Classe 4: liasi. Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry

Transcript

1 lasse 4: liasi 1) AH2+B A+BH2 ossidoreduttasi (trasf. Di H+e-) 2) A+B AB+ tranferasi (trasf. Di gruppi) 3) AB+H2 A+B idrolasi (legami:scissione rev idrolitica) LIAI(enzimi di 4 classe) 4) AB A+B La reazione liasica consiste nella formazione e scissione di un legame in modo che la molecola del substrato si risolve in due componenti. Reaz. reversibili :l eq è dato dall attività dei componenti e quindi dall utilizzo dei componenti verso vie metaboliche particolari. Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 1

2 4. LIAI: coenzimi olo alcune liasi sono proteine coniugate con coenzimi di derivazione vitaminica el dettaglio vedremo le caratteristiche di reazione di liasi specifiche che contengono come coenzima: TPP (derivato dalla VITAMIA B1): --- liasi specifiche che agiscono sugli α chetoacidi promuovendo la decarbossilazione PALP (derivato dalla VITAMIA B6 ): liasi specifiche che agiscono sugli aminoacidi Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 2

3 ottoclasse: tipo di legame interessato (che viene scisso o formato). --- ARBI-ARBI LIAI --- ARBI-AZT LIAI --- ARBI-ZLF LIAI --- ARBI IGE LIAI TTTTLAE: riguarda la categoria di substrati interessati dal meccanismo liasico. elle liasi alcuni E hanno oe e richiedono la presenza di cofattori, altri sono solo Me proteine (Me di transizione), altri ancora non hanno gruppo prostetico ma una concentrazione di R aa nel sito attivo che ne fa un centro di catalisi. Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 3

4 LIAI -- vit B1 (TPP) dipendenti H 3 H 2 H 3 l - H - P P H TPP H H Transizioni del coenzima durante la catalisi H 3 H 3 Le -- liasi hanno la vit.b1 (tiaminopirofosfato trasf.) come gruppo prostetico. Anche qui la catalisi è centrata sull equilibrio dell anello tiazolico tra 1 forma in cui 2 è sede di struttura carbanionica o una in cui 2 si impegna con doppio legame verso il substrato. Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 4

5 Effetto catalitico liasi TPP Hanno effetto decarbossilante UBTRATI: α chetoacidi Decarbossilazioni 1) Riduttive H H + 2 L α-chetoacido aldeide. Il carbanionico è modificabile. Il carbonilico passa da n +2 a +1. 2) ssidative H H 3 + oah H 3 H 3 H 3 oa + 2 Il carbonilico passa da n +2 a +3 (ac. Piruvico ac acetico). L acido non è libero ma veicolato dal suo vettore oa (trasferasi). AcetiloA Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 5

6 Dettagli meccanismo catalitico H δ + H 3 H H H 3 H 3 H 3 H H 3 + H H 3 H H H 3 Prof. G. Gilardi - Biological hemistry H 3 Il sito attivo delle liasi acetta la posizione 1-2 degli α-chetoacidi. I legami = del carbossile sono polarizzati e la δ+ sul facilita L ATTIVITà DEL ARBAIE I FRMA IL LAGAME VALETE IL PRIM MPT oe-ubtrat TABILE. - effetto catalitico: (lattimica lattamica) Me cofattori :trasportano e- tra parte piridinica e tiazolica. 6

7 Meccanismo catalitico Gli elettroni che partecipano al nuovo legame sono quelli del legame α-1 che si scinde. Il 1 è struttura carbocationica neutralizzata dall H. -la 2 si libera sempre sottoforma di bicarbonato. Il riequilibrio del nucleo piridinico verso la forma aromatoide fa si che si trasportano e- in senso inverso si forma un aldeide attiva in forma carbanionica. H H - H 3 H 3 H Decarbossilazione riduttiva H + H - H 3 H 3 H Aldeide idrata H H H H H 3 H - H 3 H H 3 - H 3 Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 7

8 Decarbossilazioni riduttive Queste α-chetoacidodecarbossilasi sono presenti in tutte la cellule ma maggiormente nelle cellule procariote anaerobie; l α- chetoacido più abbondante è l acido piruvico. Queste -- liasi che danno decarbossilazioni riduttive sono distribuite generalmente nelle frazioni che nei peptidi sono definite ialoplasmatiche o del citoplasma solubile cioè la parte che non sedimenta anche a x g. Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 8

9 Decarbossilazioni ossidative Le decarbossilazioni ossidative interessano le membrane cellulari: nelle procariotiche sulla membrana plasmatica nelle eucariotiche sono nelle membrane interne del mitocondrio. Troviamo tre tipi di unità enzimatica che si organizzano strutt 4 e poi sopramolecolari Est. 1. LIAI 2. TRAFERAI 3. IDREDUTTAI Int. Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 9

