Prodotti lattiero caseari attività di ricerca in sicurezza alimentare

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1 la valorizzazione del prodotto alimentare Prodotti lattiero caseari attività di ricerca in sicurezza alimentare Lucia Decastelli S.C. Controllo Alimenti e Igiene delle Produzioni

2 IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta La rete degli IIZZSS IZSPLV è un istituto pubblico parte integrante di un sistema nazionale di istituti sparsi su tutto il territorio italiano. Ha il compito di fornire supporto tecnico scentifico a livello regionale e nazionale per quanto riguarda la sanità e il benessere animale, l igiene e la sicurezza alimentare.

3 IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta Attività di un Istituto Zooprofilattico Sperimentale LE ATTIVITA dell IZS PLV CONTROLLO UFFICIALE Sicurezza alimentare Sanità animale ATTIVITA DI RICERCA Sicurezza alimentare Sanità animale ATTIVITA DI FORMAZIONE del personale del Sistema Sanitario Nazionale e degli operatori del settore alimentare

4 IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta 1)STUDI di comportamento e CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI CEPPI DI Staphylococcus aureus 2) Caratterizzazione dei prodotti

5 IZSTO Introduzione manipolazione Materiale e Metodi Materie prime Fonte di contaminazione Risultati Ambienti di lavorazione relazione genetica tra ceppi isolati in in uno stabilimento riconoscere le le fonti di di contaminazione Conclusioni strategie di di prevenzione e controllo

6 IZSTO Introduzione Materiale e Metodi Campionamenti campioni totali: 14 lattiero caseari 8 tamponi/sponge ambientali Conteggio degli Stafilococchi Coagulasi Positivi (SCP) secondo la metodica ISO :1999 Risultati Conclusioni Tipizzazione fenotipica e genotipica

7 IZSTO I ceppi isolati sono stati caratterizzati Prove fenotipiche: Biotipizzazione (Devriese et al., 1984) Introduzione Prove genotipiche: ricerca di geni codificanti tossine tramite multiplex-pcr Materiale e Metodi (De Buysier et al., 2009) PFGE (Murchan et al., 2003) Spa-typing (Strommenger et al. 2006) Risultati Conclusioni

8 IZSTO I ceppi isolati sono stati caratterizzati Prove fenotipiche: Biotipizzazione (Devriese et et al., al., 1984) Introduzione Protocollo di di biotipizzazione Presenza di di stafilochinasi Materiale e Metodi Coagulazione del plasma bovino Tipo di di crescita al al cristalvioletto Risultati Produzione di di β-emolisina Combinazione degli esiti: Conclusioni specificità d ospite (bovino, ovino, umano) Ospite non specifico (da NHS1 a NHS6)

9 IZSTO I ceppi isolati sono stati caratterizzati Prove genotipiche Introduzione Ricerca di geni codificanti tossine tramite multiplex-pcr (De Buysier et al., 2009) Pulsed Field Gel Electrophoresis (Murchan et al., 2003) Materiale e Metodi Spa-typing seq.regione polimorfica X proteina A (Strommenger et al. 2006) Restrizione smai Risultati Conclusioni

10 IZSTO Prove fenotipiche: biotipizzazione ID Anno Matrice Biotipo ID Anno Matrice Biotipo Introduzione A latte crudo NHS6 A formaggio BOVINO A vasca cagliata NHS5 A formaggio NHS5 A vasca cagliata NON BIOTIPIZZ A salamoia NHS5 Materiale e Metodi A asse asciugatura BOVINO A asse asciugatura NHS5 A asse asciugatura NHS5 B formaggio NHS4 B formaggio BOVINO B formaggio NHS5 A asse stagionatura BOVINO B formaggio BOVINO Risultati A asse asciugatura NHS5 A asse asciugatura NHS5 B formaggio NHS5 B formaggio NHS5 Conclusioni A formaggio NHS5 B formaggio BOVINO A siero NHS6 7/22 ospite-specifico: bovino 14/22 non ospite-specifico NHS4 NHS5 NHS6 1/22 non biotipizzabile B formaggio BOVINO

11 IZSTO Prove fenotipiche: biotipizzazione ID Anno Matrice Biotipo ID Anno Matrice Biotipo Introduzione A latte crudo NHS6 A formaggio BOVINO A vasca cagliata NHS5 A formaggio NHS5 A vasca cagliata NON BIOTIPIZZ A salamoia NHS5 Materiale e Metodi A asse asciugatura BOVINO A asse asciugatura NHS5 A asse asciugatura NHS5 B formaggio NHS4 B formaggio BOVINO B formaggio NHS5 A asse stagionatura BOVINO B formaggio BOVINO Risultati A asse asciugatura NHS5 A asse asciugatura NHS5 B formaggio NHS5 B formaggio NHS5 Conclusioni A formaggio NHS5 B formaggio BOVINO A siero NHS6 7/22 ospite-specifico: bovino 14/22 non ospite-specifico NHS4 NHS5 NHS6 1/22 non biotipizzabile B formaggio BOVINO

