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1 Indice Abstract 3 1. Introduzione Patologia e genetica della mammella Il cancro della mammella Epidemiologia Fattori di rischio Carcinoma mammario nell uomo Malattie benigne della mammella Tumori maligni della mammella Carcinoma in situ Carcinoma duttale infiltrante (o invasivo) Carcinoma lobulare infiltrante (o invasivo) Carcinoma midollare Carcinoma muciparo Carcinoma tubulare Carcinoma infiammatorio Malattia di Paget Cistosarcoma filloide Fattori genetici e familiari Geni e cancro Genetica del cancro della mammella Il cancro della mammella familiare: BRCA1-BRCA TP Ormoni endogeni ErbB2/HER2/neu La target therapy ed i bersagli molecolari Anticorpi monoclonali Trastuzumab Azione del farmaco Utilizzo clinico Tollerabilità ed effetti collaterali Attuale somministrazione del farmaco Lo stadio della neoplasia Definizione del TNM nel carcinoma mammario Norme per la classificazione Linfonodo sentinella Classificazione TNM Grading istologico Razionale dello studio Materiali e metodi Scelta dei pazienti

2 4.1.1Confronto della metodica Fish con la metodica Sish Valutazione dello stato del gene HER2 in pazienti con scorie 1+ all Hercept test Determinazione dei fattori prognostici Sish (Silver enhanced in situ hybridization) inform TM her2 dna probe (ventana medical system) Principio della procedura Controllo di qualità Interpretazione dei risultati Determinazione dello stato del gene HER Metodo semiquantitativo Metodo quantitativo Fish (Fluorescence in situ hybridization) Vysis path vysion TM her2 dna probe Principio della procedura (63) Interpretazione della colorazione Tessuti idonei alla valutazione Conteggio dei segnali Scoring Limitazioni della metodica Materiali utilizzati per hercept test (dako cytomation) Strumenti Metodica Materiali utilizzati per la determinazione dei fattori prognostici Strumenti Reagenti necessari Anticorpi primari Metodica Materiali utilizzati per la fluorescence in situ hybridization (fish) Strumenti Reagenti necessari Metodica Controllo qualità Materiali utilizzati per la Silver enhanced in situ hybridazation inform TM her2 dna probe (ventana medical system) Strumenti e reagenti necessari Metodica automatica (benchmark xt) Risultati e conclusioni Risultati Conclusioni Discussione Bibliografia. 97 2

3 ABSTRACT. L analisi dello stato del gene HER2 nei pazienti affetti da carcinoma della mammella è di fondamentale importanza per la scelta dell approccio terapeutico, in particolare per verificare la candidatura all utilizzo dell anticorpo monoclonale Trastuzumab. L amplificazione genica può essere ottenuta utilizzando diverse metodiche; attualmente la più utilizzata è la FISH (Fluorescence in Situ Hybridization). Lo studio condotto aveva lo scopo di valutare la concordanza tra l amplificazione genica determinata mediante la metodica FISH (Path Vision Abbott/Vysis) e la SISH (Silver Enhanced in Situ Hybridization) (INFORM Ventana) nella rilevazione dell amplificazione del gene HER2 in pazienti con carcinoma mammario Sono stati testati 53 pazienti precedentemente sottoposti ad analisi immunoenzimatica (DAKO-HerceptTest ) per la valutazione della presenza della proteina HER2 sulla membrana cellulare, tutti con score 2+. La concordanza tra le due metodiche si è rivelata pari a 96,2%, soddisfacendo i criteri stabiliti dalle linee guida dell American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologist (ASCO/CAP), che richiedono un minimo di concordanza del 95 %. Nella seconda parte dello studio, utilizzando unicamente la metodica SISH, si è valutata l eventuale amplificazione in 30 casi con debole positività all HerceptTest (score 1+). Tali pazienti sono ritenuti non candidabili all utilizzo di terapia con Trastuzumab. Venti dei 30 dei casi sono risultati negativi all amplificazione genica con score HER2/CEN17 compresi tra 0.9 e 1,4; un caso è risultato polisomico per il cromosoma 17 ed è stato successivamente valutato anche con FISH. Con entrambe le metodiche si è ottenuto uno score HER2/CEN17 di 1.1. Il nostro studio conferma l utilità della sola analisi dell iperespressione di HER2 tramite il test immunoenzimatico. 3

4 1. INTRODUZIONE. L identificazione dell iperespressione del recettore ErbB2 (chiamato anche HER2) nel cancro della mammella è indispensabile per poter indirizzare i pazienti ad un trattamento attraverso la cosiddetta targeted therapy.(1) Il farmaco impiegato a tale scopo da alcuni anni è l anticorpo monoclonale Trastuzumab (2) specifico per la proteina HER2; inoltre sta per essere approvato in Europa anche l utilizzo dell inibitore di tirosina-chinasi Lapatinib (3), già impiegato da circa un anno negli Stati Uniti in associazione a Capecitabina nel cancro della mammella in stadio avanzato in pazienti HER2 positivi. L iperespressione del gene è in genere dovuta ad un processo di amplificazione genica. La determinazione della proteina espressa in membrana e dello stato del gene, vengono effettuate rispettivamente attraverso immunoistochimica ed ibridizzazione in situ.(4) La tecnica di ibridizzazione in situ più usata attualmente è la FISH (Fluorescence in Situ Hibridization), che richiede una speciale attrezzatura ed ha il problema del decadimento del fluorforo, che la stabilità a lungo termine della reazione. La tecnica necessita inoltre di personale esperto in grado di interpretare correttamente la lettura dei vetrini. Recentemente è stata introdotta la nuova metodica automatica SISH (Silver Enhanced in Situ Hybridization), che potrebbe ovviare ad alcuni degli svantaggi della FISH, permettendo di identificare il rapporto HER2/cromosoma 17 attraverso un microscopio convenzionale.(4) 4

5 2. PATOLOGIA E GENETICA DELLA MAMMELLA. 2.1 IL CANCRO DELLA MAMMELLA EPIDEMIOLOGIA. Il carcinoma della mammella è la neoplasia più frequente nelle donne nei Paesi industrializzati, ed è la maggior causa di morbilità e mortalità oncologiche. L incidenza del cancro della mammella presenta un ampia variabilità geografica. E quasi 10 volte più frequente nelle popolazioni ricche dell Occidente rispetto alle aree del Terzo Mondo; la stima di incidenza negli Stati Uniti per il 2005 è di nuovi casi (il 32% delle neoplasie diagnosticate nella donna) con tendenza a lieve e costante incremento nell ultima decade. In Italia stima è di circa nuovi casi l anno, in media con i valori europei.(6) I tassi di incidenza aumentano in maniera esponenziale con l età, ma intorno a anni, a differenza di altri tumori epiteliali non dipendenti da fattori ormonali e riproduttivi, l incremento cessa, per poi riprendere meno pronunciato dopo i 60 anni.(5,6) In realtà la tendenza all incremento dell incidenza in Italia nelle ultime decadi è riconducibile anche alla tempestività delle diagnosi in relazione a campagne di screening di prevenzione secondaria. Globalmente, nei Paesi Occidentali, la mortalità per carcinoma della mammella rappresenta la prima causa di morte per tumore nella donna e la prima causa di morte in assoluto tra i 40 ed i 60 anni. Negli Stati Uniti tuttavia la mortalità per carcinoma mammario ( morti stimate nell anno 2005 pari al 15% delle morti per cancro) è superata dalla mortalità per carcinoma polmonare. In Italia viene stimato per il 2005 un tasso di mortalità di 21 x , di poco inferiore alla media europea ( il tasso per i Paesi dell Europa Occidentale per l anno 2002 è del 22,3 x ).(6) 5

6 I dati più recenti per quanto riguarda la sopravvivenza su base di popolazione resi noti dal National Cancer Institute per gli Stati Uniti evidenziano una tendenza significativa al miglioramento della prognosi ( dal 75% a 5 anni degli anni 70 all 88% del 2000); i dati italiani ed europei ricavabili dai confronti dei registri tumori evidenziano nel tempo lo stesso miglioramento. In Europa la sopravvivenza per carcinoma mammario a 5 anni sale dal 72,5% nel periodo al 76% nel periodo Il dato italiano negli stessi periodi passa dal 76% all 80%.(6) A causa dell alta incidenza e della relativa buona prognosi, il tumore della mammella è quello con una maggiore prevalenza nel mondo ed in Italia la stima dei dati mostra una chiara tendenza all incremento, dai circa casi nel 1970 ai casi nel 1997, fino a circa casi nel Tale incremento è attribuibile sia all aumento della sopravvivenza che all invecchiamento della popolazione.(6) FATTORI DI RISCHIO. Il rischio di sviluppare il carcinoma della mammella è associato a fattori di ordine genetico e familiare, endocrino, dietetico, ambientale, ad abitudini di vita e a pregresse malattie mammarie, anche se più della metà dei casi non è tuttavia riconducibile ad alcun fattore di rischio noto. L età è chiaramente un fattore di rischio in rapporto a meccanismi che possono coinvolgere il prolungato stimolo endocrino alla proliferazione, l accumulo di danni al DNA a livello di oncogeni ed oncosoppressori, l espressione patologica di geni correlati al ciclo cellulare e all apoptosi, la mancata regolazione di meccanismi connessi ai fattori di crescita ed ai loro recettori. La maggior parte delle mutazioni degli oncogeni e degli (mutazione somatica) durante tutta la vita. In una piccola percentuale oncosoppressori è acquisita e si sviluppa casualmente a carico delle cellule somatiche di casi (5-10%), la mutazione è ereditaria (mutazione germinale), cioè presente nei gameti e quindi può essere trasferita da una generazione alla successiva. 6

7 Le mutazioni somatiche si verificano a carico del DNA di singole cellule e, quindi, l alterazione genetica è riscontrabile solo nelle cellule derivate dalla cellula mutata. Le mutazioni germinali invece, sono rilevabili in tutte le cellule del corpo perché originariamente presenti nelle cellule germinali dalle quali derivano, appunto, tutte le cellule dell organismo. La presenza di una mutazione germinale può essere determinata attraverso un test genetico che consiste nell esaminare il DNA di un individuo, estratto da cellule di un campione di sangue (es. leucociti) o talora di altri liquidi o tessuti corporei, per ricercare alterazioni correlate con una malattia. Le alterazioni del DNA possono essere numerose come aberrazioni cromosomiche rilevabili dall esame cariotipico (delezioni di frammenti di cromosomi, duplicazioni e traslocazioni) o alterazioni di singoli geni attraverso delezioni, mutazioni puntiformi, mutazioni frameshift (inserimento o delezione di singole basi in un esone), amplificazione genica. I test genetici hanno una vasta applicazione in oncologia sia da un punto di vista diagnostico che prognostico e terapeutico (7) CARCINOMA MAMMARIO NELL UOMO. Il carcinoma mammario maschile è raro e rappresenta meno dell 1% di tutti i carcinomi della mammella. Il tasso di incidenza in Italia e nel mondo occidentale è di circa 1 caso su e mostra un lieve incremento negli ultimi decenni, con evidenza di una riduzione del tasso di mortalità. La prevalenza aumenta con l età e mostra una distribuzione unimodale; l età mediana è intorno ai 67 anni, con ritardo di circa 5 anni rispetto al sesso femminile. I fattori eziologici o predisponenti, probabilmente multifattoriali, restano controversi. Essi comprendono varie condizioni di alterato metabolismo ormonale con uno sbilanciamento del rapporto estrogeni/progesterone a seguito di patologie del testicolo, Sindrome di Klinefelter, cirrosi epatica, obesità, assunzione esogena di estrogeni, ginecomastia secondaria a farmaci o pregresso trattamento radiante nell area mammaria. Un anamnesi familiare positiva per carcinoma mammario è riportata in circa 30% dei casi. Il fattore genetico più frequentemente associato è la 7

8 mutazione del gene BRCA2. Studi recenti dimostrano un incremento del rischio per gli uomini che presentino tale mutazione da 80 a 100 volte rispetto alla popolazione generale, mentre per l alterazione del gene BRCA1 l incremento è di circa 60 volte. La mutazione di BRCA2 si riscontra nel 15% di neoplasia mammaria maschile e la sua frequenza varia dal 4 al 40% con una maggiore incidenza nella popolazione ebraica di discendenza Askenazy.(9,10) MALATTIE BENIGNE DELLA MAMMELLA. Figura 1: Malattie benigne della mammella Le malattie benigne della mammella costituiscono un vasto ed eterogeneo gruppo di lesioni la cui frequenza è notevolmente superiore a quella delle lesioni maligne. La loro importanza consiste soprattutto nel fatto che alcune possono simulare clinicamente un cancro della mammella (per es. ectasia dei dotti mammari, necrosi del grasso), mentre altre rappresentano fattori di rischio per lo sviluppo di un successivo carcinoma. In realtà solo 8

9 una parte di esse rientra in quest ultima categoria, trattandosi di poche lesioni che fanno parte del gruppo delle malattie benigne a carattere proliferativo. (Fig.1) A carico della mammella possono riscontrarsi vari tumori benigni, quali lipomi, adenomi, emangiomi ecc. L asportazione completa di questi tumori rappresenta un trattamento adeguato e definitivo. Una delle più note lesioni proliferative della mammella è costituita dal fibroadenoma, che si riscontra più frequentemente tra i 25 e i 35 anni di età, aumenta di dimensioni durante la gravidanza e tende a regredire con l aumentare dell età della paziente. In genere è una lesione singola, ma nel 20% dei casi può essere multipla o bilaterale. Microscopicamente i fibroadenomi sono costituiti da tessuto connettivo e tessuto ghiandolare. Una trasformazione maligna è stata riportata molto raramente (0,1% dei casi) per la componente epiteliale in genere sotto forma di carcinoma in situ. La trasformazione sarcomatosa della componente connettivale è ancora più rara, se realmente esiste. Il rischio di trasformazione del fibroadenoma in cancro della mammella è però aumentato se è presente iperplasia duttale o storia familiare di carcinoma mammario. Un altra lesione benigna della mammella è il papilloma intraduttale che, in media, si riscontra intorno ai 48 anni di età, nel 90% dei casi è solitario ed è costituito da una lesione polipoide all interno dei dotti che può essere causa di secrezione ematica del capezzolo. L escissione chirurgica guarisce questo tumore, e non vi è, in queste condizioni, un maggior rischio di cancro alla mammella a lungo termine. Il rischio è aumentato in presenza di papillomi multipli microscopicamente evidenti. Il papilloma intraduttale è una delle cause più frequenti di secrezione del capezzolo, che complessivamente si riscontra in circa il 5% delle donne che presentano problemi mammari. La malattia fibrocistica rappresenta di certo la condizione benigna più comune; si riscontra nel 50-90% delle donne, più frequentemente nell età compresa tra i 25 e i 45 anni di età. Generalmente è bilaterale, anche se una mammella può essere notevolmente più colpita dell altra. E rappresentata da un insieme di alterazioni mammarie, tra cui cisti, fibrosi, infiammazione 9

