dell trscrizione. L elemento P è un trsposone di 3 kbp che può portre un sezione di DNA ricombinnte tr le sue ripetizioni terminli l posto dell trspossi e del repressore d esso codificti (vedi Cpitolo 14). Il DNA dell elemento P ricombinnte viene iniettto nell uovo fecondto, insieme un plsmide che codific un trspossi. L inserimento è csule e il plsmide che codific il gene dell trspossi viene perso durnte le divisioni cellulri, impedendo in questo modo l reintroduzione del trsposone in ltri punti nel genom. Cromosomi bilncitori Alleli letli recessivi possono essere mntenuti stbilmente nei moscerini dell frutt qundo sono ppiti un cromosom bilncitore, un cromosom che non può ricombinre con il suo omologo per l presenz di molte inversioni interne che impediscono l llinemento completo durnte l meiosi. I cromosomi bilncitori sono letli qundo sono omozigoti, quindi l unic progenie che soprvvive è eterozigote per il gene letle recessivo e il bilncitore. Mosici genetici Con l induzione dell ricombinzione mitotic medinte irrdizione con rggi X, nel moscerino dell frutt dulto si possono formre dei mosici genetici, porzioni di tessuti geneticmente lterti. I mosici sono prticolrmente utili qundo si studino i geni letli. I mosici genetici dei geni letli possono formrsi nell dulto nche grzie ll uso di un ricombinsi di lievito inducibile dl clore (dett FLP) ingegnerizzt nel genom. L induzione del clore comport un elevt frequenz di ricombinzione mitotic nei tessuti riscldti, formndo dei mosici genetici. Anche se le lterzioni genetiche possono essere letli per gli embrioni, non necessrimente uccidono l dulto, dto che l loro espressione è loclizzt solmente in lcune cellule. Knockout genici È difficile ottenere dei knockout genici in Drosophil perché le tecniche di ricombinzione omolog non sono ncor perfette. Esistono, però, delle procedure in due pssggi in cui un gene è inserito cso, seguito dll espressione delle proteine che determinno l escissione del gene. Un volt escisso, il frmmento di DNA linere può ndre incontro ll ricombinzione omolog con il gene wild-type. Interferenz d RNA L RNAi può essere ust per diminuire efficcemente il prodotto di uno specifico gene invece che eliminre relmente il gene. Drosophil come orgnismo modello i nostri giorni Mlttie umne Il genom di Drosophil, di circ 170 Mbp, è ll incirc venti volte più piccolo del genom di topo e di quello umno, eppure codific pprossimtivmente lo stesso numero di fmiglie geniche. All incirc il 60% dei geni noti per essere coinvolti in mlttie umne h degli omologhi nel moscerino dell frutt. Per esempio, gli studi dei geni embrionli letli in Drosophil hnno permesso di spiegre l bse genetic di difetti dell nscit umn. Altri modelli di mltti sono i difetti immunologici, il dibete, il cncro, il morbo di Huntington, di Alzheimer e di Prkinson. Pino di sviluppo del corpo L loclizzzione dell mrna mterno nelle uov port un espressione genic loclizzt che stbilisce gli ssi ntero-posteriore e dorso-ventrle in Drosophil. Questi geni controllno il pino di sviluppo corporeo e hnno i loro corrispondenti negli nimli più complessi. Quindi il moscerino serve come sistem piuttosto semplice per comprendere l formzione del pino corporeo (vedi Figur e Cpitoli 21 e 22). Comportmento Drosophil fornisce un modello per l comprensione dell bse cellulre e molecolre di lcuni tipi di comportmento. Le nomlie di comportmento del moscerino dell frutt comprendono cmbimenti nell pprendimento e nell memori, nell ricerc del cibo, del riposo, e in ltri comportmenti, e nell lcoolismo.

