MISFOLDING E MALATTIE NEURODEGENERATIVE

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1 MISFOLDING E MALATTIE NEURODEGENERATIVE A cura di: Giancarlo Trimarchi Dario Scapellato Flavio Trusso Valeria Todaro Melissa Torrisi Fabio Vignera Gaetano Strano Cesare Saitta

2 Video 1

3 Folding ed attività biologica delle proteine La forma è l immagine plastica della funzione. (Angelo Ruffini) Le proteine sono molecole flessibili con struttura a rapida fluttuazione e le loro mobilità strutturali sono collegate alla loro funzione. Protein Folding: auto-assemblamento e ripiegamento intramolecolare attraverso cui il polipeptide, mediante interazioni non covalenti, assume la propria conformazione nativa che gli permette di svolgere la sua peculiare funzione fisiologica.

4 Denaturazione Proteica Condizioni ed agenti denaturanti: CALORE rotazione ottica a carico della struttura e variazione di viscosità e di assorbimento UV; ph estremi variazione degli stati di ionizzazione delle catene laterali degli amminoacidi; DETERGENTI compromissione delle interazioni idrofobe mediante associazione ai residui non polari; Dinamica molecolare della mioglobina AGENTI CAOOTROPICI aumento della solubilità delle sostanze non polari in acqua disgregazione delle interazioni idrofobe; Urea Ione guanidinio Mercaptoetanolo Formaldeide

5 Esperimento di Anfinsen (1957) La ribonucleasi A (RNasi A), completamente denaturata in una soluzione 8 M di urea contenente 2-mercaptoetanolo, riassume la propria conformazione nativa attraverso l eliminazione per dialisi dell agente denaturante e del riducente e l esposizione ad O 2 a ph 8. RNasi A: -proteina a catena singola (124 residui) - 4 ponti disolfuro determinati da 8 -residui Cys. Probabilità complessiva di riformazione casuale dei ponti disolfuro della RNasi A: 1/7 x 1/5 x1/3 x1/1 = 1/105 = < 1%

6 Dogma di Anfinsen (1957) In condizioni fisiologiche, le proteine possono ripiegarsi spontaneamente nella loro conformazione nativa che corrisponde ad un unico minimo di energia libera, stabile e cineticamente accessibile. Ciò implica che la struttura primaria di una proteina, costituita da una specifica sequenza di amminoacidi, determina univocamente la sua struttura tridimensionale.

7 Paradosso di Levinthal Come fa una proteina a ripiegarsi nella sua conformazione nativa? L eplorazione casuale di tutte le sue possibili conformazioni fino al raggiungimento di quella corretta NON è una procedura possibile!!! DIMOSTRAZIONE: ogni residuo ha 2 possibili angoli di torsione (φ e ψ) ciascun angolo di torsione ha tre conformazioni stabili tempo di analisi di ogni nuova conformazione pari a s una proteina di n residui possiede 2^n angoli di torsione; 3 2n 10 n conformazioni possibili; tempo di analisi di tutte le strutture t = 10 n /10 13 Es: proteina di 100 residui (molto piccola), t = 10^87 >> età dell Universo. Le proteine raggiungono la loro conformazione nativa in meno di qualche secondo e pertanto il ripiegamento avviene necessariamente attraverso vie dirette, piuttosto che attraverso la scelta casuale della struttura.

8 Processo di Folding Il ripiegamento avviene in modo gerarchico e la stabilità conformazionale della proteina aumenta in maniera netta, ossia la sua energia libera (ΔG) diminuisce drasticamente. Fasi del Folding: formazione di segmenti locali di struttura secondaria (α-eliche e foglietti-β) entro 5 ms dall inizio del ripiegamento; collasso idrofobico; formazione globulo fuso (molten globule) con prevalenza di struttura secondaria e poca struttura terziaria finale nativa; stabilizzazione della struttura secondaria e formazione di sottodomini con parziale assemblaggio della struttura terziaria ( ms); impaccamento delle catene laterali interne, formazione di legami idrogeno ed espulsione delle molecole d acqua rimaste nel nucleo idrofobo; ΔG folding caratterizzato da valori bassi (-5, -10 kcal/mol) Ipotetica via di ripiegamento di una proteina composta di due domini.