10 cronica, iperplasia epiteliale; la sua origine non è del tutto nota, ma è certo che risenta di influenze ormonali. Questo tipo di patologia di per sé non aumenta il rischio di cancro che, invece, è correlato a presenza di iperplasia duttale o lobulare, soprattutto se atipica ed associata a storia familiare di carcinoma della mammella.(11) Figura 3: Anatomia normale e patologica della mammella TUMORI MALIGNI DELLA MAMMELLA. Nella mammella possono insorgere diversi tipi di tumore ma, nella stragrande maggioranza dei casi, si tratta di tumori epiteliali, cioè di carcinomi, mentre rari sono i sarcomi ed i tumori di origine connettivale. Il carcinoma della mammella rappresenta una crescita abnorme delle cellule che rivestono i dotti ed i lobuli ed è classificato in base alla cellula di origine (duttale o lobulare), alla invasione (diffusione e crescita) attraverso il dotto o il lobulo e dall aspetto istologico.(fig 3-4) 10

11 Figura 4: Struttura della mammella femminile Carcinoma in situ. La definizione carcinoma in situ indica che le cellule tumorali si trovano ancora nella sede dove è avvenuta l iniziale trasformazione neoplastica, confinate entro la membrana basale e non ancora diffuse in altre parti del corpo. Esistono due tipi di carcinoma in situ: Carcinoma lobulare in situ (LCIS). E anche detto neoplasia lobulare, inizia a livello dei lobuli, ma non si accresce attraverso la parete dei lobuli. E un reperto occasionale e non si ritiene che si trasformi abitualmente in cancro invasivo. 11

12 Figura 5: Carcinoma lobulare in situ Carcinoma duttale in situ (DCIS) o carcinoma intraduttale. E il tipo più frequente di carcinoma della mammella non invasivo ed è a sua volta, costituito da più varianti. Se non trattato può lentamente trasformarsi in carcinoma invasivo. Fig. 6:Carcinoma duttale in situ 12

13 Carcinoma duttale infiltrante (o invasivo). Rappresenta circa l 80% di tutti i tumori della mammella ed origina dalle cellule epiteliali dei dotti galattofori. Col tempo le cellule tumorali superano la membrana basale, penetrano nel tessuto adiposo mammario e possono così invadere i vasi linfatici o ematici diffondendosi in altre parti del corpo. Figura 7: Carcinoma duttale Carcinoma lobulare infiltrante (o invasivo). Rappresenta il 10-15% di tutti i tumori della mammella ed origina dalle cellule epiteliali dei lobuli. Come il carcinoma duttale infiltrante, invade la membrana basale e si diffonde in altri distretti corporei. 13

14 Figura 8: Carcinoma lobulare invasivo Carcinoma midollare. Questo tipo di carcinoma duttale infiltrante, che costituisce circa il 5% di tutti i tumori mammari, ha la caratteristica di presentare margini ben circoscritti, una diffusa infiltrazione di linfociti e cellule tumorali di grandi dimensioni. Quando è puro, cioè non commisto ad altre varianti, ha una prognosi migliore rispetto ai due precedenti. Figura 9: Carcinoma midollare 14

15 Carcinoma muciparo. Detto anche carcinoma colloide, è un raro carcinoma duttale infiltrante costituito da cellule che producono muco. In genere ha una prognosi migliore ed un minor rischio di metastasi rispetto al carcinoma lobulare o duttale invasivi delle stesse dimensioni. Figura 10: Carcinoma muciparo (colloide) invasivo Carcinoma tubulare. E un tipo particolare di carcinoma duttale infiltrante della mammella, costituito dalla proliferazione di piccoli tubuli irregolari. E spesso multicentrico e bilaterale, e di rado si accompagna a metastasi linfonodali. La forma pura ha una prognosi molto favorevole, essendo guaribile in più del 90% dei casi. 15

16 Figura 11: Carcinoma tubulare infiltrante Carcinoma infiammatorio. E un tipo non comune di carcinoma invasivo che costituisce l 1-3% di tutti i tumori della ghiandola mammaria. La cute della mammella si presenta di colorito rosso, è calda ed ha l aspetto della buccia d arancia. In realtà non esiste un processo infiammatorio di base e l aspetto è determinato dalle cellule tumorali che bloccano i vasi linfatici. Questo tumore ha un elevata probabilità di metastatizzare a distanza ed ha una prognosi peggiore rispetto ai carcinomi invasivi duttale e lobulare Malattia di Paget. Si presenta con alterazioni del capezzolo costituite da lesioni eczematose con prurito, arrossamento e secrezione sierosa o sieroematica dal capezzolo. Nella quasi totalità dei casi si incontra una contemporanea neoplasia della mammella che può essere sia un carcinoma duttale in situ (più frequente) che un carcinoma duttale invasivo. E una neoplasia rara che rappresenta meno dell 1% dei tumori della mammella. 16

17 Figura 12: Mallattia di Paget con lesione eczematosa diffusa Cistosarcoma filloide. Questo tumore fu così denominato nel 1838 da Johannes Müller per le sue caratteristiche macroscopiche costituite da lobulazioni simili a foglie (dal greco phillion, foglia) che aggettano in cavità cistiche e, talora, da un aspetto sarcomatoso. Il tumore, in realtà, ha in genere un decorso benigno, e solo raramente presenta caratteristiche francamente maligne. Quando il tumore dà metastasi a distanza, ciò avviene per via ematogena, come nel caso dei sarcomi. 17

18 2.1.6 FATTORI GENETICI E FAMILIARI Geni e cancro. Il cancro è una malattia genetica dovuta all alterazione (es. mutazione) di più geni. In genere sono interessati i geni la cui funzione è quella di controllare che la moltiplicazione delle cellule avvenga in maniera ordinata. Se è presente un alterazione, le cellule si possono riprodurre in maniera disordinata, infiltrare i tessuti vicini e diffondersi dappertutto nel corpo. I geni più frequentemente coinvolti sono: gli oncogeni che normalmente stimolano la proliferazione cellulare (quando sono mutati la stimolazione è continua); i geni oncosoppressori i quali normalmente frenano la moltiplicazione delle cellule (quando sono mutati perdono la loro funzione e viene favorita la proliferazione cellulare).; i geni riparatori del danno del DNA, che favoriscono l insorgenza di un tumore non correggendo gli errori che si verificano quando il DNA viene duplicato e consentendo, pertanto, l accumulo di mutazioni. Particolare importanza hanno i test genetici predittivi miranti ad individuare i soggetti a rischio di sviluppare una neoplasia per il fatto di avere ereditato un gene mutato, prima della comparsa di segni o sintomi. Un test genetico predittivo, dirà se è presente o meno una mutazione genetica correlata ad una determinata neoplasia. Se la mutazione è presente lo sviluppo successivo di un tumore dipende dalla penetranza del gene.(7) Genetica nel cancro della mammella. Nel cancro della mammella sono stati individuati vari geni che possono essere oggetto di mutazioni somatiche o germinali tra cui quelli che codificano per il recettore dell estrogeno (ERs), del progesterone (PRs) ErbB2, p53, BRCA1 e BRCA2 (Fig 1). Alcune sindromi familiari si associano ad aumentata suscettibilità di carcinoma mammario, nell ambito di malattie complesse con neoplasie 18

19 multiple. Per alcune di esse è stata è stata identificata la mutazione genica coinvolta: una mutazione di p53 nella Sindrome di Li Fraumeni, del gene PTEN nella Sindrome di Cowden e del gene AT nella Sindrome atassiateleangectasia. La frequenza delle mutazioni varia da 1/1000 nel caso di BRCA1-2 a circa 1/ nelle sindromi più rare. Mutazioni relativamente comuni a livello di geni a bassa penetranza agiscono insieme a fattori endogeni e a condizioni legate allo stile di vita nell insorgenza di neoplasie sporadiche, che rappresentano la maggior parte dei carcinomi mammari. (Fig.13) Figura 13: Pathways di risposta al danno del DNA e cancro della mammella 19

20 Il cancro della mammella familiare: BRCA1- BRCA2. Non esiste una mutazione genetica univocamente ed esclusivamente associata al rischio. L anamnesi familiare positiva per carcinoma mammario aumenta il rischio di sviluppare la malattia; studi epidemiologici hanno dimostrato che circa il 12% di pazienti con carcinoma della mammella ha almeno un familiare affetto dalla malattia, e che il rischio aumenta con l aumentare dei familiari interessati.(6,7) La probabilità che sia presente una mutazione genetica aumenta se la storia familiare include giovane età alla diagnosi, raggruppamenti di carcinomi mammari e ovarici (80% BRCA1), carcinoma della mammella maschile (66% BRCA2) e altre rare neoplasie come sarcomi e tumori dalla corticale del surrene (70% TP53). Dal 5 al 10% dei carcinomi mammari compaiono come risultato di specifiche mutazioni in geni ad alta penetranza. In circa metà di tali mutazioni, trasmesse con eredità mendeliana autosomica dominante, sono relative ai geni oncosoppressori BRCA1(cromosoma 17q21) e BRCA2 (cromosoma 13.q13); essi sono responsabili dell 80-90% delle neoplasie geneticamente determinate codificando proteine nucleari implicate nei meccanismi biochimici che controllano l integrità del genoma. Essi rappresentano i più forti predittori di rischio attualmente noti e conferiscono un aumentato rischio di neoplasia mammaria, a esordio spesso bilaterale, in età più precoce alla popolazione generale ( Tab 1). Mutazioni a carico del BRCA1 comportano un rischio del % di sviluppare un cancro della mammella nel corso della vita, ed un rischio del % di andare incontro, invece, ad un cancro dell ovaio. Nel sesso maschile le mutazioni di BRCA1 non comportano un incremento di rischio di carcinoma mammario, ma probabilmente di cancro della prostata e del colon. Nel caso di mutazioni di BRCA2, il rischio di sviluppare nel corso della vita un cancro della mammella è % per gli uomini e del % per le donne, mentre per il cancro dell ovaio è del %. Nella popolazione generale, una mutazione di BRCA1 è presente in uno ogni individui. Mutazioni a carico di BRCA2 sono ancora meno frequenti. Negli 20

21 ebrei Askenazi (cioè dell Europa Occidentale e degli USA), una mutazione di BRCA2 si riscontra addirittura in un individuo ogni 40.(14,15,16,17) La maggior parte di tumori della mammella non è correlata a geni BRCA1 e BRCA2 alterati. Mutazioni di questi geni, infatti, si riscontrano solo in circa il 6 % di donne con cancro della mammella diagnosticato in età minore di 36 anni ed in circa il 4 % di donne in cui la diagnosi di neoplasia mammaria è fatta in età compresa tra 36 e 45 anni. Pertanto, al massimo, soltanto un cancro della mammella ogni 10 è correlato ad un gene mutato ereditato e non tutti i tumori della mammella ereditati sono in rapporto con BRCA1 o BRCA2. Sono in corso studi per identificare possibili mutazioni di un altro gene indicato come BRCA3.(Fig 14) Finora sono state identificate più di 500 lesioni di BRCA1 e più di 250 di BRCA2 (10). (Tab. 2) Storia personale Cancro della mammella diagnosticato in età minore di 40 anni. Cancro della mammella bilaterale, soprattutto allorché il primo Storia personale Cancro della mammella diagnosticato in età minore di 40 anni. Cancro della mammella bilaterale, soprattutto allorché il primo tumore sia stato diagnosticato in età minore di 50 anni. Storia di cancro della mammella e dell ovaio. Storia familiare Due o più membri della famiglia con cancro della mammella diagnosticato dall età di 50 anni o prima. Presenza nella famiglia sia di cancro della mammella che dell ovaio. Uno o più membri della famiglia con cancro della mammella diagnosticato all età di 50 anni o prima, ed appartenenza alla stirpe degli ebrei Askenazi. Uno o più membri della famiglia con cancro dell ovaio ed appartenenza alla stirpe degli Askenazi. Cancro della mammella maschile. Tabella 2: Predisposizione al cancro mammario 21

22 Le neoplasie in pazienti con mutazione BRCA2 non hanno un fenotipo distinto dalle neoplasie sporadiche; i carcinomi associati a mutazioni di BRCA1 invece presentano frequentemente neoplasie a istotipo duttale, elevato grado istologico e negatività ai recettori ormonali e ad HER2 ed iperespressione di p53. 10% 20% Sporad Familiare Ereditario 70% Figura 14: Eterogeneità del cancro della mammella TP53. TP53 è un importante gene oncosoppressore situato sul cromosoma 17p14, presente in molti tessuti, inclusi quelli della mammella. Si stima che il 30-50% dei carcinomi della mammella abbia una mutazione somatica di TP53. Inoltre molte donne con mutazioni di TP53 nella linea germinale (Sindrome di Li-Fraumeni), che sopravvivano a cancri in età giovanile, sviluppano un cancro della mammella in età adulta. Il 50-70% dei carcinomi della mammella in donne con mutazioni di BRCA1 hanno anche mutazioni di TP53 e ciò suggerisce un interazione di questi geni nello sviluppo della malattia. TP53 è un importante componente della risposta cellulare al danno del DNA. Tramite l induzione di p21 determina l arresto del ciclo cellulare, per permettere al sistema di riparo del DNA di intervenire e correggere eventuali lesioni; tramite l induzione di BAX determina l apoptosi della cellula in caso di danno più esteso. 22

