DETERMINAZIONE di AMMINE AROMATICHE PRIMARIE in SIMULANTI ALIMENTARI ACQUOSI

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1 Dipartimento AMPP Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Pag. 1 di 12 INDICE 1 SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE 2 2 RIFERIMENTI 2 3 DEFINIZIONI 3 4 PERSONALE ABILITATO 3 5 REAGENTI E PRODOTTI 3 6 ATTREZZATURE ED APPARECCHIATURE 5 7 MODALITÁ OPERATIVE 6 8 ESPRESSIONE DEI RISULTATI 8 9 INCERTEZZA DI MISURA REGISTRAZIONE ED ARCHIVIAZIONE MISURE DI SICUREZZA DA OSSERVARE 12 Redazione Verifica Approvazione Data Esperto Tecnico e Resp. Ass. Qualità di Reparto Direttore di Reparto Direttore di Reparto 06/06/2011 Descrizione delle modifiche: Adeguamento al rilievo ACCREDIA del aprile 2011: n.10-2a (assorbanza massima per il BIANCO MATRICE) E N. N. 13/17 (incertezza).

2 Dipartimento AMPP Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Pag. 2 di 12 1 SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE Scopo del presente documento è definire le modalità operative per effettuare la determinazione della migrazione specifica di Ammine Aromatiche Primarie (Primary Aromatic Amines, PAA) da utensili da cucina realizzati in poliammide, in simulanti alimentari acquosi, come richiesto dalla Direttiva 2002/72/EC e successivi aggiornamenti. Questa istruzione operativa riguarda la determinazione della migrazione di PAA in acido acetico al 3%. La concentrazione di PAA viene espressa, in mg di anilina per kg di simulante (mg anilina / kg simulante ), così come riportato nella succitata Direttiva. La determinazione viene pertanto effettuata su porzioni di simulante alimentare proveniente dalle prove di contatto con utensili in poliammide. Le condizioni di tempo e temperatura di contatto necessarie all esecuzione della prova di migrazione sono individuate dalla Direttiva 2002/72/CEE e succ. agg., cui si rimanda. La determinazione si basa sul metodo tedesco LMBG 35 L :1995/Cor:2002: le PAA, eventualmente presenti nel simulante alimentare, sono sottoposte a diazotazione con nitrito di sodio (NaNO 2 ) come agente nitrosante, in ambiente acido per acido cloridrico. L eccesso di NaNO 2 viene quindi neutralizzato con sulfamato di ammonio (AmSulf), per evitare che le PAA nitrosate reagiscano ulteriormente. Infine, le PAA nitrosate vengono copulate con N-(1-naftil)-etilendiammina diidrocloruro (α-neda), per formare un colorante azoico, che impartisce alla soluzione una colorazione viola. La soluzione colorata viene quindi concentrata mediante estrazione in fase solida (SPE). Il contenuto di PAA è determinato spettrofotometricamente a 550 nm, contro una retta di taratura, preparata diluendo opportunamente soluzioni standard di Anilina idrocloruro in simulante alimentare. Tutte le concentrazioni delle soluzioni di taratura e del campione sono espresse nelle unità di misura indicate dal metodo LMBG 35 L :1995/Cor:2002, cioè in mg anilina idrocloruro /kg simulante. Al fine di esprimere il giudizio finale in unità di misura conformi a quelle previste dalla normativa pertinente (mg anilina /kg simulante ), il risultato della determinazione colorimetrica viene convertito in mg anilina /kg simulante moltiplicando per un fattore di conversione (vedi sezione 8 Espressione dei risultati ). Il metodo è applicabile per la determinazione quantitativa di screening delle PAA in acido acetico al 3%, nell intervallo di concentrazione mg anilina /kg simulante ( mg anilina idrocloruro /kg simulante ). Rispetto al metodo LMBG 35 L :1995/Cor:2002 sono state introdotte le seguenti modifiche: eliminazione del punto a 6 µg anilina idrocloruro /100 ml simulante, ovvero il più alto della retta di taratura previsto dal metodo LMBG; aggiunta di un punto a circa 0.25 µg anilina idrocloruro /100 ml simulante, ovvero un punto più basso rispetto a quello previsto dal metodo LMBG; aggiunta di un punto di controllo a circa 1 µg anilina idrocloruro /100 ml simulante. 2 RIFERIMENTI Metodo di prova Manuale della Qualità Procedura Gestionale Moduli LMBG 35 L :1995/Cor:2002 paragrafo 4.13: Controllo delle registrazioni PG-06: Gestione delle risorse umane MO_PG-06_07: Matrice delle competenze MO 01: Foglio di lavoro

