Introduzione alla Genomica

Transcript

1 Laboratorio di Bioinformatica I Introduzione alla Genomica Dott. Sergio Marin Vargas (2014 / 2015)

2 Il Genoma umano Gene codificanti proteine Gene non codificanti proteine

3 Geni codificanti proteine 3

4 Il modello genico Il modello genico di un gene codificante proteine è composto da: gene: la regione completa del gene (a volte mrna) exon: regione che viene mantenuta dopo la maturazione. intron: regione che viene eliminata durante la maturazione. transcript: RNA maturo, composto da esoni o parte di esoni (spezzato). mrna: RNA maturo, composto da esoni o parte di esoni (spezzato). CDS: regione codificante dell mrna (esoni o parte di esoni spezzati). UTR: regione non tradotta dell mrna (esoni o parte di esoni spezzati).

5 Formato di annotazione GFF3 GFF3 è molto simile ad un altro formato GTF!!!

6 Il genoma di riferimento Il primo genoma è stato completato dal Human Genome Project nel 2003, il quale era composto da una mescolanza di 6 individui della città di Buffalo (USA) a un costo di 3 miliardi di dolari e 15 anni di lavoro. Attualmente siamo alla versione GRCh38.p3 del Genome Reference Consortium, il quale è equivalente alla versione hg38 del UCSC Human Genome (ENCODE PROJECT). Per questo progetto si è lavorato su del DNA offerto da un certo numero di donatori selezionati con criteri di rappresentatività statistica. Il genoma di riferimento è aploide (più del 99,9% del genoma è omozigote), anche se si sta lavorando per avere un genoma diploide. La versione del genoma di riferimento precedente GRCh37.p13 (hg19) è ancora molto utilizzata.

7 Ensembl (Genome Browser)

8 Ensembl (Dettaglio)

9 Ensembl (Zoom) Configurazione Tracce

10 Esercizio 1: Ensembl La proteina tumorale 53 o p53 (Gene TP53) è considerata come "il guardiano del genoma" riferendosi al suo ruolo di prevenzione delle mutazioni. Cercare mediante Ensembl, il gene della P53 nell uomo. Qual é il codice Ensembl di questo gene? Quanti trascritti sono riportati per questo geni? Tutti codificano la proteina? Qual é il codice Emsembl del trascritto con lunghezza nucleotidica maggiore? Qualè il codice CCDS di questo trascritto? Cosa è il CCDS? Qualè sono i codici Refseq? Qual é la localizzazione (cromosoma e coordinate) di questo gene? Cliccando su Location si arriva al genome browser. Utilizzando il mouse per selezionare una regione si può arrivare a vedere il contenuto del genoma anche del singolo nucleotide. Qual é la sequenza nucleotidica del genoma di riferimento tra le posizioni e Perche i Contigs sequence vengono visti con il nucleotide complementare?

11 Esercizio 2: Ensembl Visualizzare tramite Ensembl il dettaglio del gene dell uomo nella regione 196,027, ,082,189 del cromosoma 3 del genoma di riferimento GRCh38. Qual é il codice Ensembl del gene di questa regione? A quale gene corrisponde? Per quale proteina codifica? Visualizzare tramite il genome browser di Ensembl la regione col massimo dettaglio. Tramite la configurazione lasciare solo le tracce: sequence, 1000 genomes all short variants, ruler, variation legend. Se guardate a partire della posizioni del Chr3 vedrete che ci sono due SNPs consecutivi, uno sinonimo e l altro missenso. Quale posizione corrisponde a quella missenso? Sono varianti (SNPs) omozigoti o eterozigoti? Indicare quali sono i nucleotidi nel genoma di riferimento e in quale base sono mutati?

12 UCSC Genome Browser

13 UCSC (Dettaglio)

14 Esercizio 3: UCSC Utilizzando il genome browser UCSC, cercare il gene dell uomo che codifica per l emoglobina subunità alpha 1. Qual é il genoma di riferimento di default su cui cerca in UCSC? Qual é il codice del gene? Qual é la localizzazione di questo gene? Si trova all inizio o alla fine del cromosoma? E forward o reverse strand? Di quanti esoni e quanti introni è composto? Visualizzare la traccia CCDS (full), attivarla mediante il menu Genes and Gene Predictions in basso, poi utilizzarla per vedere la sequenza proteica codificata dal gene. Alcuni aminoacidi sono evidenziati col colore verde brillante. A quale aminoacido corrispondono e qual é il codone che lo codifica? Qual é la base corrispondente al nucleotide del cromosoma rispettivo? A quale codone appartiene e per quale aminoacido codifica? Ricercare le coordinate del gene TP53, sono diverse rispetto al genoma di riferimento hg38? E sempre reverse strand?