23 Diversi modelli murini sono stati importanti nella definizione del ruolo di TP53 nello sviluppo del cancro della mammella. Nella maggior parte dei casi, l assenza di TP53 normale nella ghiandola mammaria non è associato a più alta incidenza di tumori. Comunque la specifica perdita di funzione di TP53 nella ghiandola stessa riduce la latenza dello sviluppo di tumore mammario in topi, quando questi sono incrociati con animali transgenici con iperespressione di MYC, ErbB2, IGF1 e WNT1. Questi dati suggeriscono che TP53 promuova lo sviluppo di tumore mammario, ma che non sia l evento iniziale. Sebbene l associazione tra mutazioni di TP53 e prognosi infausta dei tumori non sia del tutto chiara, i cancri TP53 mutanti possono avere ridotta sensibilità alle condizioni che inducono apoptosi, marcata instabilità genetica, incremento di capacità proliferativa ed angiogenetica. Le mutazioni di TP53 sono anche collegate alla resistenza farmacologica e sono forti indicatori di fallimento del trattamento; infatti sono associate a resistenza a Tamoxifene, terapia radiante e doxorubicina (18,19,20) Ormoni endogeni. Ogni evento riproduttivo nella vita della donna è stato variamente associato al rischio di sviluppare un tumore della mammella, e gli ormoni sessuali endogeni, gli estrogeni in particolare, sono stati lungamente implicati nell induzione e progressione neoplastica. Infatti molti tumori maligni della mammella sono dipendenti dagli estrogeni per la loro crescita e la loro sopravvivenza. Questo effetto è mediato da ER, un fattore di trascrizione nucleare che ha come ligandi gli estrogeni, i quali inducono la formazione di un omodimero, attivando i promotori di diversi geni (incluso PGR), i quali a loro volta inducono la proliferazione delle cellule e conferiscono loro resistenza all apoptosi. L estradiolo è il più potente degli estrogeni non coniugati. Entra nelle cellule per diffusione malgrado la concentrazione intracellulare è notevolmente aumentata in quegli organi o tessuti che esprimono i recettori per gli estrogeni. L ingresso nelle cellule è impedito dal legame 23

24 a bassa affinità con l albumina e ad alta affinità con la Sex Hormon Binding Globulin (SHBG). L estradiolo è convertito in modo reversibile a estrone e quindi a estrone solfato. La relazione tra estrogeni e tumore mammario è dimostrata da evidenze cliniche come il calo di incidenza di neoplasie mammarie dopo la menopausa, il rischio ridotto in donne ovariectomizzate o con menopausa precoce, l efficacia di antiestrogeni nella prevenzione e nel trattamento del tumore stesso e da una larga serie di studi epidemiologici.(21,22) La neoplasia della mammella che esprime alti livelli di ER è, almeno inizialmente, responsiva alla terapia ormonale, cioè a farmaci come Tamoxifene ed inibitori dell aromatasi. (23) Il ruolo del progesterone è sostenuto dal fatto che la proliferazione dell epitelio mammario è maggiore in fase luteale, con un picco di 9-10 giorni dopo l ovulazione, cui corrisponde l aumento di attività mitotica in particolar modo a livello dell unità termino-lobulare, dove originano la maggior parte dei carcinomi, e dalla dimostrazione che la terapia sostitutiva con estro-progestinici aumenta il rischio di sviluppare un carcinoma mammario in misura superiore rispetto ai soli estrogeni. In contrasto con questa teoria alcuni studi (24) hanno mostrato una correlazione inversa tra livelli sierici di progestinici ed incidenza di carcinoma mammario in pre-menopausa. In realtà il progesterone ha complessi effetti di crescita nei tessuti ormonoresponsivi. E risaputo che il progesterone blocca la proliferazione endometriale stimolata dagli estrogeni. La maggior parte degli studi in vitro suggerisce che i progestinici riducono gli effetti mitogenici degli estrogeni; d altro canto studi in vivo paiono dimostrare il contrario, con primario effetto sull epitelio della mammella di tipo proliferativo, conseguentemente gli antagonisti del progesterone bloccherebbero tale proliferazione. Sia gli estrogeni che il progesterone sono necessari per il normale sviluppo della mammella. PGR è un gene regolato dagli estrogeni, avendo nel suo promoter un elemento sensibile ad essi; inoltre in generale le neoplasie della mammella ER positive sono anche PGR positive. (21,23,24) 24

25 Erb B2 (HER2/neu). Il proto-oncogene ErbB2 (HER2/neu) è situato sul braccio lungo del cromosoma 17 (17q11.2-q12), in posizione prossima ad un altro protooncogene, GRB7. Esso codifica un mrna di 4.6 kb, tradotto in una proteina del peso di 185 kd, chiamata appunto P185, al quale ha funzione recettoriale ad attività tirosin-chinasica. ErbB2 appartenente ad una famiglia di quattro recettori di fattori di crescita che comprende ErbB1, più noto come EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), ErbB3 (HER3) e ErbB4 (HER4). La struttura monomerica di questi recettori è costituita da un dominio transmembrana di amminoacidi, da un dominio extracellulare N- terminale che lega i fattori di crescita di circa 620 amminoacidi, strutturato in quattro sottodomini denominati L1, L2 (leucine-rich), CR1 e CR2 (cysteine-rich), ed infine da un dominio intracellulare C-terminale responsabile dell attività tirosin- chinasica. La fosforilazione della tirosina nel recettore produce siti leganti proteine che contengono domini SH2 (Src homology 2) e PTB (Phosphotyrosine binding). Fanno parte di questo gruppo di proteine Grb2, Grb7, Crk,e Gab1, proteine e lipidi-chinasi come fosfatidilinositolo-3-chinasi e fosfolipasi Cγ e proteine-fosfatasi come SHP1 e SHP2. Dopo l attivazione si innescano i meccanismi di trasduzione del segnale che portano a divisione cellulare. L integrità del segnale di ErbB richiede anche l unione indipendente da fosforilazione con proteine che regolano l attività recettoriale e la corretta localizzazione in membrana. I fattori di crescita che legano questi recettori sono conosciuti come hereguline o neureguline, ed il loro legame con ErbB3 e ErbB4 induce una eterodimerizzazione con ErbB2 e successiva trasduzione a valle del segnale. (Fig. 15) ErbB2 non è in grado di legarsi a fattori endogeni (è definito in gergo tecnico orfano ), ma forma dimeri con altri recettori della famiglia, già legati, stabilizzandoli ed innescando la trasduzione del segnale chinasi- 25

26 mediata. Essenzialmente tutte le combinazioni dei quattro recettori possono essere indotte da dieci specifici ligandi di ErbB, generando segnali molto diversi fra loro. In alternativa, l iperespressione di recettori che può essere osservata in alcuni tumori, inclusi quelli della mammella, promuove dimerizzazione spontanea in assenza di ligando, e quindi attivazione costitutiva. L amplificazione di ErbB2 e l iperespressione della relativa proteina sono riscontrati nel 20-30% dei cancri della mammella e sono associati ad un decorso clinico sfavorevole ed a diminuzione del tempo di sopravvivenza. Dati recenti suggeriscono che anche l iperespressione di ErbB3 contribuisca al fenotipo maligno attraverso l aumento della motilità cellulare, con induzione di potenziali metastasi e trasduzione di segnali antiapoptotici che prolungherebbero la sopravvivenza delle cellule e contribuirebbero all insorgenza di instabilità genetica e di resistenza farmacologica. Con riferimento al comportamento metastatico, le hereguline sono importanti fattori migratori delle cellule neoplastiche nel cancro della mammella, inducendo la riorganizzazione dell actina e la formazione di strutture citoscheletriche mobili. Le hereguline stimolano anche PAK1 (p21-activate-kinase), una chinasi implicata nella promozione della migrazione delle cellule. Clinicamente ciò può avere rilevanza nello sviluppo della malattia metastatica che nel carcinoma della mammella, come abbiamo detto precedentemente, è associato a iperespressione di ErbB2. Essa può anche essere causa di resistenza farmacologia, grazie all induzione della riparazione delle rotture del DNA determinate da chemioterapici come ad esempio la doxorubicina. Infatti l iperespressione di recettori tirosin-chinasi della famiglia ErbB contribuisce al prolungamento del ciclo cellulare, permettendo la riparazione del DNA e sovraregolando membri antiapoptotici della famiglia BCL2. L espressione di ErbB2 risulta associata ad una sottoregolazione di BAX ed ad una sovraregolazione di molecole anti-apoptotiche BCL2 e BCL-XL. Il segnale apoptotico risulta ridotto, viene favorita l instabilità genomica e compare resistenza agli agenti chemioterapici. 26

27 Questo vale soprattutto nel caso di farmaci che agiscono producendo un danno al DNA come gli analoghi nucleosidici (6-mercaptopurina, 6- tioguanina, 5-fluorouracile, citarabina, fludarabina), gli antibiotici intercalanti del DNA (adriamicina, daunorubicina) e gli agenti alchilanti che formano legami tra i due filamenti (nitrosuree, ciclofosfamide). La cellula neoplastica ha un aumentata capacità di riparo di questo tipo di lesioni ed incrementa la sua tolleranza ai danni causati da questi agenti chemioterapici, promuovendo lo sviluppo della progressione maligna. (25,26,27). Figura 15: Segnali cellulari di ErbB2 (HER2/neu) 27

28 2.2 LA TARGETED THERAPY ED I BERSAGLI MOLECOLARI. Negli ultimi anni sono stati compiuti progressi straordinari nella scoperta delle lesioni genetiche alla base delle neoplasie. Queste scoperte hanno aperto nuovi scenari per lo sviluppo di targeted therapy, cioè terapie molecolari indirizzate selettivamente contro le proteine responsabili della formazione dei tumori. Infatti le cellule tumorali dipendono in maniera assoluta da alcune specifiche vie di trasduzione del segnale, e l inibizione di queste vie può portare ad arresto irreversibile della crescita, oppure a morte delle cellule neoplastiche. L utilizzo di targeted therapy richiede una corretta ed esaustiva definizione del target. Un bersaglio terapeutico ideale, in particolare, deve avere le seguenti caratteristiche: essere esclusivo o preminente del tumore; essere assente o irrilevante negli organi sani; rivestire un importante ruolo patogenetico per la progressione del tumore, preferibilmente rappresentando una delle caratteristiche fondamentali della biologia della cellula tumorale (si può trattare di un processo che coinvolge diverse molecole); dimostrarsi bersagliabile farmacologicamente; il farmaco, o comunque la terapia, deve risultare con un indice terapeutico almeno accettabile; essere misurabile clinicamente; la misurazione si dovrebbe correlare con l outcome clinico durante la terapia. Le proteine codificate da oncogeni e oncosoppressori rappresentano bersagli elettivi per la messa a punto delle terapie molecolari, cioè terapie dirette a bloccare le molecole che sono alla base delle neoplasie. Infatti colpire bersagli molecolari specifici rappresenta un approccio potenzialmente più efficace e meno tossico delle terapie tradizionali. Produrre composti in grado di bloccare il funzionamento di proteine superattive (quelle codificate dagli oncogeni) è più agevole che identificare molecole in grado di ripristinare la funzione delle proteine inattivate (quelle codificate dagli oncosoppressori). Non sorprende quindi che le 28

29 proteine codificate dagli oncogeni siano state identificate come i bersagli più promettenti per terapie molecolari. Bersagli molto promettenti sono, per esempio, le proteine RAS. Esse sono infatti da annoverare tra le oncoproteine più spesso coinvolte nei tumori dell uomo. Per poter funzionare le proteine RAS hanno bisogno di essere coniugate a catene lipidiche da enzimi (noti come farnesiltransferasi o geraniltransferasi). Inibitori di questi enzimi hanno efficacia terapeutica grazie al blocco di RAS o di proteine della stessa famiglia.(28,29) Altri bersagli terapeutici promettenti sono le oncoproteine con funzione anti-apoptotica. La loro inibizione potrebbe infatti favorire la morte delle cellule tumorali. Sono in sperimentazione molecole in grado di inibire le proteine IAP (Inhibitor of Apoptosis), oppure BCL2, un altra proteina con funzione antiapoptotica. Tuttavia esistono anche esempi di strategie terapeutiche che hanno come obiettivo l attivazione di oncosoppressori. La proteina p53, per esempio, ha potenti effetti antitumorali, in larga parte mediati dalla capacità di indurre apoptosi oppure arresto del ciclo cellulare. Di recente sono stati identificati alcuni composti che bloccano la degradazione proteolitica di p53, aumentandone i livelli intracellulari e, di conseguenza, uccidendo le cellule tumorali.(28,29) Un altra classe di composti antitumorali sono gli inibitori delle istonedeacetilasi (Histone De Acetylase; HDAC), enzimi che favoriscono l acetilazione degli istoni e quindi il distacco della cromatina. Questi composti stimolano potenzialmente la trascrizione genica; infatti l effetto terapeutico degli inibitori di HDAC è legato alla capacità di riattivare l espressione di proteine con funzione di soppressione tumorale. (30) Le strategie citate, sebbene molto promettenti, sono ancora in fase sperimentale. Invece due altre strategie, basate sullo sviluppo di inibitori a basso peso molecolare per chinasi oncogeniche oppure di anticorpi monoclonali diretti contro antigeni posti sulla superficie delle cellule tumorali, hanno prodotto molecole terapeutiche presenti già in pratica clinica. I farmaci diretti a target specifici si sono sviluppati di pari passo con le progressive scoperte sui meccanismi molecolari eziologici dei tumori, la 29

30 definizione e la mappatura dei più importanti pathway che controllano proliferazione, differenziamento e morte cellulare e con i progressi della chimica combinatoriale, che hanno permesso di formulare l ipotesi che una volta trovato un target biologicamente significativo, sia possibile costruire un farmaco ad hoc. La denominazione targeted therapy è quanto mai appropriata perché il meccanismo di questi farmaci non è più diretto, come per i citotossici tradizionali, genericamente contro la sintesi degli acidi nucleici ed i normali processi cellulari, ma contro particolari target molecolari rilevanti per la patogenesi dei tumori.(1,2) Tuttavia le neoplasie sono malattie eterogenee, che solo terapie combinate, dirette contemporaneamente contro più bersagli molecolari, possono riuscire a controllare in maniera efficace. Combinazioni farmacologiche opportune potranno anche ridurre il rischio di sviluppo di cellule neoplastiche resistenti, un rischio che rappresenta, attualmente, uno dei principali problemi della targeted therapy. 2.3 ANTICORPI MONOCLONALI UMANIZZATI. La terapia con anticorpi monoclonali (mab) è basata sulla scoperta che mab specifici per un antigene possono essere ottenuti fondendo una cellula B che produce anticorpi con una cellula immortalizzata di mieloma. Provocando una fusione cellulare di linfociti B provenienti da un topo con una linea cellulare proveniente da un mieloma si ottiene un ibridoma, facendo crescere i singoli ibridomi si ottengono cloni cellulari ognuno dei quali sintetizza uno specifico tipo di anticorpo monoclonale con struttura chimica definita e con la capacità di riconoscere un singolo epitopo.(32) Nel 1975 sono stati prodotti i primi anticorpi murini mediante la tecnica degli ibridomi (32), tuttavia questi anticorpi sono immunogenici nell uomo e inducono risposte anticorpali anti-immunoglobulina (Ig) di topo, causa di reazioni simili alla malattia da siero e di rapida rimozione degli anticorpi dal 30

