PROGRESS IN STEM CELL BIOLOGY AND MEDICAL APPLICATIONS 12/01/13

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1 PROGRESS IN STEM CELL BIOLOGY AND MEDICAL APPLICATIONS Fare clic Stresa per modificare maggio 2009 lo stile del sottotitolo dello schema

2 Self-renewal vs differentiation

3 Controllo del self renewal mediante fattori di trascrizione La pluripotenza delle cellule staminali è determinata dalla espressione di fattori di trascrizione quali Oct4, Sox 2 e Nanog

4 Funzione di Nanog L espressione di Nanog nelle ES è legata al self renewal Una downregulation di Nanog predispone alla differenziazione L assenza di Nanog aumenta la frequenza di differenziazione, ma di per sé non è in grado di indurre il commitment Pertanto Nanog promuove il self renewal ma non è indispensabile

5 Nanog e le cellule germinali La espressione di Nanog è indispensabile per la formazione di cellule germinali.

6 Ipotesi: Nanog legato alla inattivazione del cromosoma X, che non avviene nelle ES in quanto XIST non è attivato

7 Le proteine Oct4, Sox 2 e Nanog si legano sulla regione cromatinica di XIST, e lo reprimono. In assenza di Nanog, XIST è parzialmente derepresso. In assenza di Oct-4 Nanog e Sox2 non possono più legarsi a XIST che viene così completamente espresso.

8 Ruolo del mirna nella funzione delle stem cells mirna: small, non coding RNAs che regolano la espressione proteica legandosi al 3 UTR di mrna target e inibendone la traduzione. Alcuni mirna della famiglia mir-17 agiscono controllando la differenziazione delle stem cells a livello del pathway di STAT3. Questi mirna sono espressi durante il differenziamento e agiscono inibendo STAT3. L inibizione degli mirna, al, contrario, blocca

9 Approccio chimico alla biologia della cellula staminale L identificazione delle molecole in grado di regolare il self-renewal delle cellule staminali è un punto cruciale per l uso di tali cellule in medicina rigenerativa Tra le strategie per la identificazione di tali molecole, un ruolo importante è giocato dalla analisi chimica.

10

11 Approccio per la identificazione di molecole coinvolte nel self-renewal High-throughput screening di molecole di sintesi utilizzando una linea murina di ES esprimente la GFP sotto controllo degli elementi regolatori del gene Oct4 Identificazione di Xu et al., 2008

12 Xu et al., 2008

13 La pluripontina Sostiene il self renewal spontaneo di ES murine a lungo termine in assenza di siero, LIF o altre sostanze comunemente utilizzate nella coltura delle ES Agisce indipendentemente dalla attivazione esogena dei pathways canonici LIF STAT3, BMP SMAD-ID and WNT β-catenin

14 Target molecolari della pluripontina Proteine endogene che stimolano la attività differenziativa: RasGAP extracellular-signal-regulated kinase 1 (ERK1) La inibizione simultanea di RasGAP e ERK1 è sufficiente a garantire un self-renewal a lungo termine.

15 Xu et al., 2008

16 Cellule staminali e terapia genica Fare clic per modificare lo stile del sottotitolo dello schema

17 I principali limiti dei protocolli di terapia genica Difficoltà a mantenere una espressione a lungo termine del trascritto terapeutico Rischio di risposta immune verso le cellule usate per il trapianto, verso il vettore o verso il prodotto proteico del gene terapeutico Difficoltà nel regolare la espressione del transgene Rischio di mutagenesi inserzionale

18 Il principale limite dell uso della terapia con cellule staminali nelle Inutilità di un trapianto autologo in cui malattie genetiche utilizzino cellule del paziente portatrici della mutazione responsabile della patologia Rischio di risposta immune in caso di trapianto eterologo

19 La nuova prospettiva per la gene therapy del futuro Combinare la capacità di transdifferenziazione e di self renewal delle cellule staminali con la possibilità di modificare geneticamente le stesse allo scopo di riparare il difetto genico e poter procedere a trapianti autologhi