9 Profilo energetico del Folding Una proteina che si ripiega deve procedere da uno stato ad alta energia ed alta entropia a uno stato caratterizzato da bassi valori di energia ed entropia; tale nesso è conosciuto come «imbuto di ripiegamento» (folding funnel). Le «fenditure» e le «gole» più piccole rappresentano conformazioni acquisite temporaneamente dalle proteine sino a quando, attraverso un attivazione termica casuale, superano la leggera rampa della barriera di energia libera possono procedere verso una conformazione a energia inferiore. Le proteine si sono evolute in modo da possedere vie di ripiegamento efficienti e conformazioni native stabili.

10 Disolfuro isomerasi delle proteine (PDI) Anche in condizioni sperimentali ottimali, le proteine si ripiegano in modo più lento in vitro che in vivo a causa della formazione di ponti disolfuro non riscontrati nelle forme native. Tale constatazione condusse Anfinsen alla scoperta della PDI. PDI si lega a proteine non ripiegate mediante interazioni idrofobiche con residui superficiali; PDI ridotta catalizza il processo di scambio di ponti disolfuro (~2 min in RNasi); PDI ossidata catalizza la formazione iniziale dei ponti disolfuro in un polipeptide;

11 Chaperon molecolari Famiglia di proteine presente in tutti gli organismi, dai batteri all uomo; Si trovano in ogni compartimento cellulare; Rendono più efficiente il ripiegamento («folding») di altre proteine; Inoltre partecipano al mantenimento o alla creazione di uno stato di parziale denaturazione delle proteine, favorendone così il trasporto attraverso le membrane dei mitocondri o dei plastidi (nel caso delle cellule vegetali).

12 Chaperon molecolari Esistono due classi di chaperon molecolari: Chaperon veri e propri (Hsp70, Hsp90); Chaperonine o chaperon di II classe (GroEL/GroES nei procarioti; Hsp60/Hsp10 negli eucarioti). Hsp = «Heat shock proteins» (cioè «proteine da shock termico»), perché sono state rilevate durante studi di denaturazione delle proteine mediante calore. Il numero che segue indica il peso molecolare espresso in kd (kilodalton). 1 D = 1 uma = 1, kg.

13 Chaperon e chaperonine non sono separate tra loro, ma collaborano nel corretto folding delle catene polipeptidiche. N.B.: Dalla figura in alto potete notare che il complesso GroEL/GroES dei procarioti è identico al complesso Hsp60/10 presente negli eucarioti. Per quale motivo? TEORIA ENDOSIMBIONTICA: il mitocondrio deriverebbe da un batterio aerobio che si è adattato a vivere all'interno di una cellula eucariotica ancestrale anaerobia. Lynn Margulis, 1967

14 Meccanismi d azione delle chaperon Hsp70 (o dnak in E.Coli): molecolari 1. Le Hsp70 si legano all ATP nel loro dominio ammino-terminale (-NH₂) e assumono conformazione aperta. 2. Legame tra dominio carbossi-terminale (-COOH) delle Hsp70 e catene polipeptidiche nascenti ancora legate ai ribosomi; 3. Idrolisi dell ATP legato alle Hsp70 permette la chiusura di tali chaperon con successivo folding della proteina.

15 Meccanismi d azione delle chaperon molecolari Complesso GroEL/GroES (uguale al complesso Hsp60/Hsp10 del mitocondrio): GroEL: costituito da due anelli sovrapposti di sette subunità ciascuno con una cavità centrale dove vi è il sito di ripiegamento ATP-dipendente della proteina; GroES: costituito da un singolo anello di altre sette subunità che si dispone a cupola su GroEL; Non appena la proteina ha completato definitivamente il processo di ripiegamento, viene rilasciata da GroEL. GroES GroEL