31 circolo. Successivamente, grazie allo sviluppo di tecniche di ingegneria genetica, è stato possibile produrre anticorpi più simili a quelli umani e quindi meno immunogenici (33). Gli anticorpi chimerici sono stati prodotti da geni ibridi derivanti dalla fusione dei geni codificanti per le regioni variabili (VH e VL) delle Ig di un mab di topo con corrispondenti regioni H e L di anticorpi umani. Tali geni ibridi devono essere inseriti mediante trasfezione genica in una cellula (trasfettoma) che diventerà così produttrice degli anticorpi chimerici. Gli anticorpi chimerici, pur mantenendo la specificità di riconoscimento dell anticorpo originale murino, sono meno immunogenici rispetto alle controparti Ig interamente murine e inducono meno anticorpi umani antitopo (human anti-mouse antibodies, HAMA) (34). Tuttavia, poiché la regione variabile che riconosce l antigene è comunque ancora murina, possono essere ancora prodotti anticorpi neutralizzanti. Gli anticorpi primatizzati, hanno la regione variabile codificata da geni di primati; la loro immunogenicità è ridotta ma sono ancora possibili reazioni da parte dell organismo ospite. Sono detti anticorpi umanizzati quelli in cui tutte le porzioni che non sono coinvolte nel legame con l antigene, escluse quindi le regioni ipervariabili, sono ottenute da sequenze geniche umane. Questi anticorpi vengono ottenuti mediante la tecnica del CDR-grafting, attraverso isolamento di c-dna delle catene L e H da ibridomi prodotti in topi transgenici in cui vengono inseriti geni umani. Si amplificano attraverso PCR le regioni variabili VH e VL degli anticorpi murini (CDR). Attraverso 6 cicli di mutagenesi vengono quindi sostituiti altrettanti frammenti CDR. Si clonano i geni ricombinanti in vettori di espressione, e quindi si introducono in cellule ospiti idonee (E.coli o mammifero)per la produzione degli anticorpi. Meno del 10% dell anticorpo monoclonale umanizzato ha sequenze geniche murine. Gli anticorpi monoclonali possono essere usati a scopo terapeutico come mab immodificati o non coniugati e come mab coniugati. Gli anticorpi non coniugati di classe IgG1 possono agire direttamente a livello cellulare provocando apoptosi, citotossicità complemento-mediata (CDC) e citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC). 31

32 Inoltre, gli anticorpi possono agire tramite il blocco di recettori per fattori di crescita provocando inibizione della crescita ed alterazioni del ciclo cellulare. Gli anticorpi coniugati non sfruttano l attività immunologica anticorpale ma servono per dirigere in maniera specifica il composto tossico a cui sono coniugati, come ad esempio agenti chemioterapici, tossine o radioisotopi.(38) L anticorpo monoclonale murino 4D5 è stato umanizzato ed il risultante anticorpo monoclonale anti-her2 umano ricombinante (rhumab-her2, Trastuzumab- Herceptin ) si è dimostrato efficace in trials clinici di fase II e III condotti su pazienti con tumore mammario metastatico. (39) Figura 16: Trastuzumab 2.4 TRASTUZUMAB AZIONE DEL FARMACO. Trastuzumab è un anticorpo monoclonale ricombinante umanizzato (Fig. 16), prodotto mediante un sistema di espressione genica in cellule di mammifero CHO. E stato sviluppato agli inizi degli anni 90.; possiede elevata affinità di legame per la proteina HER2/neu ed è in grado di inibirne gli effetti sulla trasformazione cellulare maligna a livello dei tessuti epiteliali. Si lega alla porzione extracellulare dei recettore Her2 (p105) e ne determina la downregolazione con alterazioni nella trasduzione dei segnali intracellulari HER2 mediati (40) (Fig. 17); inoltre accelera 32

33 l internalizzazione e la degradazione dei recettori HER2 dalla membrana cellulare. Trastuzumab è inoltre un potente mediatore della citotossicità anticorpo dipendente cellulo-mediata (ADCC) con reclutamento delle cellule natural killer (NK) attratte dal complesso anticorpo-her2. In vitro la ADCC è esercitata in maniera preferenziale sulle cellule tumorali con iperespressione di HER2 (38).(Fig 18) Numerosi studi in vitro hanno dimostrato che il Trastuzumab esercita la sua attività su linee cellulari umane di tumori della mammella, gastrici e dell ovaio che iperesprimono HER2 ma non su quelle che non lo iperesprimono.(41) Studi in vitro ed in vivo hanno dimostrato che Trastuzumab potenzia l effetto della terapia tradizionale. Figura 17:Legame selettivo di Herceptin al recettore Her2 33

34 Figura 18: Azione selettiva sulle cellule tumorali a causa della elevata espressione dei recettori UTILIZZO CLINICO. Il Trastuzumab è stato approvato nel 1998 negli Stati Uniti in combinazione con Paclitaxel nel trattamento di prima linea per neoplasie metastatiche della mammella con iperespressione della proteina HER2(2); è stato conseguentemente approvato in Europa nel Generalmente, nella pratica clinica i nuovi farmaci per il trattamento del cancro vengono utilizzati dapprima nella malattia metastatica.(42) Dopo che i farmaci hanno dimostrato di avere effetto positivo sulla malattia metastatica, seguono di consuetudine studi sul loro impiego nella terapia adiuvante e neoadiuvante. Il razionale per iniziare lo studio di Trastuzumab nel trattamento del carcinoma mammario operabile si è basato su una serie di fattori: - la malattia HER2 positiva è associata a prognosi sfavorevole; è una malattia aggressiva, con alto rischio di recidive e metastasi; - la positività HER2 è un evento precoce nello sviluppo del carcinoma mammario; - Trastuzumab è diretto in modo specifico contro il carcinoma della mammella HER2 positivo e, nella malattia metastatica, è associato ad un beneficio clinico significativo; 34

35 - Trastuzumab ha dimostrato di indurre scarsi effetti collaterali e di essere dotato di un profilo di tossicità favorevole. Trials clinici conclusi nel 2005 (40,41,42,43) hanno evidenziato che Trastuzumab somministrato a donne con carcinoma mammario HER2 positivo, in combinazione con agenti citotossici usati comunemente nella terapia adiuvante di carcinoma mammario, come Paclitaxel, Doxorubicina e Ciclofosfamide, riduce di circa la metà le recidive neoplastiche indipendentemente dallo stato dei recettori ormonali delle pazienti. Questi studi hanno anche dimostrato che la terapia adiuvante con Trastuzumab riduce il tasso di mortalità di un terzo. Inoltre riduce l incidenza di altri tipi di neoplasie primarie e la comparsa di neoplasie mammarie controlaterali. Lo studio HERA (42) ha inoltre valutato l efficacia del Trastuzumab somministrandolo per 1 anno ad un gruppo di pazienti e per 2 anni ad un secondo gruppo di pazienti ogni 3 settimane (8 mg/kg nella prima somministrazione e 6 mg/kg nelle somministrazioni seguenti). Questo studio ha evidenziato che il Trastuzumab, dopo un anno di somministrazione, riduce la percentuale di recidiva del 46% e determina un prolungamento della sopravvivenza del 20% TOLLERABILITA ED EFFETTI COLLATERALI. Una delle ragioni principali per l impiego di anticorpi monoclonali nel trattamento dei tumori risiede nella potenzialità di sfruttare la specificità e la sensibilità del sistema immunitario per ottenere effetti terapeutici selettivi senza che si manifesti la tossicità, talora grave, indotta dalla chemioterapia. Trastuzumab è generalmente ben tollerato con effetti collaterali di grado lieve-moderato. Tossicità cardiaca e reazioni anafilattiche gravi correlate all infusione sono gli eventi avversi associati a Trastuzumab maggiormente discussi. A causa della cardiotossicità del Trastuzumab non è infatti consigliabile in associazione con antracicline, anch esse potenzialmente dannose per il cuore; i rischi di danno cardiaco sono minori quando l anticorpo monoclonale viene impiegato da solo al termine della terapia (40). Inoltre 35

36 questo tipo di tossicità è reversibile nella maggior parte dei casi con la sospensione del farmaco, per cui l interruzione della terapia deve essere presa in considerazione nei pazienti che sviluppano insufficienza cardiaca clinicamente significativa. L insorgenza di sintomi dovuti a reazioni gravi correlate all infusione si verifica generalmente entro due ore dall inizio della prima infusione. Si manifestano con dispnea, broncospasmo e stress respiratorio. Alcune pazienti possono manifestare reazioni di tipo anafilattico con ipotensione e rash cutaneo. E stato dimostrato il passaggio di Trastuzumab attraverso la placenta durante lo sviluppo fetale; non è tuttavia noto se il farmaco possa provocare danni al feto se somministrato in gravidanza ATTUALE SOMMINISTRAZIONE DEL FARMACO. Il Trastuzumab è somministrato attualmente: - in combinazione con Docetaxel per il trattamento di prima linea di pazienti non precedentemente trattate con chemioterapia per malattia metastatica; - come trattamento di prima linea in combinazione con Paclitaxel in pazienti trattate in precedenza con antracicline o non idonee al trattamento con antracicline; - come monoterapia in pazienti trattate in precedenza per malattia metastatica; - nella terapia adiuvante in associazione con taxani ed ultimamente con agenti chemioterapici tra cui Vinorelbina, Gemcitabina e Capacitabina e nei casi ormono-responsivi, con Tamoxifene ed inibitori delle aromatasi (41). La tendenza attuale è di trattare le pazienti con Trastuzmab in monoterapia per 12 mesi dopo la fine della chemioterapia. Esiste una valida evidenza preclinica che suggerisce l esistenza di un interazione o di un crosstalk tra i segnali di trasduzione di HER2 e di ER.(Fig.19) 36

37 HER2 è in grado di attivare la via Ras/MAPK che a sua volta determina la fosforilazione e la conseguente attivazione del recettore degli estrogeni. Nei tumori con iperespresione di HER2, la fosforilazione e l attivazione della proteina AIB1 determinano un potenziamento dell attività trascrizionale del recettore estrogenico ed un aumento dell attività agonista del Tamoxifene. Attraverso MAPK vengono fosforilati sia il recettore che i coattivatori, promuovendo la proliferazione, mentre da parte del recettore viene favorita la produzione di fattori di crescita, che potenziano ulteriormente la via MAPK. Queste vie possono essere inibite somministrando farmaci come il Trastuzumab, in grado di bloccare la via di Ras, il loop di comunicazione con il recettore e di evitare la fosforilazione del coattivatore a livello del recettore estrogenico. Gli inibitori dell aromatasi, invece, riducendo la sintesi degli estrogeni, riducono l attivazione di ER: in questo modo ER non è più un target per la cascata delle MAPK indotta da HER2 e viene bloccato cosi il meccanismo di resistenza ipotizzato per il Tamoxifene.(45) Il promotore di HER2 contiene inoltre un elemento di risposta all estrogeno, il quale può inibire la trascrizione del gene; questo effetto è stato dimostrato in linee cellulari di carcinoma mammario MCF-7, nelle quali l estrogeno induce una diminuzione di HER2, mentre la presenza dell antiestrogeno porta a parziale inversione di questo effetto.(47) Un mediatore del segnale di HER2 stimola la fosforilazione di ER portando ad un aumento della trascrizione e della proliferazione; in questa situazione, l effetto agonista del Tamoxifene prevarica l effetto antagonista, convertendolo da soppressore a stimolatore delle cellule di tumore mammario. Questo fenomeno potrebbe in parte spiegare la relativa resistenza che tumori ER ed HER2 positivi mostrano al trattamento con Tamoxifene.(47) Si deduce che la via del duplice bersaglio ER ed HER2 rappresenti una ragionevole opzione terapeutica. 37

38 Figura 19: Interconnessioni esistenti tra le vie di trasduzione del segnale mediate da HER2 ed ER 38

39 2.5 LO STADIO DELLA NEOPLASIA. I tumori sono classificati assegnando loro uno stadio; la stadiazione (staging) è il processo attraverso cui si determina quanto il tumore è progredito (cioè l estensione anatomica della neoplasia) allorché diagnosticato. Lo stadio viene determinato mediante esami che si eseguono sul tumore, sui linfonodi e su organi distanti, e rappresenta il fattore più importante per scegliere il miglior trattamento poiché è predittivo dell evoluzione (prognosi) della malattia. Il sistema classificativo generalmente usato è il sistema TNM, dove T ( Tumor = tumore) indica le dimensioni in centimetri della neoplasia, N ( Nodes = linfonodi) si riferisce alla diffusione dei linfonodi che si trovano nell area della mammella (cioè i linfonodi regionali) e M ( Metastasis = metastasi) sta per metastasi a distanza, cioè in organi del corpo distanti dalla sede primitiva del tumore. Nella stadiazione TNM, le informazioni relative al tumore, ai linfonodi regionali ed alle metastasi a distanza vengono associate per definire lo stadio. Gli stadi della neoplasia sono descritti con numeri romani da I a IV. Lo stadio clinico (ctnm) è determinato in base alle informazioni derivanti dalla visita medica e dagli esami imaging (per es. radiografie, mammografia, ecc). Lo stadio patologico (ptnm), invece, comprende i risultati degli esami eseguiti sul pezzo operatorio ed è, di certo, il più importante, perché fornisce informazioni sullo stato linfonodale, cioè sull eventuale diffusione del tumore ai linfonodi, fatto in genere non noto fino a che i linfonodi non sono stati esaminati istologicamente (per valutare la presenza di macrometastasi) e tramite indagini immunoistochimiche (per valutare la presenza di micro metastasi). 39

