La vera storia dei terreni di coltura e della microbiologia moderna comincia con. Robert Koch ( )

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1 La vera storia dei terreni di coltura e della microbiologia moderna comincia con Robert Koch ( ) Autore della teoria del germe (un germe una malattia) Autore dei celeberrimi postulati Scoprì la causa dell antrace, del colera, della tubercolosi.. Nel 1905 gli fu assegnato il Nobel per la medicina

2 Ma nel 1870 era solo un medico di campagna di 27 anni a Wollstein, una cittadina di provincia tra Berlino e Breslavia cercava di individuare la cause del carbonchio lavorando a casa, con mezzi di fortuna Come ufficiale sanitario aveva accesso alle carcasse del bestiame I suoi lavori sull antrace gli valsero riconoscimenti e, nel 1880 ottenne la direzione di un laboratorio, a Berlino, dove occuparsi di altri patogeni importanti

3 Fino a quel momento l unico approccio possibile per ottenere colture axeniche era diluire le colture ripetutamente fino ad ottenere una sola specie campione 1-10 cellule: Probabilmente puro 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

4 Lavorare su colture pure, però era necessario quanto difficile e il suo laboratorio divenne una sorta di cucina per microbi durante questi studi vennero messe a punto le tecniche per l asepsi, necessarie per garantire le colture e la sicurezza provò le fette di patata, ma non tutti i microbi ci crescevano provò la gelatina per solidificare i brodi e poter ottenere colture pure

5 all inizio la gelatina veniva colata su lastre che si mettevano sotto campane di vetro Ogni volta che si cercava di osservare le colture si correva il serio rischio di contaminarle poi Julius Richard Petri mise a punto le prime piastre la gelatina però aveva molti difetti liquefa spontaneamente al disopra dei 28 C E molte specie batteriche possono digerirla

6 La soluzione a questi problemi venne dalla cucina orientale Walther Hesse, un collaboratore di Koch, notò come i budini di sua moglie, Fannie Angelina Eilshemius restassero solidi anche con il caldo Il segreto di Fannie era in un alga rossa Una sua vicina olandese, vissuta a lungo a Java, le aveva insegnato l uso di un solidificante diverso

7 L AGAR_AGAR Si estrae da alghe rosse Gracilaria È dotato di due caratteristiche particolari Gelidium ISTERESI La temperatura di fusione e quella di solidificazione non coincidono SINERESI Nel congelamento i cristalli di ghiaccio forzano le molecole di polimero a riunirsi in fibre

8 dopo il 1882, anno in cui fu introdotto l uso dell agar Lo studio dei terreni adatti per lo studio dei batteri divenne fiorente Per formulare un buon terreno di coltura bisogna conoscere le esigenze dei batteri Energia, nutrienti, condizioni di incubazione ideali

9 UN TERRENO IDONEO DEVE: Comprendere tutti i nutrienti necessari alle specie da coltivare Avere un ph adatto Per far crescere i microrganismi che interessano Un potenziale redox idoneo Un giusto grado di umidità Essere sterile Per non farne crescere altri

10 NUTRITIVI (minimi o complessi) ELETTIVI Favoriscono la crescita di una particolare specie batterica TERRENI SELETTIVI favoriscono la crescita di un gruppo a scapito di altri DIFFERENZIALI Permettono di distinguere gruppi di microrganismi

11 TERRENI MINIMI Chimicamente definiti Utili per studi di fisiologia batterica Es: capacità metaboliche C N P oligo Utili per studi di genetica microbica Es: selezione di mutanti Basso tenore di ferro Siderofori fluorescenti (Pseudomonas) Nei terreni sintetici è possibile creare condizioni idonee all espressione di particolari caratteristiche

12 I TERRENI COMPLESSI a base di peptoni, estratti di carne o di lievito ottenere biomassa conte batteriche Si usano per far crescere la maggior parte dei microrganismi Osservare caratteristiche morfologiche Mobilità particolari (sciamamenti, Proteus) Pigmenti Janthinobacterium lividum: violaceina Es. TSA (a base di idrolisato triptico di Soia) Es. LB (Lysogeny Broth) relativamente povero

13 SUPPLEMENTI alcuni microrganismi hanno richieste particolari FA (fattori di accrescimento) se il terreno non contiene il composto richiesto deve essere supplementato Agar-cioccolato (sangue cotto) Es. Agar-sangue Su agar-sangue si può osservare l eventuale presenza e il tipo di emolisi

14 AGENTI DETOSSICANTI alcuni microrganismi sono molto delicati Alcuni normali componenti dei terreni di coltura li intossicano È necessario aggiungere al terreno componenti protettivi Come, per esempio, carbone vegetale Es.Legionella Bordetella

15 Un terreno SELETTIVO ostacola la crescita di microrganismi diversi da quelli che si vogliono ottenere M.tuberculosis può essere coltivato su terreni a base di latte uova fecola di patate... La sua crescita molto lenta rende necessario aggiungere al terreno un antifungino Verde di malachite

16 Un terreno selettivo può essere reso anche DIFFERENZIALE, con l aggiunta di uno o più test biochimici Un esempio di terreno selettivo-differenziale: McConkey per enterobatteri Es. Salmonella, lattosio - Es. E. coli, lattosio + Sali biliari (selezionano i batteri capaci di sopravvivere nell intestino) cristal violetto (inibisce i batteri Gram-positivi) zucchero fermentabile (agente differenziale): lattosio Indicatore: Rosso neutro (rosso violaceo in campo acido)