18 18 APPENDICE Orgnismi modello Topo domestico, Mus musculus Il topo domestico, Mus musculus, è stto collezionto e llevto dgli mnti dei topi per centini di nni, e lcuni dei ceppi puri, sviluppti d questi, sono usti oggi come stndrd istockphoto per gli studi scientifici. Il topo domestico è il modello di mmmifero principle ed è più simile gli uomini di qunto ci picci mmettere (vedi Figur 1.12). Il genom del topo h qusi l dimensione di quello umno e codific essenzilmente lo stesso numero di geni; il 99% di questi h un omologo nell uomo. Inftti, un grn prte del genom murino è sintenico con il nostro, ovvero interi blocchi di geni si ritrovno nello stesso ordine in entrmbe le specie (vedi Figur 8.4). Rispetto d ltri orgnismi modello, lvorre con i topi è più complicto sotto ogni spetto. Sono più grndi, ovvimente, m hnno nche un tempo di generzione di circ 8-10 settimne e producono, in medi, solmente d 6 8 piccoli per nidit. Questi numeri sono molto interessnti se confrontti con ltri mmmiferi, m poco se confrontti con ltri orgnismi modello. Le colonie di topo sono nche costose d mntenere e non possono essere trttti i numeri necessri per tture grndi screening genetici, come vviene con ltri orgnismi modello. Però, differenz del nemtode e del moscerino dell frutt, i topi hnno sistemi biologici senz prlleli in modelli nimli inferiori, come il sistem immunitrio e l pprto scheletrico, o sono semplicemente modelli migliori per studi di sistemi complessi come l pprto crdiovscolre, il sistem endocrino e molti ltri. Il topo è un modello per le mlttie umne, come il cncro, prticmente in tutti questi sistemi. I primi studi sul topo come orgnismo modello Gli studi genetici sui topi inizirono nei primi nni del Novecento, qundo l selezione e l incrocio erno i principli metodi per ottenere un progenie con i crtteri desiderti. Questi primi studi portrono un modello generle che spiegv il colore dell pellicci in tutti gli ltri mmmiferi con pelo. I topi e i rtti hnno nche un lung stori negli studi nutrizionli, specilmente per l identificzione di vitmine e sintomi custi dll mncnz di vitmine nell diet. L utilizzo dei topi in un modello di mltti umn è stto vvito d Clrence Cook Little. Negli nni Venti, medinte incroci tr consnguinei, questi sviluppò un ceppo di topo, il C57BL/6 (comunemente detto Blck6), che ll fine divenne il ceppo di topo usto per determinre l sequenz del genom. Little fondò nche il Jckson Lbortory in Br Hrbor, Mine, un centro di genetic del topo che serve nche come deposito pubblico di modelli murini per l ricerc scientific. Ciclo vitle I cromosomi X e Y determinno il sesso nei topi, come negli uomini. L fecondzione dà origine un blstocisti contenente lcune cellule non differenzite unite ssieme nell mss cellulre intern, l fonte di cellule stminli embrionli. L gestzione dur giorni e port un nidit di 3-14 piccoli. L mturità sessule richiede circ 6 settimne per le femmine e 8 settimne per i mschi, m l ccoppimento può vvenire in soli 35 giorni. I topi vivono 1-2 nni e le femmine possono dre 5-10 nidite, sostnzilmente nel primo nno di vit. Tecniche genetiche Mutgenesi Gli incroci tr consnguinei per molte generzioni hnno portto molti ceppi utili di topi mutti. L ggiunt di sostnze chimiche mutgene l nutrimento fcilit lo sviluppo di ceppi mutti. Introduzione di DNA Il DNA estrneo può essere iniettto direttmente nel nucleo delle uov fecondte, seguito dll impinto delle uov nell ovidotto dell femmin ricevente. L integrzione csule vviene con elevt frequenz. Il DNA ricombinnte usto di norm h un promotore di topo che dirige l espressione di un gene reporter, come lcz o GFP (protein fluorescente verde), in modo che l espressione del trnsgene poss essere seguit durnte lo sviluppo. Circ metà dei topi trnsgenici contiene DNA ricombinnte nell line germinle e quindi pss il gene ricombinnte lle generzioni future. Knockout genico Il knockout mirto come modello di un mltti murin viene ottenuto prtire dlle cellule stminli embrionli (Figur A.9). Le cellule stminli sono estrtte dll mss cellulre intern dell blstocisti e ftte crescere in coltur. Le cellule stminli coltivte sono poi trsformte con del DNA linere contenente un copi mutt del gene in esme, insieme i geni per l resistenz ll neomicin (neo r ) e l timidin chinsi (tk). DNA omologo fincheggi il gene mutto (gene mut nell Figur A.9) e il gene neo r, in mnier tle che l integrzione omolog sostituisc il gene wild-type con il gene mutto insieme quello per l neo r. Al contrrio, il DNA che si inserisce csulmente port ll integrzione dell intero frmmento di DNA, compres l tk.