12 IZSTO Prove fenotipiche: biotipizzazione ID Anno Matrice Biotipo ID Anno Matrice Biotipo Introduzione A latte crudo NHS6 A formaggio BOVINO A vasca cagliata NHS5 A formaggio NHS5 A vasca cagliata NON BIOTIPIZZ A salamoia NHS5 Materiale e Metodi A asse asciugatura BOVINO A asse asciugatura NHS5 A asse asciugatura NHS5 B formaggio NHS4 B formaggio BOVINO B formaggio NHS5 A asse stagionatura BOVINO B formaggio BOVINO Risultati A asse asciugatura NHS5 A asse asciugatura NHS5 B formaggio NHS5 B formaggio NHS5 Conclusioni A formaggio NHS5 B formaggio BOVINO A siero NHS6 7/22 ospite-specifico: bovino 14/22 non ospite-specifico NHS4 NHS5 NHS6 1/22 non biotipizzabile B formaggio BOVINO

13 IZSTO Introduzione Prove genotipiche: mpcr 13 isolati geni codificanti target metodi analitici 22 campioni totali A1-A14: Campionamenti B1-B8 Campionamenti 2012 Materiale e Metodi Risultati Conclusioni

14 IZSTO Prove genotipiche: PFGE e SPA-TYPING Introduzione Analisi del dendrogramma della PFGE e esiti spa-typing Materiale e Metodi Risultati Conclusioni XV Congresso Nazionale S.I.Di.L.V, Monreale (PA), Ottobre 2013

15 IZSTO Introduzione 22 isolati Materiale e Metodi individuati 6 pulsotipi similarità 100% Risultati Conclusioni

16 IZSTO Introduzione 3 cluster Materiale e Metodi Risultati Conclusioni correlazione dei 22 ceppi Cluster A, B e C. A e B raggruppano due isolati ciascuno con identico profilo cluster C è costituito da 18 pulsotipi con una similarità maggiore del 75%

17 IZSTO Introduzione 2 isolati t164 8 isolati t524 Materiale e Metodi Risultati 10 isolati t isolati t isolati t024 Conclusioni

18 IZSTO Tipizzazione S.aureus: analisi dei profili molecolari Introduzione Materiale e Metodi Risultati Conclusioni 2 isolati appartenenti al profilo di tipo III biotipo Bovino -> 2011 (asse asciugatura) e 2012 (formaggio) biotipo bovino 6 isolati appartenenti al profilo di tipo II biotipo non ospite specifico -> Isolamento sia nel 2011 sia 2012 (superfici di lavorazione e formaggio) biotipo NHS5 -> Resistenza nel corso dei due anni in allevamento e caseificio -> Ricondotto a Procedure pulizia e sanificazione inadeguate o non correttamente -> Ipotesi Presenza costante nei capi in lattazione -> non sottovalutare gene codificante enterotissina D implicata maggiormente nei casi di MTA (rischio consumatori) Profilo Molecolare N ceppi SEs Spa- Type PFGE profile I 2 (A1, A3) seg, sei t164 3 II 6 (A2, A5, A8, A14, B3, B5) sed, ser, sej t III 2 (A4, B2) neg t524 4 IV 2 (A6, A10) sea, sed, ser, sej t V 2 (A7, A12) neg t524 5 VI 2 (A9, A13) sed, ser, sej t VII 1 (A1) sed, ser, sej t524 6 VIII 1 (B1) sed, ser, sej t024 6 IX 1 (B4) neg t524 1 X 1 (B6) ser, sej t XI 1 (B7) neg t524 2 XII 1 (B8) sea, ser t524 2

19 IZSTO Tipizzazione S.aureus: Overview metodi fenotipici Vs Genotipici Introduzione Applicazione dei metodi di tipizzazione INDAGINI EPIDEMIOLOGICHE Materiale e Metodi Risultati Cluster mpcr Biotipo Analisi epidemiologica Epidemiologia molecolare tipizzazione riproducibilità? potere discriminatorio? Conclusioni Le analisi molecolari, ed in particolare il loro utilizzo integrato, risultano essere oggi il metodo di tipizzazione di elezione vista la notevole variabilità genetica delle popolazioni di S.aureus, anche nel contesto di una piccola realtà aziendale artigianale come quella analizzata, studio pilota per l impiego strutturato sia nei casi di MTA come stiamo già indirizzando le nostre attività, sia per le analisi epidemiologiche, a tutela della sicurezza dei consumatori e la conformità dei prodotti alimentari.