3 Dipartimento AMPP Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Pag. 3 di 12 DM e succ. agg. Disciplina igienica degli imballaggi, recipienti, utensili, destinati a venire in contatto con le sostanze alimentari o con le sostanze ad uso alimentare e successivi aggiornamenti. 3 DEFINIZIONI Nessun termine e sigla utilizzata nel testo del presente documento necessita di essere definita. 4 PERSONALE ABILITATO Le attività definite nel presente documento sono da effettuarsi esclusivamente da personale autorizzato dal Direttore di Reparto in accordo alle regole definite nella procedura PG-06: Gestione delle risorse umane. Per i nominativi si rimanda al documento di Reparto MO_PG-06_07: Matrice delle competenze. 5 REAGENTI E PRODOTTI 5.1 Analiti e prodotti chimici Anilina idrocloruro (per la preparazione della retta di taratura) C 6 H 7 N HCl, CAS , PM g/mol, purezza >99%; Anilina idrocloruro (per il controllo della stabilità dell anilina idrocloruro 5.1.1), C 6 H 7 N HCl, CAS , PM g/mol, purezza >99%; Attenzione: l anilina idrocloruro di controllo (5.1.2) deve essere di sorgente diversa dall anilina HCl (5.1.1) Nitrito di sodio, NaNO 2, CAS , PM g/mol, purezza >97%; Solfammato d ammonio, H 6 N 2 O 3 S, CAS , PM g/mol, purezza >98%; N-(1-naftil)-etilendiammina diidrocloruro, C 12 H 14 N 2 2HCl, CAS , PM g/mol, purezza >98%; Acqua deionizzata: acqua prodotta dal dispositivo MilliQ (matricola A-11), preparata immediatamente prima dell uso Acido acetico glaciale, CH 3 COOH Acido cloridrico concentrato, HCl conc: acido cloridrico 37%, densità Metanolo, CH 3 OH. 5.2 Preparazione delle soluzioni Acido acetico al 3% (m/v) (Simulante alimentare B): diluire 30g ± 0.1g di acido acetico glaciale (5.1.7) di grado analitico, in 1000 ml di acqua deionizzata (5.1.6). Attenzione: la soluzione va preparata immediatamente prima dell uso, prima di ogni determinazione.

4 Dipartimento AMPP Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Pag. 4 di Acido cloridrico 1N: prelevare circa 85mL di HCl conc (5.1.8) con un cilindro graduato e trasferirlo in pallone tarato da 1000mL, portando a volume con acqua deionizzata (5.1.6) Acido cloridrico 0.5N: prelevare circa 43mL di HCl conc (5.1.8) con un cilindro graduato e trasferirlo in pallone tarato da 1000mL, portando a volume con acqua deionizzata (5.1.6) Acido cloridrico 0.1N: prelevare circa 9mL di HCl conc (5.1.8) con un cilindro graduato e trasferirlo in pallone tarato da 1000mL, portando a volume con acqua deionizzata (5.1.6) Attenzione: le soluzioni di HCl possono essere conservate per un periodo massimo di 2 (due) mesi Anilina idrocloruro, soluzione MADRE TARATURA, C TARATURA madre = 50mg/L: pesare su bilancia analitica 6.1.2, circa 10mg (±0.1mg) di anilina idrocloruro (5.1.1) e trasferirli in un pallone tarato da 200 ml e portare a volume con il simulante alimentare Anilina idrocloruro, soluzione diluita di LAVORO TARATURA, C TARATURA lavoro = 0.5mg/L: trasferire, con pipetta tarata, 5.0mL di anilina idrocloruro soluzione MADRE (5.2.5) in un pallone tarato da 500mL e portare a volume con il simulante alimentare Anilina idrocloruro, soluzione MADRE CONTROLLO, C CONTROLLO madre = 50mg/L: pesare su bilancia analitica 6.1.2, circa 10mg (±0.1mg) di anilina idrocloruro (5.1.2) e trasferirli in un pallone tarato da 200 ml e portare a volume con il simulante alimentare Anilina idrocloruro, soluzione diluita di LAVORO CONTROLLO, C CONTROLLO lavoro = 0.5mg/L: trasferire, con pipetta tarata, 5.0mL di anilina idrocloruro soluzione MADRE (5.2.7) in un pallone tarato da 500mL e