40 2.5.1 DEFINIZIONE DEL TNM NEL CARCINOMA MAMMARIO Norme per la classificazione. Stadiazione clinica: la stadiazione clinica comprende l esame obiettivo, con accurata ispezione e palpazione della cute, della mammella e dei linfonodi (ascellari, sopraclavicolari e cervicali), l imaging radiologico e l esame istologico della mammella e di altri tessuti, come si ritiene necessario al fine di stabilire la diagnosi di carcinoma della mammella. La quantità di tessuto esaminata dal patologo per la stadiazione clinica è molto inferiore rispetto a quella necessaria per la stadiazione patologica. I dati radiologici sono utili al fine della stadiazione se eseguiti entro 4 mesi dalla diagnosi, purchè non si sia verificata una progressione della malattia o la paziente sia in fase di esecuzione del programma chirurgico. I dati forniti dall imaging comprendono le dimensioni del tumore primitivo e l invasione della parete toracica, e la presenza o l assenza di metastasi regionali o a distanza. I dati radiologici e quelli chirurgici dopo trattamento neoadiuvante di tipo chemioterapico, ormonoterapico, immunoterapico o radiante non sono validi ai fini della stadiazione iniziale. Stadiazione patologica: la stadiazione patologica comprende tutte le informazioni fornite dalla stadiazione clinica e quelle ottenute nel corso dell intervento esplorativo e recettivo, oltre ai dati forniti dall esame istologico del tumore primitivo, dei linfonodi regionali e delle sedi di metastasi (se possibile), purchè venga effettuata almeno l asportazione del tumore primitivo senza alcuna evidenza macroscopica di tumore sui margini di resezione all esame patologico. Un tumore può essere classificato patologicamente in base al pt se è presente solo interessamento microscopico, ma non macroscopico, dei margini di resezione. Se questi risultano microscopicamente interessati, la neoplasia viene classificata ptx, poiché non è possibile stabilire l esatta dimensione. Se il tumore primitivo è invasivo (e non solo microinvasivo), è necessaria la dissezione linfonodale almeno del I livello, ovvero dei linfonodi posti lateralmente al margine laterale del muscolo piccolo pettorale, per poter effettuare la classificazione patologica (pn). Questo intervento permette di 40

41 esaminare 6 o più linfonodi. In alternativa, per formulare la stadiazione patologica si può ricorrere alla biopsia di uno o più linfonodi sentinella. Alcuni istotipi, come il carcinoma tubulare vero < 1 cm, il carcinoma mucinoso vero < 1 cm ed il carcinoma microinvasivo, hanno un rischio molto basso per metastasi linfonodali ascellari e solitamente, in questi casi non è necessario eseguire una dissezione ascellare. I noduli tumorali rinvenuti nel tessuto adiposo ascellare adiacente la mammella, senza evidenza istologica di tessuto linfatico residuo, vengono classificati come metastasi linfonodali regionali (N). La suddivisione in stadi patologici comprende una delle seguenti combinazioni di classificazione clinica e patologica: pt pn pm o pt pn cm o ct cn pm. In caso di intervento chirurgico eseguito dopo un trattamento chemioterapico, ormonoterapico, immunoterapico o radiante, bisogna aggiungere il prefisso y nella classificazione TNM, p.e. yptnm Linfonodo sentinella. Il trattamento del tumore della mammella ha subito profonde modificazioni a partire dagli anni settanta, quando l avvento della chirurgia conservativa ha rivoluzionato l approccio al carcinoma della mammella, permettendo la conservazione del seno nelle donne con tumore mammario di piccole dimensioni. Negli anni, le tecniche di chirurgia conservativa si sono progressivamente affinate, e la ricerca clinica ha coinvolto progressivamente anche il trattamento chirurgico dei linfonodi ascellari; a tale proposito la biopsia del linfonodo sentinella ha ormai dimostrato la sua validità in una grande percentuale di tumore in stadio precoce. Il concetto di linfonodo sentinella è stato sviluppato nel 1992 da Morton ( J. Wayne Cancer Center, Los Angeles) (50). Assumendo che, nei pazienti affetti da melanoma, le metastasi per via linfatica precedono quelle per via ematogena, Morton sviluppò una tecnica diagnostica in grado di stadiare le regioni linfonodali potenzialmente coinvolte, al fine di selezionare i pazienti da sottoporre a resezione completa dei linfonodi regionali. Morton dimostrò che ad ogni determinata regione cutanea corrisponde una ben definita area di drenaggio linfatico, e che il drenaggio avviene 41

42 costantemente verso il linfonodo sentinella. L assenza di malattia del linfonodo sentinella indica con alta probabilità che anche i rimanenti linfonodi sono liberi da malattia. La localizzazione del linfonodo sentinella messa a punto da Morton prevede l inoculo intradermico di un colorante (il vital blue dye) a livello della lesione primitiva e l individuazione del linfonodo praticando un incisione cutanea, seguendo la diffusione linfatica del colorante. Giuliano et al (51,52) usando il vital blue dye in pazienti affette da carcinoma della mammella hanno indicato la validità di questo concetto anche in queste neoplasie. La procedura di vital blue dye è comunque una tecnica limitata da una procedura alquanto laboriosa, che prevede una grande esperienza da parte degli operatori, con percentuali di successo nell identificazione del linfonodo sentinella non elevatissime. La linfoscintigrafia è un esame medico-nucleare che ha in parte sostituito l iniezione di colorante vitale nell identificazione del linfonodo sentinella nel carcinoma della mammella (53). Attualmente l identificazione del linfonodo sentinella è una pratica standard nel trattamento dei carcinomi della mammella di piccole dimensioni. La biopsia del linfonodo sentinella permette di evitare la dissezione completa dei linfonodi ascellari nelle pazienti in cui il linfonodo sentinella è risultato negativo, eliminando quindi tutte le sequele che ne possono conseguire. Le più frequenti complicanze che si possono verificare in seguito ad un intervento chirurgico di dissezione dei linfonodi ascellari sono l insorgenza di linfedema secondario dell arto con conseguente limitazione funzionale, parestesie e più raramente, linfocele e processi infettivi. Il rischio di falsi negativi è basso e può essere ulteriormente ridotto escludendo i casi di tumore multicentrico. (54) 42

43 Classificazione TNM. Tumore primitivo (T) TX T0 Tis Tis (DCIS) Tis (LCIS) Il tumore primitivo non può essere definito. Non segni di tumore primitivo. Carcinoma in situ. Carcinoma duttale in situ. Carcinoma globulare in situ. Tis (Paget s) Malattia di Paget del capezzolo senza nodulo. T1 T1mic T1a T1b Tumore di 2 cm o meno nella dimensione massima. Microinvasione di 1 mm nel suo diametro maggiore. Tumore di 0,5 cm o meno nella sua dimensione massima. Tumore superiore a 0,5 cm, ma non più di 1 cm nella dimensione massima. T1c Tumore superore a 1 cm, ma non più di 2 cm nella dimensione massima. T2 Tumore superiore a 2 cm, ma non più di 5 cm nella dimensione massima. T3 T4 Tumore superiore a 5 cm nella dimensione massima. Tumore di qualsiasi dimensione con estensione diretta alla parete toracica (a), o alla cute (b), come di seguito riportato. T4a Estensione alla parete toracica con esclusione dei muscoli pettorali. T4b Edema (inclusa la pelle a buccia d arancio), o ulcerazione della cute della mammella o noduli satelliti situati sulla medesima mammella. 43

44 T4c Presenza contemporanea delle caratteristiche 4a e 4b. T4d Carcinoma infiammatorio. Linfonodi regionali (N) NX I linfonodi regionali non possono essere definiti (ad esempio se precedentemente asportati). N0 N1 N2 Non metastasi nei linfonodi regionali. Metastasi in linfonodo(i) ascellare(i) omolaterale(i) mobile(i). Metastasi in linfonodi ascellari omolaterali fissi o a pacchetto, o in linfonodi mammari interni omolaterali clinicamente apparenti * in assenza di metastasi clinicamente evidenti nei linfonodi ascellari. N2a Metastasi ai linfonodi ascellari omolaterali fissi tra loro ( a pacchetto ) o adesi ad altre strutture. N2b Metastasi solo in linfonodi mammari interni omolaterali clinicamente apparenti * e in assenza di metastasi linfonodali ascellari clinicamente evidenti. N3 Metastasi in linfonodo(i) infraclavicolare(i) in assenza o meno di interessamento dei linfonodi ascellari o con metastasi clinicamente apparenti * in linfonodo(i) omolaterale(i) della mammaria interna o la presenza di metastasi clinicamente evidenti nei linfonodi ascellari; o presenza di metastasi in linfonodo(i) sopraclavicolare(i) con o senza interessamento dei linfonodi ascellari o mammari interni. N3a N3b Metastasi in linfonodo(i) omolaterale(i) infraclavicolare(i). Metastasi in linfonodo(i) mammari(o) interno(i) e ascellare(i). 44

45 N3c Metastasi in linfonodo(i) sopraclavicolare(i) omolaterale(i) * Clinicamente apparente si riferisce al riscontro mediante imaging radiologico (linfoscintigrafia esclusa) o valutazione clinica o riscontro patologico macroscopico. Metastasi a distanza (M) MX M0 M1 La presenza di metastasi non può essere accertata. Non metastasi a distanza. Metastasi a distanza. 45

46 2.6 GRADING ISTOLOGICO. Tutti i carcinomi mammari invasivi, ad eccezione del carcinoma midollare, devono essere contrassegnati da grading. Il grading di un tumore viene determinato stabilendo le caratteristiche morfologiche, assegnando un valore da 1 (favorevole) a 3 (sfavorevole) per ognuna delle caratteristiche, sommando poi tutti i punteggi delle tre categorie. Un valore combinato di 3-5 punti contrassegna un grado 1; un valore combinato di 6-7 punti il grado 2; un valore combinato di 8-9 punti il grado 3. GX Il grado di differenziazione non può essere definito. G1 G2 Grading istologico combinato basso (favorevole). Grading istologico combinato intermedio(moderatamente favorevole). G3 Grading istologico combinato elevato (sfavorevole). 46

47 3. RAZIONALE DELLO STUDIO. In questo studio è stato esaminato lo stato del gene HER2 in 53 pazienti sia con la metodica FISH che con la metodica SISH, con lo scopo di verificare l interscambiabilità delle due tecniche dal punto di vista della specificità e dell accuratezza. I criteri da rispettare sono stati quelli definiti dalle linee guida dell ASCO/CAP, che richiedono una concordanza uguale o maggiore del 95%.(4) Nella seconda parte dello studio si è valutato lo stato del gene HER2 utilizzando la sola tecnica SISH in 30 casi debolmente positivi ai saggi di immunoistochimica (score 1+), i quali routinariamente vengono giudicati a priori non idonei alla terapia con Trastuzumab.(2) Un amplificazione genica significativa in questi, casi avrebbe potuto influenzare gli attuali trial clinico-farmacologici. 47

48 4. MATERIALI E METODI. 4.1 SCELTA DEI PAZIENTI CONFRONTO DELLA METODICA FISH CON LA METODICA SISH. Sono stati analizzati 53 pazienti, di cui 52 donne ed 1 uomo, aventi tutti neoplasie della mammella infiltranti: - 41/53 pazienti affetti da carcinoma duttale infiltrante, di cui 15 con metastasi linfonodali; - 5/53 pazienti affetti da carcinoma lobulare infiltrante, di cui 2 con metastasi linfonodali; - 2/53 pazienti affetti da carcinoma misto duttulo-lobulare, entrambi con metastasi linfonodali; 5/53 pazienti affetti da carcinoma infiltrante di cui non si conosce l istotipo. In termini assoluti e percentuale, 20 (37.7%) pazienti avevano linfonodi positivi, 41 (77.3%) avevano i recettori ormonali positivi. La grandezza del tumore variava da 0 a 2 cm (T1) in 25 pazienti (47.%), da 2 a 5 cm (T2) in 16 pazienti (30%.) ed era inferiore a 5 cm (T3 e T4) in 7 pazienti (13.%). In 5 pazienti (9.%) non è stato possibile effettuare la classificazione isotipica della neoplasia in 5 casi su 53 a causa del tipo di prelievo effettuato (piccole biopsie escissionali o mammotome). Non si è inoltre potuto studiare il T (TNM) nei casi di asportazione parziale della neoplasia o nodulectomie, l N (TNM) nei casi di quadrantectomie senza l asportazione di cavo ascellare intero o linfonodo sentinella. La presenza di metastasi a distanza M (TNM) non è stata valutata. L età massima dei pazienti esaminati è di 96 anni, l età minima di 33 anni, l età media di 63,6 anni. La valutazione dello stato dei recettori ormonali attraverso indagine immunoistochimica ha evidenziato che: - 22/53 pazienti hanno recettori estrogenici maggiori del 50% ; 48

49 - 19/53 pazienti hanno recettori estrogenici minori od uguali al 50%; - 12/53 pazienti hanno recettori estrogenici completamente negativi. Caratteristica fondamentale di tutti i pazienti esaminati è lo score 2+ all Hercept Test (DAKO CYTOMATION) VALUTAZIONE DELLO STATO DEL GENE HER2 IN PAZIENTI CON SCORE 1+ ALL HERCEPT TEST Sono stati studiati 30 pazienti, tutte donne, con neoplasie infiltranti della mammella: - 22/30 pazienti affetti da carcinoma duttale infiltrante, 5/22 con metastasi linfonodali; - 3/30 pazienti affetti da carcinoma invasivo generico; - 4/30 pazienti affetti da carcinoma lobulare, 1/4 con metastasi linfonodali; - 1/30 pazienti affetti da carcinoma duttulo-lobulare L età massima dei pazienti è di 92 anni, l età minima di 33 anni, l età media di 65,6 anni. I pazienti in esame sono stati scelti in base alla loro nulla/scarsa positività ai recettori ormonali (ER e PR): - 7/30 pazienti hanno entrambi i recettori ER e PR negativi (-/-); - 2/20 pazienti hanno il recettore ER negativo ed il recettore PR positivo (-/+); - 6/30 pazienti hanno il recettore ER positivo ed il recettore PR negativo (+/-); - 15/3 pazienti hanno entrambi i recettori ER e PR positivi (+/+). La positività di un singolo recettore o di entrambi i recettori non ha mai superato la soglia del 40%. - 25/30 pazienti con recettori estrogenici aventi score minore o uguale al 30%; - 5/30 pazienti con recettori estrogenici aventi score compreso tra il 30% ed il 40%; - 29/30 pazienti con recettori progestinici aventi score minore o uguale al 30%; - 1/30 pazienti con recettori progestinici aventi score compreso tra il 30 ed il 40%. 49

