UNIVERSITA DEGLI STUDI DEL MOLISE CAMPOBASSO

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DEL MOLISE CAMPOBASSO Dipartimento Agricoltura Ambiente Alimenti Progetto InLatte- Trasferimento di innovazione nella filiera lattiero-casearia per la valorizzazione del caciocavallo molisano e il recupero di sottoprodotti di lavorazione ATTIVITA : Validazione di strumenti biotecnologici a difesa della biodiversità microbica del comparto lattiero-caseario molisano. Responsabili Prof.ssa Elena Sorrentino Dott. Patrizio Tremonte

2 1. INTRODUZIONE SCOPO DELL ATTIVITÀ MATERIALI E METODI CAMPIONI OGGETTO DI ANALISI ANALISI MICROBIOLOGICHE ISOLAMENTO DEI BATTERI LATTICI PRELIMINARE IDENTIFICAZIONE FENOTIPICA DEI BATTERI LATTICI ISOLATI IDENTIFICAZIONE GENOTIPICA PCR- DGGE ESTRAZIONE DEL DNA QUANTIFICAZIONE E STRANDARDIZZAZIONE DEL DNA ESTRATTO AMPLIFICAZIONE DEL DNA ANALISI DGGE SEQUENZIAMENTO VALUTAZIONE DELLA BIODIVERSITA DEGLI ISOLATI MEDIANTE RAPD- PCR CARATTERIZZAZIONE TECNOLOGICA DEI CEPPI DI BATTERI LATTICI CAPACITA ACIDIFICANTE SVILUPPO DI OFF FLAVOURS ATTIVITA PROTEOLITICA RISULTATI E DISCUSSIONE CARATTERI MICROBIOLOGICI IDENTIFICAZIONE DEGLI ISOLATI CARATTERIZZAZIONE TECNOLOGICA FORMULAZIONE DI COLTURE STARTER

3 1. INTRODUZIONE Le attività hanno inteso sviluppare, validare e collaudare approcci biotecnologici tali da permettere la salvaguardia della biodiversità microbica caratterizzante la filiera lattiero casearia molisana. Obiettivo che ben risponde ad alcune delle priorità Horizon 2020 particolarmente attente alla tutela della biodiversità. Legata all impego di siero-innesto naturale, all uso di latte crudo nonché alle operazione di processo adottate, la biodiversità microbica è stata da sempre riconosciuta come uno degli elementi principali alla base delle peculiarità qualitative dei formaggi a pasta filata della tradizione molisana. Il mantenimento di questo patrimonio biologico assicura la conservazione di ecosistemi, talvolta complessi, e di pool di geni di importanza fondamentale non solo per i processi tecnologici mediati da microrganismi (fermentazioni-maturazioni di prodotti alimentari) ma anche per la salvaguardia di processi ecologici essenziali per le generazioni future. Il ricco patrimonio microbico degli alimenti, custodito dai processi tecnologici tradizionali, a partire dagli anni 80 contestualmente all introduzione di approcci tecnologici volti alla razionalizzazione e alla massimizzazione della profittabilità dei processi produttivi, è stato esposto a differenti insidie e minacce. Emerge dunque con chiarezza che l innovazione dei prodotti tradizionali deve essere accompagnata da strategie in grado di salvaguardare tale ricchezza microbica. Condizione che non sempre è stata raggiunta attraverso le strategie innovative messe in atto da parte delle aziende. Rappresentativo di tale situazione sono le aziende del comparto lattiero caseario. Infatti, nell ultimo decennio, tra le aziende casearie, al fine di migliorare gli approcci produttivi ed innovare le produzioni, si è diffuso l impiego di colture starter microbiche selezionate. Rimedio che, da un lato, ha avuto effetti positivi sulla qualità igienica e sulla riduzione della variabilità del prodotto finito, mentre dall altro si è tradotto in un drastico impoverimento della varietà di aromi e in un appiattimento del profilo sensoriale. Risultato da ascrivere all esigua variabilità microbica delle colture starter selezionate. Infatti, le colture starter presenti in commercio, costituite da un numero ristretto di ceppi geneticamente molto vicini tra loro, sono selezionate principalmente sulla base della capacità acidificante più che sulla base della loro capacità di tutelare o esaltare i tratti di specificità delle singole produzioni casearie. In tale contesto si inserisce la presente attività con l obiettivo di sviluppare, validare e collaudare una o più colture starter tali da garantire la qualità del processo e del prodotto nonché in grado di custodire il patrimonio della biodiversità microbica legata alle paste filate molisane. 1