portare a volume con il simulante alimentare Attenzione: le soluzioni di anilina possono essere conservate per un periodo massimo di 2 (due) mesi Sodio nitrito soluzione (C sodio nitrito = 0.5g /100mL): pesare circa 500mg (± 10mg) di nitrito di sodio in un pallone tarato da 100mL e portare a volume con acqua deionizzata Attenzione: la soluzione può essere conservata per un periodo massimo di 1 (uno) mese Solfammato d ammonio soluzione (C ammonio sulfammato = 2.5g /100mL): pesare circa 2.5g (± 1mg) di solfammato d ammonio in un pallone tarato da 100mL e portare a volume con acqua deionizzata Attenzione: la soluzione può essere conservata per un periodo massimo di 1 (uno) mese Agente copulante (N-(1-naftil)-etilendiammina) (C αneda = 1g /100mL): pesare circa 1.0g (± 1mg) di N-(1-naftil)-etilendiammina didrocloruro (5.1.5), in un pallone tarato da 100mL e portare a volume con acqua deionizzata - trattare in bagno ad ultrasuoni fino a solubilizzazione completa Attenzione: la soluzione di (N-(1-naftil)-etilendiammina) non si conserva e deve essere preparata fresca prima di ciascuna sessione di prove prevista per ogni determinazione Colonne per estrazione in fase solida (SPE): colonne in polipropilene, preimpaccate con fase stazionaria ottadecilsilil-silice Nota: le colonne STRATA-X 33u Polymeric Reversed Phase 60mg/3mL, part. no 8B-S100-UBJ, prodotte dalla Phenomenex, si sono dimostrate adatte allo svolgimento del presente protocollo Soluzione eluente (MeOH:HCl 0,5N; 80:20 v/v): miscelare 80 parti di metanolo (5.1.9), con 20 parti di acido cloridrico 0.5 N (5.2.3). Attenzione: la soluzione può essere conservata per un periodo massimo di 1 (uno) mese. NOTA BENE: tutti i recipienti contenenti le soluzioni preparate devono recare, attraverso un etichetta o una marcatura a pennarello vetrografico, le seguenti informazioni: contenuto del recipiente data di preparazione

5 Dipartimento AMPP Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Pag. 5 di 12 data di scadenza sigla dell operatore che ha effettuato la preparazione del simulante. Tutte le soluzioni possono essere conservate a temperatura ambiente. 6 ATTREZZATURE ED APPARECCHIATURE 6.1 Apparecchiature ed accessori Spettrofotometro (UV-Vis), matricola A-14, impostato alla lunghezza d onda di 550nm Bilancia analitica, matricola A-01; Bilancia tecnica, matricola A-03; cuvette con cammino ottico da 200mm o 400mm in vetro o quarzo (o altro materiale idoneo a 550nm) SPE manifold (vasca in vetro per il condizionamento, carico ed eluizione delle colonne SPE) pompa da vuoto reservoir per colonne SPE sistema di tubi in teflon per il trasferimento del campione dalle bottiglie alle colonne SPE Vetreria bottiglie da 250mL, con tappo a vite e guarnizione di teflon pallone tarato da 500mL pallone tarato da 200mL pallone tarato da 250mL pallone tarato da 100mL pallone tarato da 10mL cilindro graduato da 100mL pipette tarate da 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0mL pipetta automatica navicelle per pesata in vetro e/o in plastica bottiglie da 500mL, con tappo a vite e guarnizione di teflon

6 Dipartimento AMPP Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Pag. 6 di 12 7 MODALITÁ OPERATIVE 7.1 Preparazione dei campioni per la determinazione delle PAA 1. Trasferire 100mL del simulante alimentare proveniente dalle prove di contatto in una bottiglia (6.2.1) e contrassegnarla opportunamente; 2. procedere alla Diazotazione delle PAA ( 7.4). 