PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando i principi della duplicazione del DNA, permette di ottenere in poco tempo notevoli quantità di materiale specifico
Science. 1988 Jan 29;239(4839):487-91. Related Articles, Links Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Cetus Corporation, Department of Human Genetics, Emeryville, CA 94608. A thermostable DNA polymerase was used in an in vitro DNA amplification procedure, the polymerase chain reaction. The enzyme, isolated from Thermus aquaticus, greatly simplifies the procedure and, by enabling the amplification reaction to be performed at higher temperatures, significantly improves the specificity, yield, sensitivity, and length of products that can be amplified. Single-copy genomic sequences were amplified by a factor of more than 10 million with very high specificity, and DNA segments up to 2000 base pairs were readily amplified. In addition, the method was used to amplify and detect a target DNA molecule present only once in a sample of 10(5) cells.
PCR schema
DNA bersaglio Primers Enzima Nucleotidi trifosfati Ioni Mg ++
DNA bersaglio Campione Primers Oligonucleotidi sintetici complementari a sequenze fiancheggianti il tratto di DNA da studiare 20 25 bp Enzima DNA polimerasi Nucleotidi trifosfati
Termociclatori Denaturazione del DNA (94 C) Ibridazione dei primers al bersaglio (40 C 60 C) Sintesi del DNA (72 C)
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End Point PCR Il campione si sottopone al numero di cicli stabiliti (30-40), alla fine della reazione un aliquota si sottopone ad elettroforesi su gel di agorosio per verificare: 1. la lunghezza dell amplificato (controllo del peso molecolare in bp mediante ladder); 2. La quantità di amplificato ottenuto (proporzionale all intensità della banda); 3. L assenza di frammenti aspecifici.
Vantaggi Si può evitare l uso di tecniche più laboriose. Velocità di esecuzione Si possono analizzare campioni di poche cellule (anche 1 cellula). Elevata sensibilità
Biopsie Applicazioni Analisi prenatale e Analisi preimpianto Tracce di infezioni virali Malattia mimima residua Medicina forense
La PCR end-point non è un metodo quantitativo Alla fine della reazione non sempre la quantità di DNA del campione d origine è proporzionale all intensità della banda ottenuta. Utilizzando particolari accorgimenti può diventare un metodo semi-quantitativo. Ricerca di mutazioni note; Ricerca di mutazioni non ancora identificate.
Examples of Inherited Disorders Detectable by PCR Disease Affected Gene Severe-combined immunodeficiency, SCID adenosine deaminase (ADA) Lesch-Nyhan syndrome hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) α 1 -Antitrypsin deficiency α 1 -Antitrypsin Cystic fibrosis cystic fibrosis transmembrane conductance (CFTR) protein Fabry disease α-galactosidase Gaucher disease acid β-glucosidase (glucocerebrosidase) Sandhoff disease hexosaminidase A and B Tay-Sachs disease hexosaminidase A Familial hypercholesterolemia (FH) LDL receptor Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency glucose-6-phosphate dehydrogenase Maple syrup urine disease branched-chain α-keto acid dehydrogenase Phenylketonuria (PKU) phenylalanine hydroxylase Ornithine transcarbamylase deficiency ornithine transcarbamylase Retinoblastoma (Rb) RB gene product, prb Sickle-cell anemia point mutation in β-globin β-thalassemia mutations in β-globin gene that result in loss of synthesis of protein Hemophilia A Factor VIII Hemophilia B Factor IX
Ricerca delle mutazioni del gene K-Ras nella biopsia del paziente
Disegno dei Primers
Digestione con enzimi di restrizione di DNA amplificato con PCR; controllo della grandezza dei frammenti su gel
M 1 2 3 4 187 bp 165 bp +- +- ++ ++ Analisi della mutazione N1303K (gene CFTR: 4041 C>G) In questo caso la mutazione crea un sito di restrizione per l enzima DdeI (CTNAG), perciò l'enzima taglia il DNA con la mutazione Frammento non tagliato 187 bp (no mutazione) Frammento più piccolo 165 bp (presenza di mutazione) (+ presenza della mutazione; - mutazione assente; M = marcatore di peso molecolare)
Scomparsa di un sito BclI nel gene del fattore VIII
Ibridazione di DNA amplificato con PCR ad oligonucleotidi allele specifici (ASO)
ARMS Amplification refractory mutation system (amplificazione allele specifica) Si eseguono due amplificazioni parallele. Uno dei primer è comune ad entrambe le reazioni; l altro in una reazione è specifico per l allele normale, nell altra per l allele mutato
PCR allele specifica
Multiplex ARMS test per individuare 4 specifiche mutazioni che causano la fibrosi cistica
PCR con primers localizzati agli estremi di una delezione o di un breakpoint di traslocazione
RT-PCR Reverse transcription-pcr
Log[DNA] Plateau Lineare Esponenzial e Prodotto variabile N cicli termici
Polymerase Chain Reaction: plateau Resa effettiva: effetto plateau Il processo di duplicazione non procede all infinito, esso è limitato da: Quantità dei primers Attività della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti
Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di a m p l i f i c a z i o n e è i n f l u e n z a t a minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla P C R t r a d i z i o n a l e " e n d p o i n t "
Real Time PCR Si utilizzano particolari termociclatori in grado misurare la fluorescenza emessa da particolari fuorofori ad ogni ciclo. La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR
Chimiche fluorescenti per PCR Real-Time La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche Le chimiche principali sono basate sia sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche.