15 Vega Genome Browser Nel dettaglio Vega è molto simile ad Ensembl!!!

16 Esercizio 4: Vega Quanti cromosomi ha il genoma della Zebrafish? Ricercare il gene TP53 per la Zebrafish. Qual è il codice Vega del gene TP53? Quale è la localizzazione del gene? Quanti trascritti sono stati visti per questo gene in Zebrafish? Cliccando Splice variants se riesce a vedere i trascritti e la loro mappatura sul gene. Di quanti esoni è composto il gene TP53 di Zebrafish? Tutti i trascritti hanno gli stessi esoni? Di quante basi è composto il primo trascritto TP53-001? Il primo esone del trascritto corrisponde a una regione codificante o a un UTR? Quale è il primo codone del primo esone di questo trascritto? In quale esone comincia la zona codificante proteina (CDS)? In quale posizione si trova l inizio del CDS? A quale codone corrisponde l inizio del CDS? Per quale aminoacido codifica questo codone?

17 NCBI Genome Information

18 Esercizio 5: NCBI Cercare informazione sul genoma dell uomo in NCBI. Di quanti cromosomi è composto il cariotipo umano? Qual é la dimensione in Mb del cromosoma più grande e a quale cromosoma corrisponde? E di quello più piccolo? Cliccando su Genome Assembly and Annotation report si vedono i diversi genomi assemblati. Qual é la dimensione complessiva del genoma secondo il progetto PRJNA168? Una proteina di membrana che fa di canale del potassio si trova nel cromosoma 21. Qual é il codice di questo gene?

19 Predizione Genica Lo scopo dei programmi di predizione genica è quello di predirre in quale posizioni di una data sequenza nucleotidica si trova i geni. Questi programmi utilizzano diversi metodi, ma principalmente fanno un training con gene conosciuti per poi cercare di identificare i geni sconosciuti. Sequenza Nucleotidica Sconosciuta Sequenza Nucleotidica con geni conosciuti

20 Principali programmi di Predizione Genica Predittore Predizione ab initio Predizione di geni eucarioti Training in locale per nuovi genomi Utilizzo di EST e Proteine per la predizione Utilizzo di RNA-Seq per la predizione Predizione degli UTR Predizione dei trascritti alternativi Augustus SI SI SI SI SI SI SI Snap SI SI SI NO NO NO NO GeneMark-ES SI SI NO NO NO NO NO GeneID SI SI SI SI SI SI SI FGenesh SI SI SI NO NO NO NO Genescan SI SI NO SI SI SI NO MZEF SI SI NO NO NO NO NO mgene.ngs SI SI SI SI SI SI NO Contrast SI SI SI SI NO SI NO GrailExp SI SI NO SI NO SI NO TwinScan/N-Scan SI SI SI SI NO NO SI

21 Augustus

22 Esercizio 6: Predizione genica con Augustus In Ensembl, ricercare il gene HBA1 dell uomo, tramite l opzione Export Data scaricare solo la sequenza nucleotidica (deselezionare tutto) e salvare la sequenza in un file. Tramite il web server di Augustus, utilizzare la sequenza appena scaricata per predire se esiste qualche gene nella sequenza. Lanciare Augustus con l opzione only predict complete genes e per l organismo uomo. Verificare se il risultato della predizione di Augustus è concorde con la traccia CCDS set del gene HBA1 in Ensembl. La proteina predetta conincide con quella vera (cercare il gene HBA1 in uniprot)?

23 Risequenziamento del genoma Next Generation Sequencing (NGS) (reads) Load into sequencer o To be reliable enough to sequence the entire genome high coverage is required. o Human Genome (~ 3 Gb) needs more than 90 Gb. o Human Exome (~ 135 Mb) needs more than 4 Gb.

24 Risultato del sequenziamento (Sequence)

25 Chiamata delle Varianti Formato VCF Genoma di riferimento (Human Genome Reference)

26 IGV Genome Browser

27 IGV Genome Browser Genoma di riferimento Cromosoma Coordinate

28 Esercizio 7: IGV Il gene CECR6 si trova rispetto al genoma di riferimento hg19 nella posizione : Chromosome 22: 17,597,189-17,602,257. E stato sequenziato un genoma di una certa persona, un pezzo del file di allineamento delle reads (BAM) e un pezzo del file delle chiamate delle varianti (VCF), così come un pezzo dell annotazione del chr22 del genoma hg19, si trova alla pagina del corso con il nome IGV.zip. Nella zona codificante (CDS) del gene CECR6 è stata trovata una variante. Tramite il genome browser IGV e utilizzando il genoma hg19 (chr22) e i files precedenti, identificare la posizione della variante e dire anche a quale base è mutata rispetto al genoma di riferimento. Dire anche se la mutazione è in omozigosi o eterozigosi? In posizione chr22: c è anche una variante in zona UTR. Questa mutazione è in omozigosi o eterozigosi?

29 Esercizio 7: IGV Varianti (file VCF) Reads Allineate (file BAM) Annotazione (File GTF o GFF3)