7.2 Preparazione delle soluzioni di riferimento di Anilina Idrocloruro (retta di taratura e standard di controllo) 1. Per la costruzione della retta di taratura, predisporre 7 (sette) bottiglie con tappo a vite (6.2.1) e, attraverso un etichetta o una marcatura a pennarello vetrografico, contrassegnarle opportunamente con sigle che identifichino i volumi in ml di Anilina idrocloruro soluzione DILUITA di LAVORO TARATURA (5.2.6) che vi saranno successivamente trasferiti: std_05 (=0.5mL), std_1 (=1mL), std_2 (=2mL), std_3 (=3mL), std_4 (=4mL), std_6 (=6mL) e std_8 (=8mL) 2. predisporre 1 (una) bottiglia con tappo a vite (6.2.1) e, attraverso un etichetta o una marcatura a pennarello vetrografico, contrassegnarla opportunamente con una sigla che identifichi la soluzione di controllo di Anilina idrocloruro soluzione DILUITA di LAVORO CONTROLLO (5.2.8); 3. con l ausilio di pipette tarate (6.2.8) introdurre in ciascuna bottiglia di cui al punto 1. i seguenti volumi di Anilina idrocloruro soluzione diluita di LAVORO TARATURA (5.2.6): 0.5mL, 1.0mL, 2.0mL, 3.0mL, 4.0mL, 6.0mL e 8.0mL; 4. con l ausilio di una pipetta tarata da 3mL (6.2.8) introdurre nella bottiglia di cui al punto 2, 3.0mL di Anilina idrocloruro soluzione diluita di LAVORO CONTROLLO (5.2.8); 5. addizionare ciascuna bottiglia con simulante alimentare fresco, fino ad un volume finale di 100mL; 6. annotare la concentrazione finale effettiva di Anilina Idrocloruro ottenuta (in µg/100ml) sul modulo MO 01; 7. procedere alla Diazotazione delle PAA (7.4). 7.3 Preparazione dei bianchi Bianco REAGENTI Il bianco reagenti consente di eliminare il contributo di assorbanza dovuto all eventuale presenza nel simulante e nei reagenti di composti interferenti diversi dalle ammine aromatiche. 1. Trasferire 100mL di simulante alimentare fresco in una bottiglia (6.2.1) e contrassegnarla opportunamente; 2. procedere alla Diazotazione delle PAA ( 7.4) Bianco MATRICE Il bianco matrice consente di eliminare il contributo di assorbanza dovuto all eventuale presenza di composti colorati (cromofori interferenti) contenuti nel simulante a contatto con il campione, diversi dalle ammine aromatiche, eventualmente rilasciati dal campione ed interferenti con la determinazione colorimetrica. Pertanto, la determinazione viene effettuata senza procede alla riduzione delle PAA con NaNO 2.

7 Dipartimento AMPP Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Pag. 7 di Trasferire 100mL di di simulante alimentare che sia stato a contatto con il campione in una bottiglia (6.2.1) e contrassegnarla opportunamente; 2. procedere alla Diazotazione delle PAA ( 7.4), SENZA AGGIUNGERE NaNO 2 (5.2.9). 7.4 Diazotazione delle PAA Sottoporre ogni bottiglia al seguente procedimento: 1. Aggiungere con pipetta automatica 12.5mL di HCl 1N (5.2.2) 2. aggiungere 2.5mL di NaNO 2 (5.2.9) ATTENZIONE: NON aggiungere NaNO 2 (5.2.9) per la preparazione del bianco MATRICE. 3. chiudere la bottiglia, miscelare e lasciare a riposo per 10min 4. aggiungere 5mL di AmSulf (5.2.10) 5. chiudere la bottiglia, miscelare e lasciare a riposo per 10min 6. aggiungere 5mL di α-neda (5.2.11) 7. chiudere la bottiglia, miscelare e lasciare a riposo per 120min, schermando dalla luce 8. procedere alla Concentrazione su SPE ( 7.5). 7.5 Concentrazione su SPE Condizionamento delle colonne SPE 1. montare le colonne SPE (5.2.12), preventivamente identificate con la sigla del campione, della soluzione di riferimento (taratura e controllo) o dei bianchi (reagenti e matrice) che verrà caricato, sul SPE manifold (6.1.5); 2. montare su ogni colonna un resevoir (6.1.7), preventivamente identificato con la sigla del campione o della soluzione di riferimento (taratura e controllo) o dei bianchi (reagenti e matrice) che verrà caricato; 3. caricare nel reservoir (6.1.7) di ciascuna colonna, mediante l ausilio della pipetta automatica, 12 ml di metanolo (5.1.9), lasciar percolare naturalmente (circa 1 goccia al secondo), applicando il vuoto (6.1.6) per avviare e regolare la percolazione e curando di non permettere alle colonne di andare a secco 4. caricare nel reservoir di ciascuna colonna 12 ml di soluzione eluente (5.2.13), lasciar percolare naturalmente (circa 1 goccia al secondo), applicando il vuoto (6.1.6) per avviare e regolare la percolazione e curando di non permettere