20 La rete degli II.ZZ.SS. Valutazione del rischio su base scientifica Reg. CE 2073/2005 e succ. modifiche Art. 3 comma 2: gli OSA effettuano studi Art. 5 comma 5: analisi degli andamenti. Esportazione degli alimenti USA: validazione dei processi produttivi (RTE) Canada: validazione della Shelf life Australia: validazione dei processi produttivi (latte crudo) India, Brasile, Giappone, Russia

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22 Sito operativo Sito divulgativo Sita3 Dedicato agli operatori che si occupano di «alimentare» il sito Ars-alimentaria Area pubblica a disposizione del cittadino Area riservata accessibile unicamente con password. A disposizione di: Ministero, Regione, altri operatori del SSN, Consorzi, singolo produttore,..

23 Ad accesso libero, a disposizione del cittadino e del consumatore Finalità: attività didattica, divulgativa, informazione sul consumo domestico dei cibi e possibili rischi correlati, proprietà nutrizionali degli alimenti, proprietà funzionali, identità di specie correlate sia ad aspetti sanitari che religioso culturali.

24 Classificazione di prodotti e produzioni in macrocategorie Macrocategorie Categorie Categorie di alimenti indicate nei Regolamenti Comunitari

25 Accessibile unicamente attraverso password A disposizione di: Ministero, Regione, operatori del SSN, Consorzi, singolo produttore,..

26 Inserimento dei protocolli e delle relazioni finali delle sperimentazioni Standard di prodotto di ogni produttore e di processo di ogni prodotto (condizioni di variabilità accettata) QR Code (quick response ): barcode bidimensionale per accedere ai protocolli tramite cellulare/smartphone Grafici di microbiologia predittiva Grafici relativi a standard di processo e di prodotto Grafici relativi a comportamento di patogeni in produzioni contaminate (challenge test)

27 Problematiche igienico sanitarie dei prodotti lattiero caseari italiani destinati all export, con particolare interesse per i mercati extra europei. Validazione igienico sanitaria dei processi di produzione Validazione igienico sanitaria della shelf life Rispetto dei requisiti internazionali: Australia, Giappone, India, Russia

28 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Studio di processi produttivi Raccolta dei processi produttivi e sopralluogo presso gli stabilimenti per singolo produttore Riproduzione delle condizioni di stagionatura in laboratorio (camere climatiche) Analisi microbiologiche e merceologiche Analisi dei dati con modelli di microbiologia predittiva Robiola di Roccaverano Bra duro Macagn Crosta rossa Toma al lait brusc. Salame Cuneo Salame Cotto

29 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Compilazione Scheda di Prodotto ASPETTO DEL PRODOTTO Categoria Durata stagionatura Forma e dimensioni Aspetto esteriore: Crosta Superficie Colore Aspetto pasta Colore Struttura Consistenza Occhiatura Erborinatura, evidenza di spezie Peso Uniformità delle forma prodotte Presentazione del prodotto al consumatore INGREDIENTI Latte: specie caldo/refrigerato n di mungiture Innesti tipo (siero- latto-innesti,liofilizzati) specie Caglio o coagulante specie (bovino, ovicaprino,,vegetale) stato (liquido, in pasta) Altri ingredienti Sale

30 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Compilazione Scheda di Processo DESCRIZIONE DELLE FASI CON INDICAZIONE DI TEMPO E TEMPERATURA (es. Toma Lait Brusc) Stoccaggio latte della sera in caldaia Raffreddamento lento (8-12 ore) Scrematura Eventuale aggiunta munta mattino Riscaldamento del latte a C e aggiunta del caglio Fase di riposo per 60 minuti Rottura della cagliata a chicco di riso (2-3 mm) Raccolta con tele e sgrondo (15 ) Impasto manuale della cagliata Pressione in stampi (24 ore con 3 ribaltamenti) Salatura a secco (12 ore/faccia) Stagionatura 2-5 mesi

31 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Analisi microbiologiche, microbiologia predittiva Studi di shelf-life Studi di challenge-test

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39 Conclusioni Attività IIZZSS Promuovere attività di ricerca integrata in base alle esigenze del territorio Promuovere Formazione con SSN e OSA Sostenere OSA per Esportazione degli alimenti USA: validazione dei processi produttivi (RTE) Canada: validazione della Shelf life Australia: validazione dei processi produttivi (latte crudo) India, Brasile, Giappone, Russia 39

40 IZSTO Parte del progetto ricerca corrente finanziato dal Ministero della Salute (9RC11) Si ringrazia il personale S.S. Controllo Alimenti S.S. Batteriologia Specializzata

41 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Studio di processi produttivi Raccolta dei processi produttivi e sopralluogo presso gli stabilimenti per singolo produttore Riproduzione delle condizioni di stagionatura in laboratorio (camere climatiche) Analisi microbiologiche e merceologiche Analisi dei dati con modelli di microbiologia predittiva Robiola di Roccaverano Bra duro Macagn Crosta rossa Toma al lait brusc. Salame Cuneo Salame Cotto