4 2. SCOPO DELL ATTIVITÀ Obiettivo finale dell attività è la formulazione e validazione di una coltura starter costituita da microrganismi autoctoni rappresentativi della biodiversità caratterizzante la filiera dei formaggi a pasta filata del molise. A tal proposito, a partire da caseificazioni realizzate con latte proveniente da vacche allevate sulle quote più alte dell Appennino molisano, sono stati isolati oltre 1000 ceppi di potenziale interesse caseario. Gli isolati, identificati attraverso approcci fenotipici e genotipici, sono stati caratterizzati per le attività di interesse tecnologico. In dettaglio, per i differenti isolati, dopo aver indagato in merito alla loro diversità genica, è stata valutata la loro la capacità acidificante, proteolitica e aromatizzante. Sulla base dei risultati relativi all identificazione, alla studio della biodiversità nonché alla caratterizzazione tecnologica sono stati individuati i ceppi batterici da candidare alla formulazione di colture starter multiple. Infine azioni di validazione su scala pilota ed il collaudo su scala industriale hanno consentito di individuare la coltura starter che meglio preserva il patrimonio microbico dei formaggi molisani a pasta filata assicurando, nel contempo elevati standard di qualità e di sicurezza. 2

5 3. MATERIALI E METODI 3.1 CAMPIONI OGGETTO DI ANALISI I campioni oggetto di studio sono stati prelevati da lavorazioni di caciocavallo molisano condotte presso il caseificio Barone, situato nel comune di Vinchiaturo (CB). Dette caseificazioni sono state realizzate impiegando latte crudo proveniente da vacche allevate sulle quote più alte dell appennino molisano senza impiego di colture starter e siero-innesto. Da ciascuna lavorazione sono stati prelevati i prodotti finiti e differenti intermedi di lavorazione. In dettaglio, sono stati prelevati campioni di latte crudo, cagliata, cagliata matura (acidificata), cagliata sottoposta a filatura, caciocavallo appena formato e caciocavallo dopo 14, 28 e 45 giorni di stagionatura. I campioni da sottoporre ad analisi microbiologiche e chimico-fisiche, sono stati prelevati asetticamente, trasportati presso i laboratori del DiAAA (Dipartimento Agricoltura Ambiente e Alimenti, Università degli Studi del Molise) in contenitori sterili, mantenuti alla temperatura di 4 C e sottoposti ad analisi entro due ore dal prelievo. 3.2 ANALISI MICROBIOLOGICHE Per l esecuzione delle analisi microbiologiche sono state allestite opportune diluizioni decimali in soluzione fisiologica sterile (0,9% cloruro di sodio), prelevando 10 g per i campioni solidi e 10 ml per quelli liquidi. I campioni solidi sono stati omogeneizzati in omogeneizzatore (BagMixer VV, Interscisence) applicando due cicli da un minuto. Le diluizioni ottenute sono state utilizzate per il conteggio microbico in piastra dei gruppi microbici di seguito riportati: Mesofili totali (CMT) determinati su Plate Count Agar (Oxoid) dopo 48 ore di incubazione a 30 C; Batteri lattici mesofili di forma bastoncellare contati su piastre di MRS agar (Oxoid) dopo incubazione a 28 C per 72 ore in condizioni di microaerofilia (gas pack anaerobic System, BBL, Becton Dickinson); batteri lattici termofili di forma bastoncellare contati su MRS agar (Oxoid) dopo incubazione a 44 C per 48 ore in microaerofilia (gas pack anaerobic System, BBL, Becton Dickinson); 3