10 Descrizione unità 1,2,3 1 tipo, unità decarbossilanti: : LIAI stessa organizzazione delle proteine della decarbossilazione riduttiva (TPP DIPEDETI) ma hanno ampi domini idrofobici agiscono solo associati a materiale fosfolipidico (solo se inserite su membrana). on sono transmembrana ma sporgono suilla faccia esterna della membrana interna mitocondriale. 2 tipo: TRAFERAI: sono transmembrana, sono soggetti a cambiamenti di conformazione e delimitano una sorta di ampio canale che li attraversa (carrier ma si compongono come enzimi di classe 2 transferasi). Hanno due coenzimi : uno legato in modo covalente (acido lipoico) e uno attraverso legami salini reversibili : oenzima A 3 tipo: IDRIDUTTAI: enzimi di classe uno ossidoriduttasi con coenzima FAD (flavoproteina) minore distrubuzione di amino acidi idrofobici. porgono nella faccia interna della membrana interna mitocondriale. Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 10

11 rganizzazione sistemi decarbossilanti I sistemi decarbossilanti non esistono solo in forma protomerica ma danno una struttura quaternaria che arriva a circa 50 protomeri con organizzazione cristallina. Dentro questa sono organizzate le subunità transferasiche che sono in numero minore, attraverso la membrana ed hanno contatti tra loro (effetti di cooperazione), il loro numero va da 3\4 a 1\2 di quelle liasiche. ella grossa distribuzione superficiali dell unità liasiche vediamo sporgere le unità transferasiche che dentro il plasmalemma interagiscono con contatti idrofobici. ull altra faccia della membrana vicino alle subunità di tipo 2 che protrudono all interno si hanno le subunità ossidoriduttasiche che sono 1\2 o 1\4 di quelle liasiche (in distribuzione geometrica definita). Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 11

12 truttura sovramolecolare Liasi : catturano e scindono gli alfa chetoacidi Transferasi : trasportano l acile ssidoriduttasi : sistema che riporta la seconda subunità alle condizioini originarie. Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 12

13 1 passaggio H δ + H H H H H 3 H 3 H 3 piruvato H + H H 3 attacco nucleofilo delle subunità liasiche/decarbossilazione Piruvato deidrogenasi (organizzazione sovramolecolare) Alfa cheto glutarato deidrogenasi (ciclo di Krebbs) Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 13

14 2 passaggio (i) H H - H 3 H H H 3 H Lys- Enz H Lys- Enzi H Formazione di aldeide carbanionica per riequilibrio delle forme di risonanza: si realizza una prima reazione transferasica per attacco nucleofilo dal carbanione sul ponte disolfuro del oe: AID LIPI, acido carbossilico a 8 con una ciclizzazione per formazione di un ponte disolfuro. Il ponte disolfuro viene scisso e si realizza un legame covalente tra lo zolfo e quella che era la struttura aldeidica con numero ossidazione +1, questa reazione redox fa transire il che ha dato il legame da +1 a +2 : ritorno alle condizioni che esistono nel chetone Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 14

15 2 passaggio (ii) Mn H H H 3 H H H H Lys- Enz + H 3 - H H Lys- Enz Il cambiamento di conformazione che segue orienta un R amino acidico del sito attivo dalla transferasi (nucleo imidazolico di istidina) verso il primo tipo di subunità. Il Mn prostetico della subunità 1 (decarbossilante) riconosce l H e destabilizza il legame -- adiacente (scissione eterolitica) i ottiene il doppio legame = con la dissociazione di un protone. Il numero di ox. è passato da +2 a +3 (carbossile mascherato nella struttura tioesterea). Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 15

16 2 passaggio (iii) H 3 H Lys- Enz H oah Abbiamo avuto la decarbossilazione ossidativa e l unità a 2 abbandona l unità di primo tipo per trasferirsi sulla subunità transferasica. La subunità transferasica ora contiene acil-lipoato. Acil lipoato : nella subunità secondaria si realizza un cambiamento di conformazione La struttura con l acil lipoato cambia nel canale l orientamento spaziale (passa ad uno orientamento verso l interno) la Kd dell enzima per il oa diviene molto bassa : l enzima è in grado di catturare il oa libero nell ambiente interno. Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 16

17 2 passaggio (iv) Mn H H + H 3 H H Lys- Enz H Lys- Enz oa H 3 oah ella porzione più interna la subunità 2 porta l atomo di manganese che fa da destabilizzante per il legame -. L effetto è lo scatenarsi del meccanismo transferasico, in pratica sotto l effetto del metallo di transizione l acile si sposta dal solfidrile che occupa nell acido lipoico al solfidrile del oa che in questo momento si trova molto vicino nello spazio si forma acil oa. Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 17