alle colonne di andare a secco 5. caricare nel reservoir di ciascuna colonna 12 ml di HCl 0.1N (5.2.4), lasciar percolare naturalmente (circa 1 goccia al secondo), applicando il vuoto (6.1.6) per avviare e regolare la percolazione e curando di non permettere alle colonne di andare a secco Carico del campione sulle colonne SPE 1. togliere il reservoir da ogni colonna, collegare il sistema di tubi (6.1.8) e trasferire i campioni, le soluzioni di riferimento (taratura e controllo) e i bianchi (reagenti e matrice), sulle rispettive colonne, lasciando percolare naturalmente (circa 1 goccia al secondo), applicando il vuoto (6.1.6) per avviare e regolare la percolazione e curando di non permettere alle colonne di andare a secco 1 1 quando deposto e percolato alla velocità giusta, il campione deposto sulla colonna dovrebbe formare un anello colorato in viola, molto ben definito

8 Dipartimento AMPP Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Pag. 8 di lavare le bottiglie con un aliquota da 3 ml di HCl 0.1N (5.2.4) e trasferire in colonna SPE; 3. ripetere il lavaggio con altri 3 ml di HCl 0.1N (5.2.4) e trasferire in colonna SPE; 4. disconnettere il sistema di tubi (6.1.8) e rimontare i reservoir sulle rispettive colonne SPE; 5. lavare le colonne con altre due aliquote da 3 ml di HCl 0.1N (5.2.4); 6. lasciare le colonne SPE sotto vuoto per circa un minuto (6.1.6), in modo da asciugare la fase stazionaria Eluizione delle colonne SPE 1. accomodare nella vasca del SPE manifold (6.1.5) un pallone tarato da 10 ml (6.2.5) per ciascun campione, soluzione di riferimento o controllo e i bianchi; 2. eluire le colonne SPE con 5 9 ml di miscela eluente (5.2.13), lasciando percolare naturalmente (circa 1 goccia al secondo), applicando il vuoto (6.1.6) per avviare e regolare la percolazione; 3. togliere i palloni dalla vasca del SPE manifold; 4. portare a volume ciascun pallone con la miscela eluente (5.2.13), ed avviare alla lettura spettrofotometrica lettura spettrofotometrica ATTENZIONE: tutte le letture spettrofotometriche devono essere effettuate contro bianco REAGENTI. 1. leggere allo Spettrofotometro (6.1.1) l assorbanza a 550nm del bianco matrice, delle soluzioni di riferimento di anilina idrocloruro (7.1), della soluzione di controllo e dei campioni, azzerando preventivamente lo strumento contro il bianco REAGENTI (7.3.1); 2. sottrarre al valore di assorbanza di ogni campione il valore del bianco MATRICE (7.3.2); 3. riportare i risultati sul Modulo MO 01; 4. calcolare i valori di assorbanza corretta ed annotarli sul Modulo MO ESPRESSIONE DEI RISULTATI ATTENZIONE: le letture spettrofotometriche del simulante a contatto con il campione (escluso il campione BIANCO MATRICE) devono essere sottratte dell assorbanza del bianco MATRICE. 1. costruire il grafico riportando i valori di concentrazione delle soluzioni di riferimento di anilina idrocloruro (7.1) contro i valori di assorbanza (vedi Modulo MO 01) 2. derivare l equazione della retta di regressione dove: A RIF m C RIF A RIF = m C RIF + q è l assorbanza della soluzione di RIFERIMENTO è il coefficiente angolare o la pendenza della retta di regressione è la concentrazione della soluzione di RIFERIMENTO di anilina idrocloruro (in µg anilina idrocloruro /100mL simulante )

9 Dipartimento AMPP Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Pag. 9 di 12 q è l intercetta della retta di regressione 3. calcolare il coefficiente di correlazione della retta di regressione r 2 4. verificare che sia soddisfatto il seguente criterio r ATTENZIONE: se il criterio non è soddisfatto, l intero procedimento analitico deve essere ritenuto NON VALIDO e deve essere ripetuto 5. calcolare la C CAMP anilina*hcl, ovvero la concentrazione di anilina idrocloruro nel CAMPIONE, espressa in µg anilina idrocloruro /100mL simulante, per interpolazione della retta di regressione C CAMP anilina*hcl = (A CAMP q) / m 6. calcolare la C BIANCO MATRICE, ovvero la concentrazione di cromofori interferenti nel BIANCO MATRICE, espressa in µg anilina idrocloruro /100mL simulante, per interpolazione della retta di regressione BIANCO MATRICE C = (A BIANCO MATRICE q) / m ATTENZIONE: la C BIANCO MATRICE non deve essere superiore a 0.1 µg anilina idrocloruro /100 ml simulante. Se il criterio non è soddisfatto, il risultato della prova non può essere utilizzato per esprimere un parere di conformità alla normativa vigente. ATTENZIONE: se il risultato della concentrazione di anilina idrocloruro nel CAMPIONE C CAMP anilina*hcl ricavata dalla curva di taratura è inferiore alla concentrazione minima della retta di taratura, esprimere il risultato come segue C CAMP anilina idrocloruro < 0.25 µg anilina idrocloruro /100mL simulante 7. calcolare la C CONT misurata, ovvero la concentrazione di anilina idrocloruro nella soluzione di CONTROLLO, espressa in µg anilina idrocloruro /100mL simulante, per interpolazione della retta di regressione C CONT misurata = (A CONT q) / m 8. verificare che sia soddisfatto il seguente criterio dove: C CONT misurata - C CONT nominale 0.1 µg anilina idrocloruro /100mL simulante C CONT nominale è la concentrazione (nota per pesata vedi 7.2, punto 5.) di anilina idrocloruro nella soluzione di CONTROLLO, espressa in µg anilina idrocloruro /100mL simulante

10 Dipartimento AMPP Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Pag. 10 di 12 ATTENZIONE: se il criterio non è soddisfatto, l intero procedimento analitico deve essere ritenuto NON VALIDO e deve essere ripetuto 9. convertire il valore di C CAMP anilina*hcl in C CAMP anilina (ovvero, la concentrazione di anilina nel CAMPIONE in µg anilina /100mL simulante mediante la formula C CAMP anilina = C CAMP anilina*hcl x considerando unitaria la densità del simulante (ovvero, 1kg = 1000mL), esprimere il valore di C CAMP anilina in mg anilina /kg simulante con due cifre decimali mediante la formula: C CAMP anilina (in mg anilina /kg simulante ) = C CAMP anilina (in µg anilina /100mL simulante ) x INCERTEZZA DI MISURA Di seguito si riporta la procedura di calcolo dell incertezza di misura da associare al risultato della prova. Sorgenti di incertezza da prendere in considerazione a) ripetibilità (u r ) b) taratura (u t ) c) volume di simulante alimentare sottoposto a prova (u v1 ) d) volume finale dell eluato per la determinazione spettrofotometrica (u v2 ) Quantificazione delle incertezze a) Ripetibilità del metodo: incertezza calcolata come scarto tipo di una distribuzione normale numero di gradi di libertà ν r = (n 1) b) Taratura: incertezza stimata considerando sia il contributo dovuto alla costruzione della retta di regressione che delle soluzioni di riferimento. Per stimare l incertezza della regressione lineare utilizzare la seguente espressione: numero di gradi di libertà ν reg = (n 1) dove: b coefficiente angolare della retta di taratura

11 Dipartimento AMPP Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Pag. 11 di 12 m n y y x i x s res numero letture del campione sulla curva di taratura numero di punti di taratura la lettura effettuata (la risposta strumentale) la media delle letture dei punti di taratura (risposta media delle soluzioni di taratura) la concentrazione della soluzione di taratura i-esima la media delle concentrazioni delle soluzioni di taratura scarto tipo dei residui, calcolato come segue: dove r i è il residuo i-esimo (differenza tra la lettura osservata e la corrispondente lettura calcolata sulla retta di taratura) e r la media dei residui. Per stimare incertezza delle soluzioni di riferimento, considerare l incertezza del materiale di riferimento, l incertezza di ciascun misuratore di volume utilizzato per la diluizione del materiale di riferimento (pipetta e matraccio), l incertezza dell operatore nel portare a