6 batteri lattici mesofili di forma coccica determinati su M17 agar (Oxoid) dopo incubazione a 28 C per 72 ore; batteri lattici termofili di forma coccica determinati su M17 agar (Oxoid) dopo incubazione a 44 C per 24 ore; Pseudomonas spp. contati su piastre di Pseudomonas Agar Base (Oxoid) addizionato del supplemento selettivo SR 102E (Oxoid) incubate a 22 C per 24 ore; Enterobacteriaceae sono state determinate su VRBGA (Oxoid) dopo incubazione a 37 C per 24 ore; Coliformi totali e fecali determinati su VRBLA (Oxoid) dopo incubazione rispettivamente a 37 C e 44 C per 24 ore di incubazione; Enterococchi valutati su piastre di S&B (Oxoid) incubate a 37 C per 48 ore. 3.3 ISOLAMENTO DEI BATTERI LATTICI Da ciascuna piastra di M17 e MRS concernente i campioni analizzati e contenente un numero di colonie compreso tra 30 e 300, sono state isolate 5 colonie con differente morfologia. Gli isolati sono stati purificati mediante purificazione per striscio superficiale sui rispettivi substrati nutritivi agarizzati. Gli isolati ottenuti sono stati conservati a 4 C in infissioni di M17 e MRS. 3.4 PRELIMINARE IDENTIFICAZIONE FENOTIPICA DEI BATTERI LATTICI ISOLATI I batteri lattici di forma coccica e bastoncellare sia mesofili sia termofili, sono stati identificati attraverso le seguenti analisi: osservazione al microscopio; colorazione di Gram; saggio della catalasi; produzione di CO 2 ; capacità di crescita a 10 C e 45 C (per i cocchi) e a 15 C e 45 C (per i lattobacilli); valutazione del profilo fermentativo. 4

7 3.5 IDENTIFICAZIONE GENOTIPICA PCR-DGGE ESTRAZIONE DEL DNA Per l identificazione tramite PCR-DGGE e successivo sequenziamento del gene che codifica per l rrna 16S, si è proceduto all estrazione del DNA da colture pure. Nel dettaglio, 2 ml di ciascuna coltura pura overnight, precedentemente riattivata mediante doppio passaggio in brodo di coltura sterile, è stata centrifugata a g/min per 10 minuti alla temperatura di 4 C, ed il pellet cellulare è stato sottoposto all estrazione del DNA secondo il metodo descritto da (Querol et al., 1992) per i lieviti, con l aggiunta di lisozima (25 mg/ml, Sigma) e mutanolisina (10 U/ml, Sigma) utilizzati per la digestione della parete batterica QUANTIFICAZIONE E STRANDARDIZZAZIONE DEL DNA ESTRATTO Ogni miscela ottenuta dal processo di estrazione è stata diluita 70 volte utilizzando acqua deionizzata sterile (10 µl di DNA diluito in tampone TE µl di acqua) e sottoposta ad una lettura spettrofotometrica nel campo della luce ultravioletta, in cuvette di quarzo, alla lunghezza d onda di 260 nm, in accordo con quanto descritto da (Sambrook et al., 1989); il valore ottenuto è stato poi utilizzato per calcolare la concentrazione, espressa in µg/ml, di DNA effettivamente estratto usando la formula : dove: A = assorbanza a 260 nm; d = diluizione del campione; µg/µl DNA = A x d x 0,05/c.o. 0,05 = costante di calcolo per DNA a doppia elica; c.o. = cammino ottico della cuvetta (1 cm). Il DNA quindi è stato opportunamente diluito con acqua deionizzata sterile calcolando gli esatti volumi dalla seguente formula: dove: C 1 V 1 = C 2 V 2 5

8 C 1 = concentrazione iniziale del DNA; V 1 = volume di DNA concentrato da prelevare; C 2 = concentrazione desiderata di DNA (100 ng); V 2 = volume finale. Parallelamente è stata valutata la purezza dei campioni di DNA tenendo conto del rapporto tra il valore di assorbanza a 260 nm e quello ottenuto alla lunghezza d onda di 280 nm: tale rapporto è sempre risultato compreso tra 1.8 e 2.0, indice di campioni ad elevato grado di purezza AMPLIFICAZIONE DEL DNA Al fine di ottenere gli ampliconi da differenziare tramite DGGE, è stata eseguita una reazione di PCR per il DNA dei batteri lattici utilizzando i primers che amplificano la regione variabile V1 del gene che codifica per l rrna 16S, aventi tali sequenze: - P1V1 (5 -GCG GCG TGC CTA ATA CAT GC-3 ) (Cocolin et al. 2001); - P2V1 (5 -TTC CCC ACG CGT TAC TCA CC-3 ) (Rantsiou et al. 2005). All estremità 5 del primer P1V1, inoltre, è stata attaccata una coda GC (CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G) (Sheffield et al., 1989): tale accorgimento consente prevenire la completa denaturazione degli ampliconi, permettendone dunque la rilevazione. La miscela di reazione, avente volume finale di 50 µl, è riportata in tabella 3.1: Tabella Mix di reazione PCR. Buffer dntps: datp, dctp, dgtp, dttp MgCl2 10 mm Tris HCl, ph 8.3, 50 mm KCl 0.2 mm per ciascuna classe nucleotidica 1.5 mm Primer senso 0.2 µm Primer antisenso 0.2 µm Taq polimerasi 1.25 UI Preparato e porzionato il mix, si è proceduto al caricamento di 2 µl (circa 200 ng) di DNA campione. Come controllo di reazione, è stata aggiunta ai campioni una prova in bianco, dove il DNA stampo è stato sostituito con acqua. Le amplificazioni sono state 6