18 2 passaggio (v) H H Lys- Enz H oa H 3 La partecipazione del metallo a questo meccanismo di trasferimento fa si che l enzima subisca una modifica : aumenta di un fattore 10 4 a 10 6 la Kd della dissociazione apoproteina-oa. L acetil oa dissocia sul lato interno della membrana (per cui nella membrana interna del mitocondrio) arriva sulla faccia esterna il piruvato ed esce sulla faccia interna del mitocondrio il oa. La seconda proteina non si è comportata solo come transferasi ma anche come carrier portando un unità bicarboniosa dall esterno verso l interno. Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 18

19 3 passaggio FM H Lys- Enz FMH 2 Acido lipoico sempre orientato verso la faccia interna, a questo punto intervengono gli enzimi del terzo gruppo ossidoriduttasi FAD dipendenti. FM FMH 2 i coenzimi flavinici si trovano vicini all acido lipoico lo riossidano rigenerando il ponte disolfuro. La riossidazione scatena l ultima trasformazione : fa orientare ancora il braccio con coenzima verso la subunità liasica (verso la faccia esterna della membrana interna). ella membrana interna dei mitocondri ci sono ossidoriduttasi AD dipendenti ( non associate a particolari strutture) che riossidano le tre subunità e le unità riducenti vengono trasferite sul coenzima piridinico questo tipo di decarbossilazione ossidativa si conclude con acil oa e unità riducenti con coenzima piridinici ridotti. Anche AD proteine rimettono nella condizione di partenza i coenzimi flavinici della terza struttura che possono quindi ripetere il ciclo Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 19

20 LIAI PALP Le liasi con coenzima PALP intervengono nel metabolismo degli aminoacidi. 1 a reazione: aggancio del substrato al coenzima e formazione del legame di base di chiff H Eliminazione virtuale di acqua H P H H 2 H 2 Me H 2 H R H P H 2 H H Me H H H R H 2 -enzima H Base di chiff H H 2 -enzima H P H 2 H H Me H R H + H 2 -enzima Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 20

21 Liasi PALP 2) transizione alla forma chinoide La catalisi è guidata dal metallo: la simmetria dei legami con i R del sito attivo promuove interazioni con il α (nelle transferasi PALP era il sostituente in 4) H H H P H 2 H H Me R H P H 2 H H Me H R - H H 2 -enzima H 2 -enzima Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 21

22 cissione 1-α: aminoacido decarbossilasi (--- liasi) La simmetria dei legami del Me può dare inoltre legami con altre parti del substrato. e la terza interazione del metallo si stabilisce con l legato al 1 si ha scissione 1-α con decarbossilazione dell aminoacido. H P H 2 H H Me H 2 -enzima + H H R - H H 2 H 2 H 2 H serina colamina + 2 H H H 2 H 2 ornitina putrescina + 2 H 2 H 2 H H 2 H 2 H 2 Prof. G. Gilardi - Biological hemistry lisina cadaverina

23 Interazione con il sostituente in β i verifica per quegli aa che hanno in β un sostituente importante: es. cisteina e serina H P H 2 H H Me H - H R β H 2 -enzima H H H H 2 serina H H 2 H 3 H 3 H H H H 2 H Acido aminoacrilico α-imminoacido Acido piruvico H 2 cisteina Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 23

24 Trasformazione serina a glicina + -H 2 H H H P H 2 H Me - H R β H H H H 2 H + -H 2 H H 2 -enzima H 2 er Gly Le interazioni con il Me sono dirette una verso l e due verso il α. Il risultato è la scissione tra α e β e la produzione di unità monocarboniosa che viene accettata da FH 4 sotto forma di metilene H 2 - Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 24

25 Liasi metallo-dipendenti H. H 2. H Fe-Enzima H. + H 2. H-Fe-Enzima H. H. H. H 2. H 2 u-enzima H. + H 2. H 2 -u-enzima H. H. Il metallo (es. il Fe) riconosce l dell H sostituente. Il u riconosce l del gruppo H 2. Il passaggio da legame dativo a covalente provoca una sottrazione del sostituente mentre nel substrato precedente resta una carica +, ossia una struttura carbocationica. Gli H o H 2 sono rilasciati dall enzima come prodotto di reazione. La struttura si riassesta creando un doppio legame e dissociando un protone. i forma una insaturazione. La reazione è reversibile e quindi può essere addizionato H, H, H 2 su posizioni insature che li accettano come sostituenti. H + H + Prof. G. Gilardi - Biological hemistry 25