50 In questi casi, una percentuale bassa (<50%) di cellule tumorali era positiva ai recettori ormonali; la terapia ormonale basata sull utilizzo di antagonisti degli estrogeni sarebbe stata in grado di agire solo a livello delle poche cellule tumorali positive agli anticorpi anti-er e anti-pr. Più della metà di cellule che formano la neoplasia erano quindi non responsive al Tamoxifene e agli inibitori delle aromatasi. La presenza del gene HER2 amplificato avrebbe potuto validare il razionale relativo all utilizzo del Trastuzumab come terapia adiuvante dopo chemioterapia classica. 50

51 4.2 DETERMINAZIONE DEI FATTORI PROGNOSTICI. La valutazione dei fattori prognostici del cancro della mammella viene eseguita routinariamente attraverso tecniche di immunoistochimica su sezione istologica fissata in formalina ed inclusa in paraffina. Mediante queste tecniche è possibile valutare l espressione di HER2/neu, l indice di proliferazione (mediante la valutazione della molecola Ki67) e la positività di recettori per gli estrogeni e per il progesterone. L immunoistochimica si basa su reazioni immunoenzimatiche che utilizzano anticorpi direttamente coniugati con un enzima o sistemi che veicolano una molecola enzimatica utilizzata come tracciante. (55) L enzima teoricamente deve: - essere reperibile in forma pura, - possedere un basso peso molecolare (per limitare l ingombro sterico); - non denaturare l immunoglobulina vettrice; - conservare la propria attività dopo coniugazione; - formare legami stabili con l anticorpo o con le altre proteine utilizzate nel sistema di rivelazione; - risultare assente nei tessuti da analizzare. La perossidasi è un enzima di 40 Kda ottenuto dal rafano, del quale sono conosciute numerose isoforme; in realtà viene utilizzato solo l isoenzima dotato di caratteristiche isoelettriche più vicine a quelle fisiologiche. La molecola di perossidasi, forma con l immunoglobulina un legame di tipo covalente e catalizza una reazione di ossido-riduzione, nella quale un substrato ridotto rilascia elettroni che ossidano un cromogeno; il substrato è il perossido di idrogeno che viene ridotto ad acqua dalla perossidasi e, liberando ossigeno nascente, fornisce l elemento ossidante per il cromogeno. Il cromogeno utilizzato è il tetracloruro di 3,3 -diaminobenzidina (DAB) che, in presenza di perossidasi, produce un prodotto di ossidazione insolubile in alcool, colorato in bruno, precipitante sul luogo di reazione; il principale svantaggio della diaminobenzidina è la sua nocività, essendo una sostanza potenzialmente oncogena; essa è inattivata con una concentrazione almeno 10 volte maggiore di candeggina. 51

52 Il metodo di rivelazione utilizzato è l ABC complex (complesso avidinabiotina). Questa tecnica include 3 stadi: - nel primo stadio la sezione istologica è messa a contatto con l antisiero primario (anticorpo primario) non marcato; - nel secondo stadio la sezione è incubata con antisiero secondario precedentemente biotinilato e diretto contro l antisiero primario. La biotina è una vitamina idrosolubile di dimensioni molto ridotte (peso molecolare 244 dalton) ed è utilizzata in immunoistochimica perché le sue ridotte dimensioni consentono di coniugare molte molecole di biotina ad un singolo anticorpo senza alterarne le caratteristiche funzionali e perché ha affinità elevata per la streptavidina; - nel terzo stadio, la sezione cosi preparata viene esposta al complesso ABC, costituito da una miscela di streptavidina e di perossidasi biotinilata. La streptavidina è una molecola estratta dallo Streptomyces avidinii, analoga all avidina e, come questa, possiede quattro siti leganti la biotina. A differenza dell avidina, è una proteina (e non una glicoproteina) ed ha un punto isoelettrico neutro: per questi motivi dà meno colorazione aspecifica di fondo, ed ha sostituito l avidina in molte applicazioni immunocitochimiche La biotinilazione è la reazione chimica che consente di coniugare la biotina ad altre molecole: dapprima la biotina viene attivata attraverso una reazione di esterificazione e in seguito viene legata ai residui amminici delle molecole enzimatiche. (56) La stechiometria della reazione è calcolata in modo che l enzima biotinilato si leghi alla streptavidina e che quest ultima conservi almeno un sito libero per legarsi, a sua volta, con la biotina presente sull anticorpo secondario. La tecnica, ABC (figura 20) è caratterizzata da elevata sensibilità in quanto consente di inserire, sull anticorpo secondario, più complessi avidinaperossidasi biotinilata, aumentando la risposta cromatica. (57) 52

53 Figura 20: Rappresentazione del metodo ABC. E importante ricordare che la perossidasi è presente fisiologicamente in vari tessuti tra cui le cellule del sangue,la milza, il fegato, l utero, le ghiandole lacrimali, la mucosa intestinali e il polmone. La reazione substrato-cromogeno utilizzata non può distinguere tra l enzima che fa parte del sistema sperimentale che localizza immunologicamente l Ag cellulare ed una attività enzimatica simile presente fisiologicamente nel campione; per evitare falsi positivi dovuti a perossidasi endogene al tessuto si esegue una pre-incubazione delle sezioni con perossido di idrogeno (H 2 O 2 ), al fine di spegnere la loro attività. La biotina è normalmente presente in alcune cellule e tessuti umani (fegato, rene, tessuto adiposo); teoricamente ad essa può legarsi la streptavidina marcata, causando la comparsa di colorazione falso-positiva. Per ovviare a questa eventuale causa di artefatto è possibile procedere al blocco dalla biotina endogena, mediante incubazione con avidina non marcata; in realtà tale procedura però non è particolarmente diffusa perché la biotina endogena non sembra in grado di legare la streptovidina quando fa parte del complesso ABC. 53

54 La valutazione dei fattori prognostici nelle neoplasie mammarie include l identificazione di specifici antigeni proteici nelle cellule neoplastiche, ed in particolare: Ki67 (Mib-1): antigene associato alla proliferazione cellulare e reperibile attraverso le varie fasi del ciclo cellulare (G1,S,G2,M) ma assente nelle cellule quiescenti. E un marker utile per lo studio della proliferazione cellulare nelle popolazioni di cellule neoplastiche e può essere usato per stabilire la frazione delle cellule proliferanti in una neoplasia. Si osserva una marcatura nucleare.(fig 21) Figura 21: Marcatura nucleare con anticorpo anti-ki67(dbs) RECETTORI PER GLI ESTROGENI: questi antigeni sono localizzati nei nuclei delle cellule epiteliali nel carcinoma della mammella, e costituiscono importanti regolatori di crescita e differenziazione nella ghiandola mammaria. La presenza di ER a livello nucleare nei tumori della mammella può essere predittiva di responsività alla terapia ormonale con Tamoxifene o inibitori delle aromatasi. Presentano marcatura nucleare.(fig. 22) 54

55 Figura 22: Marcatura nucleare con anticorpo anti-er (NeoMarkers RECETTORI PER IL PROGESTERONE: Esistono due isoforme di 116 KDa e 81 KDa; funzionano da ligandi che attivano fattori di trascrizione che regolano l espressione dei geni bersaglio. Sono utilizzati per determinare la possibile responsività del tumore alla terapia ormonale. Presentano una marcatura nucleare.( Fig. 23) Figura 23: Marcatura nucleare con anticorpo anti-pr (NeoMarers) 55

56 HER2: L identificazione corretta dell iperespressione di HER2 ha una forte valenza prognostica e predittiva ed è il più importante pre-requisito alla terapia con Trastuzumab. Per la ricerca della proteina è stato utilizzato il Kit Hercept Test (DAKO CYTOMATION) FDA approved. La valutazione dell iperespressione di Her2 avviene attraverso uno score: 0 la reattività di membrana è completamente assente; 1+ la reattività di membrana è rilevabile in più del 10% delle cellule neoplastiche, ma è incompleta (presente solo in parti di membrana cellulare) e debole; 2+ la reattività di membrana è completa (presenta con la stessa intensità su tutta la membrana cellulare), di intensità moderata e rilevabile in più del 10% delle cellule neoplastiche; 3+ la reattività di membrana è completa, forte, e rilevabile in più del 10% delle cellule tumorali.( Fig. 24) Figura 24: Esempi di preparato istologico derivati da carcinoma mammario con score all Hercept test e 3+ Per garantire una corretta valutazione di Her2/neu in IHC è fondamentale tener conto delle seguenti osservazioni (58): 56

57 - La fissazione in formalina è una tappa molto importante, una fissazione breve può indurre falsi positivi, viceversa, una prolungata fissazione è responsabile di falsi negativi; - Occorre trascurare l immunoreattività citoplasmatica aspecifica; - E necessario ignorare le componenti neoplastiche in situ e valutare solo quelle invasive; - L anticorpo va titolato in modo tale che la componente epiteliale benigna risulti negativa; - Va valutata solo la positività di membrana espressa in maniera completa, la quale deve essere almeno del 10%; - L intensità della positività deve essere determinata nella maniera più oggettiva possibile. 4.3 SISH (SILVER ENHANCED IN SITU HYBRIDIZATION) INFORM HER2 DNA Probe (VENTANA MEDICAL SYSTEM) PRINCIPIO DELLA PROCEDURA. La SISH è una metodica quasi completamente automatizzata che permette la visualizzazione quantitativa delle copie del gene HER2 mediante ibridazione in situ con argento. La rilevazione è effettuata su campioni di tessuto tumorale mammario umano fissato in formalina ed incluso in paraffina. I vetrini vengono privati della paraffina e sottoposti a trattamento con proteasi per permettere alle sonde di penetrare nelle cellule; tali sonde, marcate con DNP (2,4 dinitrofenolo),si legano a specifiche sequenze target di DNA. 57

58 Il probe, è visualizzato mediante l utilizzo di un anticorpo primario anti- DNP di coniglio ed anticorpo secondario anti-coniglio di capra coniugato a perossidasi di rafano (HRP) utilizzato come substrato cromogenico. La reazione di ibridazione in situ con argento è indotta dall aggiunta in sequenza di argento acetato, idrochinone e perossido di idrogeno. In questa reazione gli ioni argento (Ag+) sono ridotti dall idrochinone in atomi di argento metallico. Il precipitato di argento si deposita nei nuclei e una singola copia del gene HER2 (17q11.2-q2), o il centromero del cromosoma 17, viene visualizzata come punto nero.( Fig. 25) Il campione viene successivamente controcolorato e disidratato per l interpretazione al microscopio ottico. La procedura consente di visualizzare su un campione di tessuto lo stato del gene HER2 della neoplasia e contemporaneamente, su un altro campione di tessuto, lo stato del cromosoma 17. Figura 25: L HRP catalizza la riduzione dello ione argento ad argento metallico e permette la visualizzazione del gene Her2 o del centromero del cromosoma

59 4.3.2 CONTROLLO DI QUALITA Il controllo esterno di qualità della metodica è rappresentato da tre distinte sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in un singolo blocco di paraffina (Her2 3-in-1 Xenograft Control Slides): BT474, ZR-75-1, MCF7. Le tre sezioni di tessuto derivano da tumori prodotti in topi SCID e derivati da tre linee cellulari di carcinoma mammario umano, ognuna con un diverso stato del gene HER2. Quando il sistema ed i reagenti funzionano correttamente il controllo BT474 deve presentare la maggior parte del segnale nelle cellule tumorali vitali, mentre il controllo ZR-75-1 ed il controllo MCF7 devono rivelare segnali discreti. Il controllo esterno di qualità della metodica è rappresentato da tre distinte sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in un singolo blocco di paraffina (Her2 3-in-1 Xenograft Control Slides): BT474, ZR-75-1, MCF7. Le tre sezioni di tessuto derivano da tumori prodotti in topi SCID e derivati da tre linee cellulari di carcinoma mammario umano, ognuna con un diverso stato del gene HER2. Quando il sistema ed i reagenti funzionano correttamente il controllo BT474 deve presentare la maggior parte del segnale nelle cellule tumorali vitali, mentre il controllo ZR-75-1 ed il controllo MCF7 devono rivelare segnali discreti Linea Livello di Numero approssimativo Stato del cellulare espressione della del gene Her2 tramite gene proteina HER2 FISH BT maggiore o uguale a 20 amplificato copie/nucleo ZR copie/nucleo non amplificato MCF copie/nucleo non amplificato Tabella 2: linee cellulari di controllo SISH 59

60 Figura 26: INFORM HER2 DNA Probe della linea cellulare BT474 (Interpretative guide for Ventana INFORM HER2 DNA Probe Staining of Breast Carcinoma) Figura 27: INFORM HER2 DNA Probe della linea cellulare ZR-75-1 (Interpretative guide for Ventana INFORM HER2 DNA Probe Staining of Breast Carcinoma) INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI. Lo stato del gene HER2 è una funzione del rapporto tra il numero di copie del gene HER2 ed il numero di copie del cromosoma 17 per ogni cellula (59,60). - Rapporto HER2/Chr17 inferiore a 1,8 campione negativo per amplificazione del gene; - Rapporto HER2/Chr17 compreso tra 1,8 e 2,2 campione ambiguo per amplificazione del gene HER2; 60

61 - Rapporto HER2/Chr17 superiore a 2,2 campione positivo per amplificazione del gene HER2 Rapporto medio Risultati HER2/Chr 17 HER2/Chr 17 < 1.8 Negativo per amplificazione gene HER2 1.8 HER2/Chr Equivoco per amplificazione gene HER2 HER2/Chr17>2.2 Positivo per amplificazione gene HER2 Tabella 3: Scoring SISH Il singolo vetrino per la determinazione dello stato del gene HER2 o del cromosoma 17 deve soddisfare due criteri per essere ritenuto adeguato: 1) deve contenere un controllo interno positivo rappresentato da cellule non neoplastiche tra le quali fibroblasti stromali, cellule endoteliali, linfociti e cellule epiteliali mammarie benigne; 2) deve includere cellule tumorali di carcinoma mammario invasivo visibili e di cui è possibile la conta usando fattori di ingrandimento 20x e 40x. L area target per la valutazione del segnale deve essere ottimale, con segnale SISH chiaro e visibile e con nuclei non sovrapposti, non necrotici e non compressi. In alcuni casi, il carcinoma mammario può contenere aree di tessuto con carcinoma invasivo geneticamente eterogenee, questo fenomeno può essere visibile all interno di un unica area target o in aree target differenti. La visualizzazione dei segnali SISH include i segnali evidenziabili in copia singola, copie multiple e come cluster. I punti singoli discreti, visualizzati nei nuclei del controllo positivo, sono usate come riferimento per le dimensioni di una copia singola nelle cellule del carcinoma invasivo; la dimensione dei punti singoli è usata come 61