20 Distrofia Muscolare di Duchenne Malattia X-linked recessiva Incidenza: 1:3500 maschi Caratterizzata da progressivo deterioramento della struttura e funzione muscolare con esordio dagli arti inferiori Gene: DMD (2 Mb)

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24 2006: Gene therapy della DMD in cani Golden Retriever Trapianto intrarterioso di mesangioblasti (stem cells associate ai vasi sanguigni) Due protocolli: Trapianto autologo con cellule transfettate con lentivirus in grado di esprimere una microdistrofina Trapianto eterologo con cellule wild type da cani donatori

25 Risultati

26 Problemi riscontrati Non efficacia del trapianto autologo con transfezione lentivirale Peggioramento clinico dopo sospensione della terapia immunosoppressiva in quasi tutti gli animali sottoposti a trapianto eterologo

27 2009: progetto per un rotocollo terapeutico nell uomo Cellule utilizzate: CD133+ Proprietà delle CD133+ Cellule del sangue presenti in numero di ogni 15 cc Capacità di fondersi con le cellule muscolari e di acquisire capacità di self renewal Riparazione del difetto genico mediante exonskipping del gene DMD

28 Sperimentazione clinica con CD133+ Cellule CD133+ di derivazione muscolare sono state trapiantate in otto pazienti con distrofia di Duchenne in un trial di fase I a doppio cieco di 7 mesi. La sicurezza del trapianto con cellule staminali è stata effettuata valutando la forza muscolare e l istologia muscolare, la funzione cardiaca e polmonare. Nessun effetto collaterale osservato nei

29 Exon skipping

30 Protocollo di exon-skipping

31

32 Terapia genica della epidermolisi bollosa Fare clic per modificare lo stile del sottotitolo dello schema

33 Le cellule staminali epiteliali Cellule staminali della pelle: Garantiscono il rinnovo completo della nostra pelle che si completa ogni 25 gg Coltivabili a partire da singole cellule, in grado di produrre olocloni Un singolo oloclone è in grado di generare 1045 cellule, capaci di ricoprire 1030 mq umani

34 Uso delle staminali epiteliali in terapia Terapia delle ustioni Utilizzate da circa 20 anni Trattati bambini con ustioni fino al 95% della superficie corporea Terapia delle degenerazioni corneali 250 pz. trattati, con follow up a 5 anni 70% di successo Un nuovo utilizzo terapeutico delle staminali epiteliali:

35 Epidermolisi bollose Famiglia di gravi patologie della pelle causate da difetti di adesione dermaepidermide Classificate in: simplex (EBS), giunzionale (EBG) Distrofica (EBD)

36 Epidermolisi bollosa giunzionale Fragilità della pelle e delle mucose con formazione spontanea di bolle 2 forme: Herlitz (letale) Esordio alla nascita Associazione con malformazioni urogenitali

37 Genetica della EBG

38 Caso clinico Paziente di 37 con forma grave di epidermolisi bollosa giunzionale Trovate cellule staminali in grado di produrre olocloni solo sul palmo delle mani Cellule staminali trasfettate con una efficienza del 95% con un vettore retrovirale MLV derived clinical grade ( ) contenente la completa regione codificante del gene LAMB3

39 Risultati A 8 gg dal trapianto, inizio delle rigenerazione della pelle A 3 anni di follow up perfetto attecchimento nelle zone sottoposte a trattamento, senza effetti collaterali Analisi in LM-PCR per analizzare i siti di inserzione: Intera epidermide ottenuta dopo il trapianto retta dalla attività di sole 30 cellule staminali

40 Problematiche future Il maggior problema attuale della terapia cellulare in fase clinica con cellule staminali è dato dai costi. Le cellule staminali sono state equiparate a farmaci, e pertanto una struttura che faccia uso di tali cellule a scopi terapeutici deve soddisfare, per i regolamenti della comunità europea, gli stessi requisiti richiesti per la produzione e la gestione commerciale di un farmaco

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