9 eseguite in termociclatore MASTERCYCLER GRADIENT (EPPENDORF, Hamburg, Germany) usando il ciclo di amplificazione riportato in tabella 5.2. Tabella Programma di amplificazione del DNA. Denaturazione Annealing Estensione 95 C per 1 minuto 45 C per 1 minuto 72 C per 1 minuto Il primo ciclo è stato preceduto da uno step iniziale a 95 C per 5 minuti; dopo 35 cicli, c è stato uno step di estensione finale alla temperatura di 72 C della durata di 7 minuti. Per confermare l avvenuta amplificazione, prima di eseguire l analisi DGGE è stata effettuata una breve corsa elettroforetica su gel di agarosio all 1.5% p/v. L agarosio (Sigma, Italia) è stato sciolto nel tampone fino al raggiungimento dell illimpidimento della soluzione; successivamente, una volta raggiunta la temperatura di circa 50 C è stato versato nello stampo di formatura. In seguito, sono stati miscelati 7 µl dell amplificato e 3 µl di colorante Gel Loading Buffer. Il tampone di corsa è stato il TBE (Tris Borato EDTA) 0.5X. Ogni miscela è stata caricata in un pozzetto e sottoposta a corsa elettroforetica dapprima a 40V per 10 minuti, e successivamente a 120V per 60 minuti. Alla fine della corsa, il gel è stato colorato in una soluzione di bromuro di etidio alla concentrazione finale di 50 µg/ml per circa 30 minuti. Dopo decolorazione in acqua per circa 40 minuti, si è proceduto all acquisizione delle immagini mediante l impiego del GEL DOC 2000 (BioRad) ANALISI DGGE La DGGE è stata condotta mediante DCode TM Universal Mutation Detection System (BioRad, CA, USA). L elettroforesi è stata eseguita in gel di poliacrilamide (8% [p/v] acrilamide:bisacrilamide 37.5:1) dello spessore di 0.8 mm, utilizzando un range di denaturante compreso tra il 40% ed il 60%, crescente nella direzione della corsa elettroforetica. Le soluzioni denaturanti utilizzate sono state ottenute partendo da una soluzione basi di acrilamide-bisacrilamide al 40% p/v (37.5:1 acrialmide/bisacrilamide), TAE buffer 50X e acqua deionizzata sterile, a cui sono state aggiunte formamide e urea per ottenere le percentuali denaturanti volute, come riportato nella tabella