62 riferimento il numero relativo di copie amplificate nei nuclei cellulari tumorali. Un cluster di segnali, in base alle sue dimensioni, viene conteggiato come 6 o 12 copie del gene.(fig. 28) Figura 28: Visualizzazione dei segnali in punti discreti e cluster (Interpretative guide for Ventana INFORM HER2 DNA Probe Staining of Breast Carcinoma) DETERMINAZIONE DELLO STATO DEL GENE HER2. Lo stato del gene HER2 può essere determinato mediante la tecnica SISH utilizzando due metodiche: il metodo semi-quantitativo ed i metodo quantitativo. (60) 62

63 Figura 29: Rappresentazione schematica dei metodi di determinazione dello stato del gene HER Metodo semiquantitativo. Il metodo semiquantitativo permette di fare una stima semi-quantitativa del numero di segnali di Her2 e di Chr17 presenti in un area target (campo visivo) specifica, uguale per entrambi i vetrini. Se il rapporto Her2/Chr17 è inferiore a 1,4, il preparato è negativo per l amplificazione del gene Her2, se il rapporto è superiore a 4,0 il preparato è positivo mentre se il rapporto è compreso tra 1,4 e 4,0, il preparato deve essere valutato attraverso il metodo quantitativo.(fig. 29) Metodo quantitativo. Il metodo quantitativo si basa sul conteggio del numero dei segnali del gene Her2 e del Chr17 contenuti in 20 cellule all interno di un area target. Se il rapporto Her2/Chr17 è inferiore a 1,8 il preparato è negativo per l amplificazione del gene Her2, se il rapporto è superiore a 2,2 il preparato è positivo mentre se il rapporto è compreso tra 1,8 e 2,2 il preparato va rivalutato attraverso il conteggio di altre 20 cellule in un altra area target. Il rapporto sarà poi valutato sul totale di segnali Her2 e Chr17 presenti in 40 cellule.( Fig 29) 63

64 4.4 FISH (FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION) Vysis PathVysion HER2 DNA Probe PRINCIPIO DELLA PROCEDURA (63) Nella presente tesi è stato utilizzato il test Vysis PathVysion HER2 DNA Probe sul gene HER2(neu); esso è un saggio di ibridazione in situ in fluorescenza diretta per la determinazione quantitativa dell amplificazione del gene HER2 in tessuti di carcinoma mammario fissati in formalina ed inclusi in paraffina. Dopo la paraffinatura del preparato e la reidratazione, i campioni sono digeriti mediante l utilizzo di pepsina. In seguito il kit impiega una miscela di sonde, che include una sonda di DNA Locus Specific Identifier (LSI) HER2/neu (17q11.2-q12) lunga 190 Kb e direttamente marcata con SpectrumOrange ed una sonda DNA Chromosome Enumeration Probe (CEP) 17 lunga 5,4 Kb marcata direttamente con SpectrumGreen specifica per la sequenza di DNA alfa satellite nella regione del centromero. del cromosoma 17. (64) Si colloca il vetrino in forno di ibridazione a 82 ± 2 C. Il campione viene denaturato per 5 minuti, assicurandosi che la temperatura del blocco non scenda al di sotto degli 80 C. I vetrini vengono poi collocati all interno di una camera di ibridazione umidificata precedentemente riscaldata. Si lasciano incubare tutta la notte (14-20 ore) a 45 ± 2 C. L ibridazione specifica ai due siti bersaglio porta alla formazione di un segnale fluorescente rosso in corrispondenza di ciascun locus del gene HER2 e ad un segnale fluorescente verde in corrispondenza di ciascun centromero del cromosoma 17. Per minimizzare la colorazione di fondo e sopprimere i segnali che derivano da sequenze omologhe e presenti su altri cromosomi, nella miscela è contenuto anche DNA bloccante non marcato. 64

65 La mattina seguente, dopo un lavaggio in condizioni di stringenza, i campioni sono controcolorati con DAPI (4,6 diamidino-2-fenilindolo), un colorante specifico per DNA a fluorescenza blu. Fluorocromo Lunghezza d onda di eccitazione Lunghezza d onda di emissione FITC 495 nm 520 nm TEXAS RED 596 nm 615 nm Tabella 4: filtri per microscopio a fluorescenza INTERPRETAZIONE DELLA COLORAZIONE Tessuti idonei alla valutazione Devono essere considerati per l analisi solamente i campioni provenienti da pazienti con carcinoma mammario invasivo. Nei casi di carcinoma in situ ed invasivo nello stesso campione, va considerata solamente la componente invasiva. Bisogna evitare le aree di necrosi e laddove i bordi nucleari risultano ambigui ed ignorare i nuclei con intensità di segnale debole e con fondo non specifico o elevato Conteggio dei segnali Occorre collocare il tumore nel contesto del vetrino colorato con ematossilina ed eosina e valutare la stessa area sul vetrino colorato secondo la tecnica FISH. 65

66 E necessario considerare numerose aree del vetrino per giustificare l eventuale eterogeneità. Si seleziona un area caratterizzata da una buona distribuzione cellulare e si comincia l analisi sul quadrante in alto a sinistra dell area scelta e, eseguendo l esame da sinistra a destra, si conta il numero dei segnali all interno del bordo nucleare di ciascun nucleo esaminato secondo le seguenti linee guida: - Occorre variare la profondità del fuoco per rilevare tutti i segnali del nucleo; - E opportuno contare 2 segnali di dimensioni uguali e separati da una distanza pari od inferiore al diametro del segnale come un solo segnale; - Nei nuclei con elevati livelli di amplificazione del gene HER2, i segnali HER2 possono essere posizionati molto vicini l uno all altro, formando un cluster di segnali. In questi casi, il numero di segnali HER2 non può essere contato, ma deve essere stimato. Occorre prestare attenzione ad i segnali verdi, dal momento che i cluster dei segnali HER2 possono ricoprire tali segnali rendendoli invisibili; in caso di dubbio, controllare i segnali verdi con un filtro FITC specifico. Figura 30: Rappresentazione fotografica di FISH con gene HER2 non amplificato (A-B-C) e con amplificazione del gene HER2 (D) 66

67 4.4.3 SCORING. - Vengono contati 20 nuclei per campione di tessuto, se possibile da aree di tumore distinte (65); - Viene calcolato il rapporto HER2/CEN-17 dividendo il numero totale di segnali HER2 rossi per il numero totale di segnali CEN-17 verdi. I campioni con un rapporto HER2/CEN-17 superiore o pari a 2 devono essere considerati amplificati per il gene HER2 (66); - I risultati vicini o coincidenti al valore di cut-off (1,8-2,2) devono essere interpretati con cautela, se il rapporto è ad un valore limite eseguire il conteggio di altri 20 nuclei e calcolare nuovamente il rapporto per i 40 nuclei; - In caso di dubbio, il vetrino del campione deve essere sottoposto ad una nuova lettura LIMITAZIONI DELLA METODICA. La FISH è una tecnica diagnostica multistadio che richiede la selezione dei reagenti appropriati, la fissazione e la processazione dei tessuti, la preparazione del vetrino per FISH e l interpretazione dei risultati per la colorazione. La scorretta esecuzione della fissazione, del lavaggio, dell essiccazione, del riscaldamento, del taglio, oppure la contaminazione con altri tessuti o fluidi, possono alterare l ibridazione della sonda. Risultati anomali possono essere dovuti ad errori nei metodi di fissazione e di inclusione, o ad irregolarità intrinseche del tessuto. Per risultati ottimali e riproducibili, i vetrini dei tessuti devono essere de paraffinati completamente; la rimozione della paraffina deve essere completa all inizio dell intero processo di colorazione. 67

68 4.5 MATERIALI UTILIZZATI PER HERCEPT TEST (DAKO CYTOMATION). l Hercept Test è un test immunoenzimatico manuale per la determinazione della presenza della proteina HER-2 sulla membrana cellulare delle cellule neoplastiche. Il test deve essere effettuato contemporaneamente sui preparati da analizzare e su un vetrino di controllo contenente 3 spot formati da linee cellulari con diversa espressione della proteina in esame: Control Cell Line SK-BR-3 con score 3+; Control cell Line MDA-175 con score 1+; Control Cell Line MDA-231 con score STRUMENTI Microtomo Leica RM2145; Stendifettine contenente acqua corrente a 37 C; Bagno termostatico a 98 C METODICA - Eliminazione della paraffina dai preparati in soluzioni sequenziali contenenti decrescente concentrazione alcolica: analogo dello xilolo (BioClear), alcool 99, alcool 95, alcool 70, acqua distillata, tampone tris salino; - Pretrattamento per lo smascheramento dei siti antigenici in bagnetto termostatato per 40 nel tampone di smascheramento (EPITOPE RETRIEVAL SOLUTION) diluito 1:10 seguito da raffreddamento a temperatura ambiente nel tampone stesso; 68

69 - Lavaggio dei preparati nel buffer di lavaggio (WASH BUFFER TBST 0.05 mol/l) diluito 1:10; - Applicazione di circa 100 microlitri di reagente per il blocco delle perossidasi endogene sui preparati per 5 minuti; - Lavaggio in buffer; - Applicazione di circa 100 microlitri di Anticorpo Primario (Rabbit Anti- Human HER2 Protein) sui preparati per 30 minuti; - Lavaggio in buffer; - Applicazione di circa 100 microlitri di Anticorpo Secondario (VISUALIZATION REAGENT) sui preparati per 30 minuti; - Lavaggio in buffer; - Applicazione di circa 100 microlitri di Diamminobenzidina (DAB) ottenuta miscelando 20 microlitri (circa 1 goccia) di DAB pura in 1 millilitro di DAB buffer; - Lavaggio in acqua distillata; - Controcolorazione dei preparati in ematossilina; - Lettura dei preparati. 69

70 4.6 MATERIALI UTILIZZATI PER LA DETERMINAZIONE DEI FATTORI PROGNOSTICI STRUMENTI. Microtomo Leica RM2145; Stendifettine contenente acqua corrente a 37 C; Bagno termostatico a 98 C; Lab Vision Corporation (Bio Optica) REAGENTI NECESSARI. - Scala dell eliminazione della paraffina: K-clear plus (analogo dello xilolo), alcool 99, alcool 95, alcool 70, acqua distillata; - Tampone PBS (tampone tris salino) 1:10 in acqua distillata (Bio Optica); - Sapone Tween 20; - Tampone di pretrattamento EDTA ph8 (Bio Optica); - H 2 O 2 3% per bloccare le per ossidasi endogene; - Ultra V Block per bloccare i siti non immuni(bio Optica) ; - Anticorpo primario; - Sistema di rivelazione: antisiero biotinilato Goat anti-polyvalent, soluzione streptavidina perossidasi (Bio Optica) ; - Cromogeno 3,3 diamminobenzidina (DAB): DAB soluzione concentrata e substrato DAB (Bio Optica); - Scala per la controcolorazione in ematossilina.. 70

71 4.6.3 ANTICORPI PRIMARI. Anti Ki 67 (Clone MB67 same as MM1) Mouse Monoclonal Antibody IgG (DBS) Localizzazione nucleare Diluizione 1:75 in buffer per anticorpi primari Pretrattamento in tampone EDTA (ph 8) per 60 minuti a 98 C (67) Anti ER (Clone SP1) Rabbit Monoclonal Antibody IgG (NeoMarkers) Localizzazione nucleare Diluizione 1:40 in buffer per anticorpi primari Pretrattamento in tampone EDTA (ph 8) per 60 minuti a 98 C (68) Anti PR (Clone PgR636) Mouse Monoclonal Antibody IgG (NeoMarkers) Localizzazione nucleare Diluizione 1:40 in buffer per anticorpi primari Pretrattamento in tampone EDTA (ph 8) per 60 minuti a 98 C (69) METODICA. - Tagliare la fettina di tessuto in paraffina al microtomo di spessore non superiore a 3 nanometri; - Adagiare la fettina nell acqua a 37 C all interno dello stendifettine; - Fare aderire la fettina al vetrino SUPERFROST PLUS carico positivamente; - Mettere il vetrino in stufa a 60 C per 30 minuti fino alla completa asciugatura e ad un parziale scioglimento della paraffina; - Eliminare la paraffina o reidratare il preparato attraverso passaggi in: xilolo alcool 99 alcool 95 alcool 70 acqua distillata; - Mantenere il vetrino in tampone PBS (tampone tris salino) diluito 1:10 in acqua distillata; - Porre il vetrino in tampone di pretrattamento EDTA ph 8 precedentemente riscaldato a 98 C in bagno termostatico per 60 minuti. 71

72 Parte automatizzata Lab Vision (Bio Optica): - Lavare i vetrini con PBS tensioattivato con sapone Tween 20; - incubare con H 2 O 2 per 5 minuti; - Lavare i vetrini con PBS; - Incubare con Ultra V-block per 5 minuti; - Scolare i vetrini; - Incubare con anticorpo primario per 40 minuti a T ambiente; - Lavare i vetrini con PBS; - Incubare con anticorpo secondario (Enhancer) per 15 minuti; - Lavare vetrini con PBS; - Incubare con anticorpo terziario streptavidina perossidasi (Polimero) per 15 minuti; - Lavare i vetrini con PBS; - Incubare con cromogeno DAB per 10 minuti; - Risciacquare i vetrini con acqua distillata; - Controcolorare in ematossilina; - Effettuare la lettura dei preparati. 72

73 4.7 MATERIALI UTILIZZATI PER LA FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION (FISH) Vysis PathVysion HER2 DNA Probe STRUMENTI. Microtomo Leica RM2145; Stendifettine contenente acqua corrente a 37 C; Bagno termostatico; Incubatore; Strumento di ibridazione Hybrite; Microscopio a fluorescenza Piattaforma di digitalizzazione delle immagini: REAGENTI NECESSARI. - Soluzione di HCl 0.2 M - Soluzione di NaSCN 1M - SSC (3M di sodium chloride, 0.3M Trisodium citrate) - SSC con 0.3% di detergente NP-40 - Acqua distillata e demonizzata - Pepsina - Soluzione neutrale di formalina - Soluzione al 70% di formamide e di SSC al 30% - Etanolo assoluto - Sonde: LSI HER2/neu, CEP17 - DAPI (4-6 diaminidino-2-phenylindole) 73