42 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA PAT oggetto dello studio Formaggio a crosta rossa Toma al lait brusc 2 produttori 3 produttori

43 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Compilazione Scheda Anagrafica Azienda/Stabilimento Ragione Sociale Indirizzo: Via N.. Località: C A P Comune PROV.. Telefono Fax.. sito web Titolare/Responsabile Partita IVA Codice fiscale:. Codice Aziendale /_/_/_/ /_/_/_/ Bollo CEE I / _ CE Matricola Consorzio /_/_/ /_/_/_/

44 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Compilazione Scheda di Prodotto ASPETTO DEL PRODOTTO Categoria Durata stagionatura Forma e dimensioni Aspetto esteriore: Crosta Superficie Colore Aspetto pasta Colore Struttura Consistenza Occhiatura Erborinatura, evidenza di spezie Peso Uniformità delle forma prodotte Presentazione del prodotto al consumatore INGREDIENTI Latte: specie caldo/refrigerato n di mungiture Innesti tipo (siero- latto-innesti,liofilizzati) specie Caglio o coagulante specie (bovino, ovicaprino,,vegetale) stato (liquido, in pasta) Altri ingredienti Sale

45 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Compilazione Scheda di Processo DESCRIZIONE DELLE FASI CON INDICAZIONE DI TEMPO E TEMPERATURA (es. Toma Lait Brusc) Stoccaggio latte della sera in caldaia Raffreddamento lento (8-12 ore) Scrematura Eventuale aggiunta munta mattino Riscaldamento del latte a C e aggiunta del caglio Fase di riposo per 60 minuti Rottura della cagliata a chicco di riso (2-3 mm) Raccolta con tele e sgrondo (15 ) Impasto manuale della cagliata Pressione in stampi (24 ore con 3 ribaltamenti) Salatura a secco (12 ore/faccia) Stagionatura 2-5 mesi

46 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Valutazioni microbiologiche Escherichia coli Carica batterica totale Enterobatteriaceae Staphylococcus C + Staphylococcus aureus Lattococchi mesofili Lattobacilli mesofili Listeria monocytogenes Salmonella spp. Ph, Aw Prelievi effettuati per il Crosta rossa Latte Caldaia Cagliata 2, 7, 15 giorni Prelievi effettuati per Toma lait brusc Latte Caldaia Cagliata 7, 30, 60, 90 giorni

47 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Risultati - Formaggio a crosta rossa Carica mesofila totale a 30 C 10 log Produttore 1 inverno Produttore 1 primavera Produttore 2 inverno Produttore 2 primavera Torino, 1 luglio 2010 Manila Bianchi

48 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Risultati - Formaggio a crosta rossa Enterobatteri log Produttore 1 inverno Produttore 1 primavera Produttore 2 inverno Produttore 2 primavera Torino, 1 luglio 2010 Manila Bianchi

49 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Torino, 1 luglio 2010 Manila Bianchi

50 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMETALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Torino, 1 luglio 2010 Manila Bianchi

51 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMETALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Torino, 1 luglio 2010 Manila Bianchi

52 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMETALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Torino, 1 luglio 2010 Manila Bianchi

53 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMETALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Torino, 1 luglio 2010 Manila Bianchi

54 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Torino, 1 luglio 2010 Manila Bianchi

55 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMETALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Studio dell attività inibente in vivo

56 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMETALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Tutelare le piccole realtà produttive Investire in ricerca nei PAT della nostra Regione Progetti multidisciplinari Sensibilizzare i produttori Garantire la sicurezza del consumatore Comunicazione al consumatore

57 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMETALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Grazie per l attenzione controllo.alimenti@izsto.it nrlstafilococco@izsto.it

58 Risultati - Formaggio a crosta rossa log Carica mesofila totale a 30 C Produttore 1 inverno Produttore 1 primavera Produttore 2 inverno Produttore 2 primavera log , Produ Produ primavera Produ Produ primavera Enterobatteri Stafilococchi coagulasi positivi log Produttore 1 inverno Produttore 1 primavera Produttore 2 inverno Produttore 2 primavera log Produttore 1 inverno Produttore 1 primavera Produttore 2 inverno Produttore 2 primavera

59 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMETALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA Formaggio a crosta rossa Latte Latte in caldaia Cagliata Formaggio a salatura ultimata Formaggio a 7 giorni di stagionatura Formaggio a 15 giorni di stagionatura Toma al lait brusc Latte Latte inizio lavorazione Cagliata Formaggio a 7 giorni di stagionatura Formaggio a 30 giorni di stagionatura Formaggio a 60 giorni di stagionatura Formaggio a 90 giorni di stagionatura