10 Tabella 3.3 Percentuali delle soluzioni denaturanti. Concentrazioni Reagenti 40% 60% Formamide (ml) Urea (g) In seguito, 7 µl di ciascun campione sono stati mescolati con 7 µl di Gel Loading Dye e caricati nei vari pozzetti con puntali capillari. La corsa elettroforetica è stata eseguita a 120V per 5 ore, alla temperatura costante di 60 C. Al termine della corsa elettroforetica, i gel ottenuti sono stati colorati attraverso immersione in soluzione di TAE 1X contenente 50 µg/ml di bromuro di etidio, per 20 minuti al buio. Successivamente, i gel sono stati esaminati e fotografati usando GEL DOC 2000 (BioRad) e il relativo software per analisi di immagine (Quantity one- BioRad) SEQUENZIAMENTO Gli isolati di maggiore interesse, in precedenza selezionati sulla base della caratterizzazione fenotipica e tecnologica, sono stati sottoposti a sequenziamento utilizzando il primer senso P1V1 5 - GCG GCG TGC CTA ATA CAT GC-3 (Cocolin et al. 2001) e il primer antisenso P4V3 5 -ATC TAC GCA TTT CAC CGC TAC-3 (Klijn et al. 1991) che amplificano circa 700 bp delle regioni V1-V3 del 16S rdna. Le amplificazioni sono state eseguite mediante Mastercycler Gradient (EPPENDORF Hamburg, Germany) utilizzando il mix di reazione riportato in tabella 3.4 e 3.5 cicli di reazione come riportati in Tabella 3.5. TABELLA MIX DI REAZIONE PCR Reagenti Tampone Buffer (DyNAzyme DNA Polymerase F-511) dntps:datp, dctp,dgtp, dttp Concentrazione finale Tris-HCl 10 mm; KCl 50 mm; MgCl2 1.5 mm 0.2 mm ognuno Primer senso P1V1 0.2 µm Primer antisenso P4V3 0.2 µm Polimerasi F-501L 1.25 UI 8

11 Acqua bidistillata fino a 50 µl Tabella Programma di amplificazione del DNA. Denaturazione iniziale Denaturazione Annealing Estensione Estensione finale 95 C x 5 min 95 C x 1 min 42 C x 1 min 72 C x 1.5 min 72 C x 7 min Al termine dell amplificazione, i campioni di DNA da sequenziare sono stati purificati mediante PCR Purification Kit (Qiagen, Italia) e spediti alla ditta esterna per il sequenziamento. Al fine di accertare in maniera definitiva l esatta collocazione tassonomica, le sequenze ottenute sono state analizzate mediante BLAST. 3.6 VALUTAZIONE DELLA BIODIVERSITA DEGLI ISOLATI MEDIANTE RAPD-PCR Estrazione DNA L estrazione del DNA è stata eseguita su brodocolture over night (5 ml di MRS broth) usando la tecnica descritta da Querol et al. (1992) per i lieviti, modificata con l uso di lisozima (25 mg ml -1 ) e mutanolisina (10 U ml -1 ) per la digestione della parete cellulare batterica. Quantificazione DNA estratto La concentrazione e la purezza del DNA estratto sono state valutate dalla determinazione della densità ottica a 260 e 280 nm, come descritto da Sambrook et al. (1989). Il rapporto tra la O.D. misurata a 260 nm e quella a 280 nm costituisce un indice che consente di avere indicazioni sulla purezza del DNA estratto. Un valore compreso tra 1,7 e 2 caratterizza le preparazioni ben estratte. Amplificazione 9

12 La reazione di amplificazione è stata condotta seguendo il metodo descritto da Andrighetto et al. (2001): a tale scopo, è stato utilizzato un volume di reazione finale pari a 25 µl, contenente 10 mmol. l -1 di Tris-HCl (ph 8.3), 50 mmol. l -1 di KCl, 200 µmol. l -1 rispettivamente di datp, dgtp, dctp and dttp, 1.5 mmol. l -1 di MgCl 2, 1 µmol. l -1 di primer, 80 ng di DNA e 2 U di DyNazyme II DNA polymerase (Finnzymes OY, Finland). Per la PCR è stato utilizzato un Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany), usando i seguenti primers e condizioni di amplificazione: M13: 5 GAGGGTGGCGGTTCT 3 (Huey & Hall, 1989). 35 cicli di: 94 C per 1 min, 40 C per 20 s, rampa a 72 C a 0.5 C s -1, 72 C per 2 min. D8635: 5 GAGCGGCCAAAGGGACGAGAC 3 (Akopyanz et al., 1992). Uno step iniziale a 94 C per 2 min, seguito da 35 cicli di: 94 C per 1 min, 42 C per 1 min, 72 C per 1.5 min, e uno step finale a 72 C per 10 min. Elettroforesi su gel d Agarosio I prodotti di amplificazione sono stati separati per elettroforesi in gel di agarosio all 1.5% (w/v) usando come tampone di corsa TBE 0.5 x. La separazione degli amplificati è avvenuta applicando un voltaggio pari a 90 V per una durata di 2 ore. Nel gel sono stati inseriti anche i marcatori di peso molecolare (marker ΙΙΙ + VΙ). Acquisizione e analisi dei profili I profili RAPD-PCR ottenuti sono stati acquisiti direttamente grazie all uso di una fotocamera digitale ImageMaster VDS (Amersham Pharmacia Biotech, Milano) e analizzati tramite il software Gel Compar Versione 4.1 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium). 10