19 APPENDICE Orgnismi modello 19 Estrtto di cellule stminli Nessun integrzione Trsformzione Uso dell neomicin per selezionre l neo r Nessun integrzione Blstocisti Cellule dell mss intern (cellule stminli) gene mut Integrzione omolog gene mut Uso del gnglocivir per selezionre contro l tk neo r Integrzione omolog gene mut neo r neo r Integrzione omolog gene mut Iniezione nell embrione Eterozigote knockout Incrocio dell progenie per ottenere un topo omozigote recessivo neo r gene mut FIGURA A.9 Costruzione di un topo knockout. neo r Integrzione non omolog gene mut neo r Integrzione non omolog gene mut Per selezionre le cellule con il gene knockout opportuno, sono necessri due pssggi. L selezione per l neo r, grzie ll uso dell neomicin, uccide tutte le cellule che non hnno integrto il DNA trsformnte. L selezione contro l tk, con l uso dell ntivirle gnciclovir, uccide le cellule che hnno integrto del DNA per ricombinzione non tk neo r Integrzione non omolog tk tk tk omolog, perché queste cellule contengono l tk, e l timidin chinsi trsform il gnciclovir in un tossin che uccide queste cellule. Solmente le cellule che contengono i knockout genici prodotti dll ricombinzione omolog soprvvivono entrmbe le selezioni. Le cellule stminli ingegnerizzte vengono iniettte in un embrione ospite wild-type llo stdio di blstocisti. Questo port ll formzione di un embrione che è un chimer dell ospite wild-type e delle cellule ingegnerizzte dontrici. Le chimere risultnti vengono incrocite per trsmettere l modificzione genetic ttrverso l line germinle. I topi eterozigoti dell F 1 (prim generzione) vengono poi incrociti per ottenere un progenie F 2 wild-type, eterozigote e omozigote, nell tteso rpporto mendelino 1:2:1. Accoppimenti selezionti portno topi knockout omozigoti. Sono stte sviluppte tecniche per conservre, trmite crioconservzione di sperm e di cellule uovo, ceppi di topo preziosi e difficili d ottenere. Il topo come orgnismo modello i nostri giorni Mlttie umne Il topo è un modello importnte per lo studio delle mlttie umne. I modelli delle mlttie possono essere ottenuti trmite ccoppimento tr consnguinei o producendo knockout di noti geni responsbili di mlttie. I modelli murini di mlttie umne comprendono il cncro, l rteriosclerosi, l invecchimento, l ipertensione, le mlttie metboliche, le mlttie del sistem immunitrio, il dibete di tipo 1 e tipo 2, l sindrome di Down, il morbo di Alzheimer, il glucom, l osteoporosi, l obesità, l epilessi, l mltti Lou Gehrig (l sclerosi lterle miotrofic), il morbo di Huntington, le mlttie del sngue e molte ltre. Mpptur dei geni mutti I geni mutti possono essere identificti più velocemente nel topo rispetto i geni mutnti negli uomini. Ceppi di topo molto simili (come Mus musculus e Mus spretus) possono essere incrociti per produrre ibridi che generlmente presentno sequenze diverse in posizioni polimorfiche, permettendo i ricerctori di usre l nlisi di ssocizione per sviluppre mppe genetiche dettglite e loclizzre un gene responsbile di un mltti. Comportmento Esistono modelli murini per certi tipi di comportmento, come l lcoolismo, l dipendenz d droghe, disturbi nsiosi e comportmento ggressivo. Sviluppo del mmmifero I topi trnsgenici sono usti per studire l posizione e l modlità di espressione di prticolri geni in vri momenti dello sviluppo. Inoltre, esistono modelli per studire lcune mlttie dello sviluppo umno, come il lbbro leporino e l pltoschisi.