SYBR Green: principio SYBR Green I Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA
SYBR Green Durante l elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all aumento del numero di copie dell amplicone
SYBR green Metodica semplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa Non costosa Non-specifica La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers È necessario ottimizzare la metodica per evitare la f o r m a z i o n e di p r o d o t t i a s p e c i f i c i
Curva di dissociazione Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione
Curva di dissociazione Tm melting peak 82.6 88.1
TaqMan La Real-Time PCR si può realizzare mediante l impiego: coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano in m a n i e r a a s p e c i f i c a a t u t t o il D N A sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di i n t e r e s s e, m a r c a t e c o n m o l e c o l e f l u o r e s c e n t i Esistono diversi tipi di sonde: Dual-labeled (come le sonde TaqMan) Molecular beacons Scorpion Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Sonde TaqMan La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare 3 5 Primer 5 3 R Q 5 3 Primer 3 5 5 3 La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all interno del frammento amplificato nella reazione di PCR
Sonda TaqMan Presenta all estremità 5 un fluoroforo Reporter ed all estremità 3 una molecola Quencher 5 3
Reporter-Quencher 5 REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza 3 QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter R Q 5 3 Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q
Real Time PCR
L aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati Forward primer Probe Reverse primer
Fluorescenza Curve di amplificazione Plot lineare Cicli di amplificazione Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui C T (=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di template iniziale
Quantificazione ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una standard curve) Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i C T Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard curve) Gli unknowns vengono quantificati paragonando il loro C T con quello del controllo endogeno
Quantitativa relativa: analisi dei dati Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso costitutivamente ( C T ) Comparare ciascun C T così ottenuto con il C T di un trattamento di controllo anche detto calibratore (cb) ( C T ) 2 - ( CT,r- CT,cb) = 2 - CT Il valore così ottenuto permette di determinare la c o n c e n t r a z i o n e r e l a t i v a d e l t a r g e t
Valutare le differenze di espressione 2 - CT 2 - CT < 0.3 down regolati 2 - CT > 3 up regolati ln 2 - CT ln 2 - CT < 1 down regolati ln 2 - CT > 1 up regolati
Esempio di quantificazione relativa usando il metodo 2 - CT Ct (drn) Old Ct HPRT DELTA Ct old Ct Ct HPRT delta Ct young Delta Delta Ct BRAF 28,1 19,23 8,87 27,18 17,63 9,55 0,68 0,624165-0,47134 NOD1 26,77 19,23 7,54 25,78 17,63 8,15 0,61 0,655197-0,42282 CARD6 29,19 19,23 9,96 29,69 17,63 12,06 2,1 0,233258-1,45561 CARD8 30,67 19,23 11,44 29,12 17,63 11,49 0,05 0,965936-0,03466 CASP1 26,54 19,23 7,31 25,82 17,63 8,19 0,88 0,543367-0,60997 CASP10 29,14 19,23 9,91 28,01 17,63 10,38 0,47 0,721965-0,32578 CASP14 31,06 19,23 11,83 29,6 17,63 11,97 0,14 0,907519-0,09704 CASP2 27,51 19,23 8,28 26,11 17,63 8,48 0,2 0,870551-0,13863 CASP3 27,99 19,23 8,76 26,9 17,63 9,27 0,51 0,702222-0,35351 CASP4 25,84 19,23 6,61 24,39 17,63 6,76 0,15 0,90125-0,10397 CASP5 29,47 19,23 10,24 28,85 17,63 11,22 0,98 0,50698-0,67928 CASP6 25,95 19,23 6,72 24,29 17,63 6,66-0,06 1,042466 0,041589 CASP7 28,3 19,23 9,07 26,86 17,63 9,23 0,16 0,895025-0,1109 CASP8 34,12 19,23 14,89 29 17,63 11,37-3,52 11,47164 2,439878 CASP9 25,28 19,23 6,05 24,32 17,63 6,69 0,64 0,641713-0,44361 CD40 33,28 19,23 14,05 29,3 17,63 11,67-2,38 5,205367 1,64969 CD40LG 28,09 19,23 8,86 30 17,63 12,37 3,51 0,087778-2,43295 CFLAR 25,15 19,23 5,92 24,13 17,63 6,5 0,58 0,668964-0,40203 CIDEA 30,9 19,23 11,67 29,56 17,63 11,93 0,26 0,835088-0,18022 CIDEB 30,76 19,23 11,53 29,35 17,63 11,72 0,19 0,876606-0,1317 CRADD 27,43 19,23 8,2 26,09 17,63 8,46 0,26 0,835088-0,18022 DAPK1 31,31 19,23 12,08 29,58 17,63 11,95-0,13 1,094294 0,090109 Young potenza ln
Real-Time PCR: applicazioni Quantificazione virale Quantificazione dell espressione genica Efficacia della terapia farmacologica Detenzione dei patogeni Controllo degli OGM Genotyping MRD