16 Grande utilità delle chaperon molecolari Cellular homeostasis and stress survival requires maintenance of the proteome and suppression of proteotoxicity. Molecular chaperones promote cell survival through repair of misfolded proteins and cooperation with protein degradation machines to discard terminally damaged proteins. Hsp70 family members play an essential role in cellular protein metabolism by binding and releasing nonnative proteins to facilitate protein folding, refolding and degradation. L omeostasi cellulare e la sopravvivenza allo stress richiedono il mantenimento del proteoma e la soppressione della proteotossicità. Le chaperon molecolari garantiscono la sopravvivenza della cellula attraverso la riparazione di proteine mal ripiegate e la cooperazione con complessi di degradazione proteica al fine di eliminare le proteine terminalmente danneggiate. Le Hsp70, legando e liberando proteine non native per facilitare il folding proteico, il refolding e la degradazione, giocano un ruolo fondamentale nel metabolismo cellulare delle proteine. From Specification of Hsp70 Function by Type I and Type II Hsp40 by Douglas M. Cyr, Carlos H. Ramos, 09 Dec 2014

17 RIPIEGHIAMOCI! FLAVIO TRUSSO

18 Ripieghiamoci!

19 mm.. La proteina non si ripiega mica sola chaperon Controlla il corretto ripiegamento Viene particolarmente stimolata dal calore

20 Pronto.. ribosoma

21 ..All opera!

22 AMMINOACIDO AA + AA

23 AA + AA + AA AMMINOACIDO

24 ..Procedono i lavori Ottimo! Prima costruzione della proteina

25 Che bella proteina Andiamo alla grande!

26 Ma

27 Non c è voglia di lavorare

28 esempio E ci sono certi imprevisti!

29 Incidenti OOK! Oops normale Proteasi

30 Proteosoma Foro grande 7 7 Foro piccolo Concentrazione proteica ATPasica + riconoscimento

31 Ubiquitina

32 Ubiquitina ATP E1 E1 E2 E2 + E3 = Ubiquitina ligasi E3

33 Quindi.. Proteosoma ubiquitina

34 Processo

35 Capita però..

36 Amiloidosi PrPc : sensibile alla proteasi PrPsc: resistente alla proteasi

37 MISFOLDING Video 2 INSERIMENTO VIDEO VIDEO 1 WIeg

38 1. Proteina sierica precursore Formazione delle amiloidi Aumento dei foglietti beta Protofibrille 2.Fattori ambientali 3. Prioni Protofilamenti AMILOIDI

39 PROTEINA MALATTIA PATOGENESI MECCANISMO Emoglobina Anemia falciforme Aggregazione L emoglobina non correttamente ripiegata perde la sua funzionalità e la sua elasticità, causando seri danni alla circolazione sanguigna. CFTR Fibrosi cistica Trasporto Forme mutanti di CFTR non si dissociano dagli chaperoni e non raggiungono la Malattie da misfolding proteico membrana. Huntingtina M. di Huntington Aggregazione La ripetizione di p-glu più lunga porta alla formazione di aggregati cellulari insolubili. Proteina b-amiloide M. di Alzheimer Aggregazione Il peptide beta-amiloide non correttamente ripiegato si accumula nel tessuto nervoso umano, formando dei depositi noti come placche neuritiche. Proteina prionica (PrP) M. di Creutzfeld- Jakob Aggregazione Effetto a cascata in cui sempre più proteina viene convertita nella forma che determina la malattia. a-synucleina M. di Parkinson Aggregazione La proteina con avvolgimenti sbagliati si aggrega in masse sferiche (corpi di Lewy) P53 Tumori Trasporto P53 impedisce la divisione cellulare. Mutazioni di p53 portano ad un non corretto ripiegamento; le proteine p53 instabili sono distrutte.