17 HEKTOEN selettivo-differenziale per enterobatteri Ha una forza selettiva maggiore del McConkey, è stato ideato per Salmonella e Shigella; alcuni enterobatteri, tra cui E. coli, crescono in modo stentato gli zuccheri fermentabili sono tre (lattosio saccarosio, salicina), gli indicatori di ph sono 2 Blu di bromotimolo (BBT) e indicatore di Andrade C è un sistema di rivelazione di H 2 S Il BBT è giallo in campo acido, verde a ph neutro e blu in campo alcalino; l idicatore di Andrade passa da incolore a rosso a ph 5,5

18 Fermentazioni + +/H2S- Es. E. coli Fermentazioni H2S+ es. Salmonella Fermentazioni e H2Ses. Shigella Fermentazioni +++/H2S- Es. Klebsiella Fermentazioni + /H2S-

19 Levine (EMB) selettivo e differenziale per E. coli (controllo delle acque) blue di metilene impedisce la crescita dei Gram-positivi Sali biliari lattosio + eosina E. coli cresce con colonie verde metallico Carcare immagini EMB o Levine o Eosine methylene blue Lac- E. coli Lac+

20 I terreni differenziali servono per raggiungere un identificazione su base fenotipica Strategie di produzione di energia Prodotti finali della fermentazione Degradazione di composti complessi

21 Terreni per identificazione Per rivelare alcune caratteristiche biochimiche Raggiungere l identificazione di specie Caratteristiche legate alla produzione di energia Test della citocromo-ossidasi Tipo di catena respiratoria fermentazioni OF-test Riduzione dei nitrati Rosso metile Test di Voges Proskauer Analisi dei substrati fermentabili e produzione di gas Tipo di metabolismo:fermentazione o ossidazione di uno zucchero Capacità o meno di usare il nitrato come accettore terminale di elettroni Tipo di fermentazione ad acidi misti Tipo di fermentazione butanediolica

22 IDENTIFICAZIONE Sulle colonie isolate, oltre all esame microscopico, si possono effettuare direttamente alcuni test Citocromo C- ossidasi La presenza del citocromo C identifica uno dei due tipi di catena respiratoria che si trovano tra i batteri Il Citocromo C- può ossidare un substrato artificiale (tetra o dimetil-p-fenilendiamina) Che assume un colore blu (tetrametil-) o marrone (dimetil-) Negativo: es. E. coli; positivo es. Pseudomonas

23 Metabolismo-1 FERMENTAZIONE Batteri che possiedono un metabolismo fermentativo Terreno base+ zucchero 1-0,5%+ indicatore + campanella Indicatore rosso fenolo, giallo in campo acido rosso a ph neutro A) Capacità di usare un carboidrato come donatore di elettroni in un processo di fermentazione B) Produzione o meno di gas nel processo

24 Test della catalasi (capacità di detossicazione da H 2 O 2 ) Si emulsiona la coltura in una goccia acqua ossigenata con uno stuzzicadenti di legno + -

25 PRODOTTI FINALI DI FERMENTAZIONI (VP) Le specie con una fermentazione BUTANEDIOLICA (es. Klebsiella) producono acetil-metil-carbinolo (prodotto intermedio) durante la fermentazione del glucosio Si individuano con la reazione di Voges-Proskauer Aggiungendo alpha-naftolo e KOH 40% POSITIVO Es Klebsiella Enterobacter NEGATIVO Es. Escherichia Salmonella

26 Mette in evidenza la capacità di usare NO 3 come accettori di elettroni RIDUZIONE DI NITRATI A NITRITI Si aggiunge acido alphanaftilamino-sulfanilico Se la reazione è negativa si aggiunge Zn 0 POSITIVO NEGATIVO Non riduzione di NO 3 riduzione di NO 3 N 2

27 Capacità di utilizzare come fonti di carbonio i sali degli acidi se l acido viene metabolizzato il ph aumenta (oltre 8) CITRICO MALONICO MUCICO ACETICO L indicatore blu di bromotimolo vira al blu NEGATIVO POSITIVO

28 PRODUZIONE DI INDOLO Alcuni microrganismi producono indolo a partire dal triptofano La reazione si ottiene aggiungendo il reattivo di Kovàcs (p-dimetilaminobenzaldeide in alcol isoamilico e HCl) a una coltura di 18-24h L alcol isoamilico si stratifica sulla fase acquosa del terreno e estrae l indolo che reagisce con la p- dimetilaminobenzaldeide formando un composto di un rosso acceso POSITIVO E.coli NEGATIVO Salmonella

29 DEAMINAZIONE DI AMINOACIDI Proteus Providencia Morganella Producono aminoacido-ossidasi aspecifiche, che deaminano tutti gli aminoacidi Alcuni prodotti di deaminazione reagiscono con FeCl 3 dando composti colorati TRIPTOFANO A. INDOLPIRUVICO FENILALANINA A. FENILPIRUVICO

30 H 2 S può essere prodotto durante i processi DESOLFORAZIONE RIDUZIONE DI SOLFATI La produzione di H 2 S risente del ph del terreno: un eccesso di acido la inibisce PRODUZIONE DI H 2 S Si mette in evidenza inoculando per infissione in terreni ricchi in sali di ferro NEGATIVO Es Escherichia Shigella POSITIVO Es. Proteus Salmonella

31 Decarbossilazione di aminoacidi Lisina-Decarbossilasi Ornitina-Decarbossilasi Arginina-Diidrolasi NEGATIVO POSITIVO DUBBIO Prolungare l incubazione ricontrollare fermentazione del glucosio

32 ONPG ADH LD OD C H 2 S U TDA I VP GEL MN INO SOR RHA SUC MEL AMY ARA * * * * ONPG ADH LD OD C H 2 S U TDA I VP GEL MN INO SOR RHA SUC MEL AMY ARA V ONPG ADH LD OD C H 2 S U TDA I VP GEL MN INO SOR RHA SUC MEL AMY ARA * V *