volume e l incertezza dovuta alla variazione di temperatura tra la soluzione di riferimento quando viene portata a volume e la temperatura di taratura del matraccio. Per l effetto dovuto alla temperatura utilizzare come coefficiente di dilatazione termico il valore α = 2.1x10-4 ml/(mlxc ), come variazione di temperatura considerare un valore pari a 5 C (distribuzione rettangolare, gradi di libertà: infinito) e relativamente all incertezza dell operatore nel portare a volume considerare uno scostamento massimo dalla tacca di 1 mm (distribuzione rettangolare, gradi di libertà: infinito). c) Volume di simulante alimentare sottoposto a prova: incertezza stimata considerando il contributo dovuto alla taratura del cilindro graduato utilizzato per misurare il volume e il contributo dovuto alla differenza di temperatura tra il simulante e la temperatura di taratura del cilindro. Per l effetto dovuto alla temperatura utilizzare come coefficiente di dilatazione termico il valore α = 2.1x10-4 ml/(mlxc ), come variazione di temperatura considerare un valore pari a 5 C (distribuzione rettangolare, gradi di libertà infiniti). Il contributo dovuto all operatore nel portare a volume è già incluso nel contributo dovuto allo studio di ripetibilità. d) Volume finale dell eluato per la determinazione spettrofotometrica: incertezza stimata considerando il contributo dovuto alla taratura del matraccio utilizzato per portare a volume l eluato della colonna SPE e il contributo dovuto alla variazione di temperatura presente tra l eluato e la temperatura di taratura del matraccio. Per l effetto dovuto alla temperatura utilizzare come coefficiente di dilatazione termico il valore α = 2.1x10-4 ml/(mlxc ), come variazione di temperatura considerare un valore pari a 5 C (distribuzione rettangolare, gradi di libertà infiniti). Il contributo dovuto all operatore nel portare a volume è già incluso nel contributo dovuto allo studio di ripetibilità.

12 Dipartimento AMPP Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Pag. 12 di 12 Calcolo dell incertezza composta numero di gradi di libertà Calcolo dell incertezza estesa Il limite di ripetibilità, cioè la differenza massima tra due risultati di prova ottenuti da uno stesso operatore su un materiale di prova identico utilizzando la stessa apparecchiatura entro il più breve intervallo di tempo, è 0,097 µg di anilina idrocloruro/100 ml, ad un livello di probabilità del 95%. 10 REGISTRAZIONE ED ARCHIVIAZIONE Registrare i risultati sul MO 01: Foglio di Lavoro. Per le modalità e responsabilità di archiviazione delle stesse si rimanda al paragrafo 4.13: Controllo delle registrazioni del Manuale della Qualità. 11 MISURE DI SICUREZZA DA OSSERVARE La determinazione richiede l utilizzo di diverse sostanze caratterizzate da elevata tossicità. Pertanto, il personale che esegue la prova deve essere opportunamente edotto sulla pericolosità delle sostanze manipolate; trattandosi infatti di sostanze tossiche e nocive per inalazione, si raccomanda di adottare tutti gli accorgimenti che ne consentano una manipolazione sicura, ovvero: 1. consultare le schede di sicurezza delle sostanze da utilizzare; 2. svolgere tutte le operazioni di pesatura dei reattivi sotto cappa aspirante (con esclusione dell anilina idrocloruro), curando in particolar modo il contenimento delle polveri durante il carico del piattello ed il trasferimento ai rispettivi contenitori; 3. svolgere la pesatura dell anilina sulla bilancia analitica 6.1.2, curando di indossare un adeguata protezione delle prime vie respiratorie (mascherina antipolvere, ecc.) contenendo con la massima attenzione la dispersione di polvere; 4. indossare sempre i guanti in lattice e/o nitrilici durante le pesate delle sostanze in polvere e delle soluzioni 5. nel caso di contatto con una delle soluzioni, lavare immediatamente la zona interessata con abbondante acqua.