74 4.7.3 METODICA. - Tagliare sezioni di tessuto fissato in formalina, paraffinato - Utilizzare un microtomo che consente di orientare le sezioni (4-6 micron) in maniera uniforme sul vetrino. - Rimuovere la paraffina e permeabilizzare l intera sezione di tessuto evitare l'incompleta rimozione dei residui di paraffina che causano un aumento di colorazione non specifica. - Identificare l'appropriata area della cellula tumorale sul vetrino - Porre i vetrini in una incubatore a 60 C per 2 ore. - Caricare i vetrini in un rastrello e rimuovere la paraffina dalla sezione di tessuto immergendolo in una serie di tre contenitori con xilolo per 5 minuti e poi attraverso tre cambi di alcol assoluto. - Asciugare i vetrini per 3 minuti a 45 C. - Immergere i vetrini in 50ml di HCl 0.2N a temperatura ambiente per 20 minuti. - Lavare poi i vetrini immergendoli in 50ml di acqua distillata per 1 minuto poi immergere i vetrini tre volte in SSC per 3 minuti. - Immergere i vetrini in NaSCN 1M per 30 minuti a temperatura 81 C - Lasciare i vetrini in acqua distillata per 1 minuto e successivamente immergerli per 3 volte in SSC per 3 minuti. - Immergere i vetrini nella soluzione di pepsina a 37 C in un tempo compreso tra i 3-10 minuti, verificare sempre il ph dell enzima che deve essere 2. In alternativa portarlo la pepsina a ph 2 con HCl 1 N o NaOH 1N - Immergere i vetrini in 50ml di acqua distillata per 1 minuto e successivamente per 3 volte in SSC per 3 minuti. - Asciugare i vetrini a 45 C per 3 minuti. - Effettuare la seconda fissazione: immergere i vetrini in soluzione di formalina neutrale al 10% per 10 minuti a temperatura ambiente. - Lavare i vetrini per 3 minuti attraverso due cambi di SSC - Asciugare i vetrini a 45 C per 3 minuti; denaturare il DNA delle cellule immergendo il vetrino in soluzione 70% formamide 30% SSC 74

75 a 81 C per 5 minuti; immediatamente immergere i vetrini in alcol 70, 85% in successione, e alcol assoluto per 1 minuto ciascuno. Asciugare i vetrini a 45% per non più di 2 minuti. - Oscurare la luce nella stanza. - Usando un micropipettatore estrarre 10 microlitri della soluzione contenente la sonda. - Coprire il campione di tessuto con un coverslip e sigillare le estremità temporaneamente con una line di rubber cement. - Mettere i vetrini in una stanza chiusa, umidificata a 37 C per 18h. - Portare a 71 C una soluzione contenete 50 ml di SSC con 0.3% di detergente. - Abbassare la luce. - Togliere i vetrini dall'incubatore, togliere con le pinzette la rubber cement e bagnare i vetrini per alcuni minuti con SSC 0.3% NP a temperatura ambiente. - Mettere i vetrini in una soluzione di SSC/0.3% NP per 2 minuti a 72 C. - Rimuovere i vetrini e immergerli in SSC a temperatura ambiente e fare asciugare all'aria. - Coprire la fetta con 10 microlitri di DAPI. - Porre i vetrini a 20 C. - Analizzare il vetrino con il microscopio a fluorescenza CONTROLLO DI QUALITA'. Le cellule normali rappresentano un controllo di interno di qualità. Le cellule normali devono presentare 1-2 segnali verdi chiaramente visibili indicanti che la sonda per il CEN17 è stata ibridata con successo alla regione centromerica del cromosoma 17. Le cellule normali devono presentare inoltre 1-2 segnali rossi chiaramente visibili indicanti che la sonda di DNA per HER2 è stata ibridata con successo al sito di amplificazione di HER2. 75

76 La mancata rilevazione dei segnali nelle cellule normali indica che il saggio non è valido e i risultati devono essere considerati non validi. 76

77 4.8 MATERIALI UTILIZZATI PER LA SILVER ENHANCED IN SITU HYBRIDIZATION INFORM HER2 DNA Probe (VENTANA MEDICAL SYSTEM) STRUMENTI E REAGENTI NECESSARI. - Coloratore automatico di vetrini BENCHMARK XT - EZ Prep Ventana: soluzione sparaffinatrice a base acquosa (10X) - SSC Ventana: soluzione di stringenza (5X) - Reaction Buffer Ventana (10X): buffer di reazione - Cell Conditioning 2 Ventana: soluzione per lo smascheramento antigenico a ph 6 - INFORM HER2 DNA Probe Ventana - INFORM Chromosome 17 Probe Ventana - ultraview SISH Detection kit Ventana - Rabbit anti-dnp Antibody Ventana - ultraview Silver Wash Ventana - ISH Proteasi 3 Ventana - Hematoxylin II Counterstain Ventana - Bluing Reagent Ventana - Scala di disidratazione alcool 80 alcool 95 alcool 99 xilolo - Montante permanente METODICA AUTOMATICA (BENCHMARK XT). Gene HER2: ep3-8 - Eliminazione della paraffina; - Permeabilizzazione cellulare con trattamento esteso a ph6; - Incubazione con proteasi per 8 minuti; - Probe HER2 DNA; - Controcolorazione con HEMATOXYLIN II; 77

78 - Post Controcolorazione con BLUING REAGENt Centromero CEN-17: ep Eliminazione paraffina; - Permeabilizzazione cellulare con trattamento esteso a ph6; - Incubazione con proteasi per 12 minuti; - Probe Chr 17; - Controcolorazione conhematoxylin II; - Post Controcolorazione con BLUING REAGENT L automatizzazione è conseguente al taglio manuale delle sezioni istologiche, fissate in formalina ed incluse in paraffina, a 4 micron. Alla fine della procedura i vetrini con i preparati devono essere disidratati e montati per la lettura al microscopio ottico. 78

79 5. RISULTATI E CONCLUSIONI. 5.1 RISULTATI. Il gene umano HER2 (noto anche come ErbB2 o neu) è localizzato sul cromosoma 17 e codifica per una proteina indicata come HER2 o p185; tale proteina è un recettore transmembrana ad attività tirosin chinasica omologo al recettore del fattore di crescita epidermico (EGF-R) (70). Un sottogruppo di pazienti con carcinoma mammario (15%-25%) presenta un amplificazione del gene HER2 come parte del processo di trasformazione maligna e di avanzamento del tumore. (71) L amplificazione del gene HER2 porta generalmente all iperespressione della proteina HER2 sulla superficie delle cellule tumorali, la quale è stata dimostrata nel 25-30% dei carcinomi mammari. La up regulation è associata a prognosi infausta, aumentato rischio di ricorrenza e ad una diminuzione della sopravvivenza. I pazienti con iperespressione di HER2 rispondono favorevolmente al trattamento con Trastuzumab, un anticorpo monoclonale rivolto verso HER2. Usualmente la selezione dei pazienti da trattare con Trastuzumab viene effettuata mediante l indagine immunoistochimica Hercept Test, che valuta la presenza in membrana della proteina. (score Hercept Test 0, 1+, 2+, 3+). (72-73). Le linee guida attuali prevedono che i pazienti con score 3+ all Hercept Test vengano direttamente considerati idonei alla terapia, mentre i pazienti con score 0 o 1+ vengono considerati non idonei. Solo in caso di nelle neoplasie con espressione media (2+ all Hercept Test) della proteina HER2 sulla membrana della cellule tumorali viene utilizzata la metodica FISH per valutare lo stato del gene HER2. In questo caso vengono trattati con Trastuzumab solo i soggetti che presentano amplificazione dl gene. Nel nostro studio sono state confrontate la metodica FISH (Vysis PathVysion HER2 DNA Probe) e la nuova metodica SISH (INFORM HER2 DNA Probe VENTANA MEDICAL SYSTEM). 79

80 Le due metodiche hanno dato risultato corrispondente in 51 casi su 53 cioè nel 96,2% dei casi. In 2 casi le tecniche hanno mostrato risultati diversi. Infatti risultano positivi all amplificazione genica del gene HER2 9/53 casi con entrambe le tecniche; le metodiche non concordano però nel risultato di 2 dei 9 casi: in un caso la FISH è positiva (score >2.5) mentre la SISH è negativa (score 1.1), nel secondo caso la FISH è negativa (score 1.6) mentre la SISH è positiva (score >3). La valutazione è stata fatta per entrambe le metodiche esaminando esclusivamente le cellule della neoplasia con carattere infiltrativi. Per ogni caso sono stati contati come minimo due campi microscopici diversi per un totale minimo di 40 cellule. Nei casi dubbi (score 1.8<X<2.2) sono stati contati ulteriori campi e successivamente è stata fatta la media degli score HER2/CEN17 dei diversi campi. La conta è stata effettuata per entrambe le metodiche in doppio cieco, cioè da due diversi operatori (medici anatomo-patologi), i quali hanno valutato singolarmente i casi senza conoscere i corrispondenti dati di scoring del collega Nella metodica SISH è stato valutato lo scoring attraverso il metodo quantitativo. 80

81 Caso positivo: Donna di anni 69 Score FISH: >2.5- Score SISH: 2.4 KI67(Mib-1): 60%; ER: 70%; PR: 30% Figura 31: istologia ed immunoistochimica sul recettore estrogenico Figura 32: Hercept Test e FISH 81

82 Figura 33: gene HER2 e CEN17 (metodica SISH) Caso positivo: donna di anni 63 Score FISH: >2.5- Score SISH: >2.5 Ki67 (Mib-1): 50%; ER: 70%; PR: 30% Figura 34: Hercept Test ed immunoistochimica sul recettore estrogenico 82

83 Figura 35: SISH e FISH del gene HER2 Caso positivo: donna di anni 66 Score FISH: >3- Score SISH: >2.5 Ki67 (Mib-1): 15%; ER: 90%; PR: 90% Figura 36: istologia ed immunoistochimica sul Ki67 (Mib-1) 83

84 Figura 37: SISH e FISH del gene HER2 Caso positivo: donna di anni 69 Score FISH: >3- Score SISH: 2.5 Ki67 (Mib-1): 10%; ER: 60%; PR: 70% Figura 38: Hercept Test e SISH del gene HER2 84

85 Caso positivo: donna di anni 74 Score FISH: >8- Score SISH: >8 Ki67 (Mib-1): 50%; ER: 90%; PR: 90% Figura 39: FISH e SISH sul gene HER2 Figura 40: Hercept Test ed immunoistochimica sul recettore estrogenico 85

86 Caso positivo: donna di anni 77 Score FISH: >3- Score SISH: >3.3 Ki67 (Mib-1): 20%; ER: 50%; PR: 70% Figura 41: istologia ed immunoistochimica sul recettore estrogenico Figura 42: FISH e SISH sul gene HER2 86

87 Caso positivo per SISH e negativo per FISH: donna di anni 66 Score FISH: 1.6- Score SISH: >3.3 Ki67 (Mib-1): 10%; ER: 40%; PR: 80% Figura 43: istologia ed Hercept Test Figura 44: SISH positiva e FISH negativa sul gene HER2 87

88 Caso positivo per FISH e negativo per SISH: donna di anni 77 Score FISH: >2.5- Score SISH: 1.1 Ki67 (Mib-1): 20%; ER: 80%; PR: 80% Figura 45: SISH negativa e FISH positiva sul gene HER2 Caso negativo: donna di anni 42 Score SISH: 1.1 Ki67 (Mib-1): >20%; ER: -; PR: - Figura 46: HER2 (foto a sinistra), CEN 17 (foto a destra) Caso negativo per amplificazione genica tramite SISH 88

89 Grafico 1: Correlazione tra gli score tra la FISH e la SISH nei 53 casi studiati. I dati forniti da questo studio hanno dimostrato che le due metodiche prese in esame, la FISH e la SISH sono concordanti nel 96,2% dei casi, soddisfacendo i criteri dell ASCO/CAP (American Society of Clinical Oncology and the College of American Pathologist) che richiedono un livello minimo di concordanza del 95% ed in accordo con i dati di letteratura che indicano il valore di concordanza al 96% (74). 89

90 Grafico 2: distribuzione della frequenza del valore del ratio HER2/CEN 17 con metodica FISH (59) ,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,6 2,8 3,3 4 8 FISH SISH Grafico 3: distribuzione della frequenza del valore del ratio HER2/CEN 17 con metodica FISH e metodica SISH nei 53 casi del nostro studio 90

91 Nella seconda parte del nostro lavoro abbiamo valutato attraverso metodica automatizzata SISH trenta casi aventi debole positività all Hercept Test (Dako Cytomation) con score 1+ Dopo avere valutato l accuratezza della metodica in paragone con la FISH, si è deciso di studiare se esistessero casi con amplificazione del gene HER2 caratterizzati da score 1+ all Hercept Test con reattività di membrana rilevabile in più del 10% delle cellule neoplastiche ma incompleta (presente solo in parti di membrana cellulare) e debole. Ventinove dei 30 casi 1+ all Hercept Test analizzati sono risultati negativi per amplificazione del gene HER2, un caso è risultato polisomico cioè contenente più di due cromosomi 17 (o di centromeri del cromosoma 17) all interno del nucleo. Questo caso è stato successivamente testato attraverso metodica manuale FISH. Tramite metodica SISH, che prevede la lettura sequenziale prima del vetrino contenente gli spot marcanti il gene HER2 e poi del vetrino contenente gli spot marcanti il CEN17, la polisomia può essere inizialmente erroneamente interpretata come amplificazione genica; dopo aver effettuato la conta dei segnali HER2 e CEN17 ed aver calcolato lo scoring HER2/CEN17 (nel nostro caso si è ottenuto un rapporto inferiore ad 1.8) la polisomia diviene evidente (62). Tramite metodica FISH, la visualizzazione di un grande numero di spot verdi (sonda CEN17) all interno del nucleo delle cellule tumorali, che rappresentano i cromosomi 17, è immediatamente visualizzabile. 91

92 Caso polisomico: donna di anni 66 Score FISH: 1.1- Score SISH: 1.3 Ki67 (Mib-1): 30%; ER: -; PR: - Figura 47: polisomia del cromosoma 17 in SISH ed in FISH 92