40 Video 3 Morbo Di Alzheimer Video dex=7&list=pllfnin4gftd5toz1qfca0eoorwwv8kyi3 Tagliare da 1:31 a 2:10

41 SNPs coinvolti nella malattia di Alzheimer Esistono delle basi genetiche? Gene analizzato Varianti studiate ACT -51 G-T APO E Cys112Arg Arg158Cys HMGCR -911 C-A IL-1B -511 C-T IL G-A VEGF C-A

42 Prospettive future Uso di cellule staminali pluripotenti indotte Uso di osmoliti o di chaperone molecolari Uso di nanoparticelle funzionalizzate

43 L apice del misfolding delle proteine: la saga dei prioni Islanda, anni 50 SCRAPIE (eng. To scrape = grattare, scorticare) Lymph nodes from (a) healthy and (b) infected sheep - colouring with antibodies shows clear sign of scrapie prions in the intracellular tissue of the infected sheep IPOTESI VIRUS Smentita dagli studi di Stanley B. Prusiner (Nobel 1997)

44 «Prion diseases are transmissible, progressive and invariably fatal neurodegenerative conditions associated with misfolding and aggregation of a host-encoded cellular prion protein, PrP C» An overview of human prion diseases, Imran and Mahmood, Virology Journal 2011, 8:559 PrP C PrP Sc

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46 «Proteine infettive»: il contagio conformazionale

47 ma come è cominciato tutto? Cosa ha determinato la mutazione conformazionale della proteina PrP a parità di struttura primaria?

48 Classificazione delle malattie da prioni (PrDs): Sporadiche (85-90%) es. sporadic Creutzfeldt-Jacob disease (scjd), sporadic fatal insomnia (sfi) Acquisite (1-3%) es. iatrogenic CJD (icjd), Kuru, variant CJD (vcjd) Genetiche (10-15%)* es. Fatal familial insomnia (FFI), familial or genetic CJD (f/gcjd), Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome (GSS) Sporadiche Acquisite Genetiche PrDs *percentuali tratte dalla Review «Prion Diseases», L.T.Takada, M.D.Geschwind, Semin Neurol 2013;33:

49 PRNP Più di 30 mutazioni nell ORF del gene PRNP pathogenic point mutations Tratto da JKMS, «Genetic Studies in Human Prion Diseases, Byung-Hoon Jeong and Young-Sun Kim

50 Ricerca Topo knockout per PRNP: Sopravvivenza, immune a infezioni da prioni 258a 272a Capacità di sintesi enzima che «disattiva» PRNP Encefalite spongiforme senza sintomi, non letale Scomparsa spongiosi dopo 12 mesi

51 Encefalopatie spongiformi trasmissibili(tse) Le encefalopatie spongiformi trasmissibili sono un gruppo di malattie neurodegenerative che colpiscono l'uomo e gli animali, caratterizzate da un lungo periodo d'incubazione e da lesioni al SNC. Nei bovini:encefalopatia bovina spongiforme Nella pecora: Scrapie Nell'uomo: malattia di Creutzfeldt-Jakob La malattia di Creutzfeldt-Jakob descritta negli anni venti da Hans Creutzfeldt e Alfons Jakob è una rara patologia degenerativa del sistema nervoso centrale, caratterizzata da una progressiva demenza fatale.

52 Classificazione La MCJ sporadica La forma sporadica comprende circa l'80% dei casi di MCJ; inizialmente presenta dei sintomi aspecifici quali, perdita di peso, atassia, diturbi visivi come allucinazioni visive. Nella fase avanzata della malattia avremo comparsa di crisi epilettiche, coma, con una durata media della malattia di circa 6 mesi. Un ruolo fondamentale che causa la malattia è svolto da un polimorfismo al codone 129 del gene PRNP che regola la suscettibilità alla malattia. La diagnosi è definita solo post mortem dall analisi neuropatologica e/o dall analisi biochimica eseguita su tessuto cerebrale. Intra vitam la diagnosi è probabile se il paziente presenta una demenza, disturbi visivi o segni cerebellari, associato a un tracciato elettroencefalografico.

53 La MCJ familiare La MCJ familiare è legata a svariate mutazioni puntiformi del gene PRNP e si presenta con una sintomatologia simile alla forma MCJ sporadica ma con un esordio più precoce(intorno ai 45 anni). Caratterizzata da movimenti involontari e da demenza, la MCJ ha un decorso clinico che oscilla tra i 2 e i 10 anni.

54 La MCJ variante Nel 1996 è stata descritta nel Regno Unito la forma variante della MCJ legata al consumo alimentare di prodotti carnei contaminati dall agente infettivo responsabile dell encefalopatia spongiforme del bovino. Si discosta dalla forma classica di MCJ per la durata della malattia superiore ai sei mesi, per l'insorgenza della malattia con un'età media di 28 anni e per le caratteristiche cliniche di esordio di tipo psichiatrico (depressione, ansietà, apatia, illusioni). Fondamentale per la diagnosi clinica di vmcj è l'esecuzione della risonanza magnetica; si è visto che l'analisi del gene PRNP non ha identificato alcuna mutazione nè altre alterazioni di rilievo (inserzioni, delezioni), mentre tutti i casi sono risultati omozigoti per metionina al codone polimorfico 129 del gene PRNP.

55 Trattamenti Per la MCJ al momento non è stato dimostrato alcun trattamento efficace, la malattia è sempre fatale e la ricerca per una nuova cura continua. Tuttavia esistono dei farmaci da somministare ai pazienti affetti da MCJ con funzione di ridurre le convulsioni nervose, spasmi muscolari e crisi epilettiche dovute a stadi avanzati della malattia.

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62 MALATTIA NEURODEGENERATIVA EZIOLOGIA EPIDEMIOLOGIA SINTOMI TERAPIE INTERVENTO (NEUROCHIRURGIA STEREO-TASSICA) MORBO DI PARKINOSN

63 EZIOLOGIA Genetica Accumulo amiloidale ROS Infettiva Tossica

64 EPIDEMIOLOGIA Maggiore nei maschi Età di esordio circa: 50 / 55 anni

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66 TERAPIE Precursori dopamina (L-Dopa) Dopamino-agonisti Chirurgica (tramite elettro stimolazione)

67 DEEP BRAIN STIMULATION Video 4

68 TO be CONTINUED

69 Credits bibliografia/sitografia. -JOURNAL OF VIROLOGY, Feb.1993,p.643 Byron Caughey- Gregory Jay Reymond -Current Therapeutic Research Volume 66.Number 6 November/December 2005 Peter Gosh-Jack Edelman -National Academy Science USA oct 1998 Larisa Cervenàkova- Ralph Garruto-Lev G.-Goldfarb-Hee Suk Lee-Paul Brown. Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter Biologia molecolare della cellula Quinta edizione Harvey Lodish, A Berk, C.A. Kaiser, M. Krieger, M.P. Scott, A. Bretscher, P. Ploegh, Paul Matsudaira Biologia molecolare della cellula Terza edizione italiana condotta sulla sesta edizione americana Majno - Joris, Editore: Casa Editrice Ambrosiana, Edizione: II 5/2009, Volume: Unico Cellule, tessuti e malattia - Principi di patologia generale

70 Credits Donald Voet, Judith G Voet, Charlotte W Pratt Fondamenti di biochimica Terza edizione italiana condotta sulla quarta edizione americana -Pocchiari M, Ladogana A. La malattia di Creutzfeldt-Jakob. Aspetti clinici ed epidemiologici. - Collinge J, Sidle KC, Meads J, Ironside J, Hill AF. Molecular analysis of prion strain variation and the etiology of new variant CJD. Nature 1996;383: Zanusso GL, Ferrari S, Rizzuto N, Monaco S. Malattie da Prioni umane: etiologia, patogenesi e aspetti clinicopatologici. Brescia Medicina 2000;3-4: "An overview of human prion diseases", Muhammad Imran and Saqib Mahmood, Virology Journal 2011, 8:559 -"Prions and Prion-Like Pathogens in Neurodegenerative Disorders", Caterina Peggion, Maria Catia Sorgato and Alessandro Bertoli, Pathogens 2014, 3,

71 Credits -"Genetic Studies in Human Prion Diseases", Byung-Hoon Jeong and Yong-Sun Kim, J Korean Med Sci 2014, 29, "Prion Diseases", Leonel T. Takada and Michael D. Geschwind, Semin Neurol 2013, 33: "Cellule, tessuti e malattie. Principi di patologia generale", Isabelle Joris and Guido Majno "Biologia e Genetica", 2009, II edizione, De Leo, Ginelli, Fasano. 09http://flipper.diff.org/app/items/ / 7/Lezione_2_malattie_da_accumulo_proteinopatie.pdf