13 Il calcolo della similarità dei profili delle bande è stato reso possibile grazie all applicazione del coefficiente di correlazione Pearson e il dendrogramma è stato ottenuto attraverso il metodo UPGMA ottenuto attraverso il metodo UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Average) (Vauterin & Vauterin, 1992). 3.7 CARATTERIZZAZIONE TECNOLOGICA DEI CEPPI DI BATTERI LATTICI I ceppi di batteri lattici sono stati caratterizzati valutando la capacità di esprimere tre attività pro-tecnologiche considerate fondamentali per il processo di caseificazione e per quello successivo di maturazione: la capacità acidificante, l attività proteolitica e lo sviluppo di off-flavours CAPACITA ACIDIFICANTE Per valutare la capacità acidificante, ogni singolo isolato è stato preliminarmente adattato mediante doppio rinfresco in tubi di Skim Milk al 10% e incubato all idonea temperatura ottimale di crescita. In seguito, tali colture over-night sono state inoculate al 3% v/v in tubi di Skim Milk ed è stato misurato il ph a tempo 0 (momento dell inoculo) e dopo 2, 4, 5, 6 e 8 ore. Le misurazioni sono state eseguite con phmetro Crison Basic SVILUPPO DI OFF FLAVOURS Lo sviluppo di off-flavours e di aromi è stato valutato in seguito alla prova sulla capacità acidificante e dopo 12 ore di incubazione, valutando mediante olfatto la presenza/assenza di odori sgradevoli. Inoltre, allo stesso tempo, è stata appurata la presenza di particolari odori caratteristici, derivanti dalle attività metaboliche microbiche, utilizzando la seguente scala di valutazione: Ø + intensità bassa; Ø ++ intensità media; Ø +++ intensità elevata; Ø - nessun odore percepito. 11

14 3.7.3 ATTIVITA PROTEOLITICA L attività proteolitica è stata valutata utilizzando due tecniche differenti: Ø Agar well diffusion; Ø Spot on the lawn. Anche in questo caso, così come per la capacità acidificante, è stato eseguito un preliminare adattamento in Skim Milk al 10%. Per entrambe le tecniche è stato utilizzato dello Skim Milk al 10% addizionato di agar all 1%. Per la tecnica agar well diffusion, sono stati realizzati dei pozzetti con diametro pari a 5 mm utilizzando dei puntali sterili; all interno dei pozzetti sono stati aggiunti 70 µl di brodo-coltura derivante dal precedente adattamento. Per la tecnica dello spot on the lawn, 4 µl di ogni brodo-coltura sono stati spottati sulla superficie dello Skim Milk agarizzato e, dopo successiva fase di fissazione con ausilio di cappa a flusso laminare, la totalità delle capsule Petri ottenute, è stata incubata alle rispettive temperature ottimali di crescita. Al termine del periodo d incubazione è stata valutata la presenza e la dimensione dell alone di chiarificazione come indice di avvenuta attività proteolitica. 12

15 4 RISULTATI E DISCUSSIONE 4.1 CARATTERI MICROBIOLOGICI Le analisi microbiologiche eseguite sui differenti campioni oggetto dello studio hanno definito in maniera chiara la composizione quali-quantitativa delle principali popolazioni microbiche, utili e indesiderate, colonizzanti la materia prima e alcuni intermedi di lavorazione della produzione di Caciocavallo Molisano (Figura 4.1). Il latte crudo all arrivo in caseificio, presentava un livello di carica mesofila totale pari a circa 4,8 log UFC/mL, in linea con il valore imposto dalla legislazione comunitaria (Regolamento CE 853/2004, all Allegato III, sezione IX, capitolo II, capo III, punto 1) e attestante l idoneità alla caseificazione. Inoltre, degna di nota è stata l assenza della maggior parte dei microrganismi indesiderati, enterobatteri, coliformi fecali e totali che si attestavano su valori irrilevabili. Carattere di distinguo, tra i microrganismi indesiderati, ha però assunto la presenza di Pseudomonas spp., gruppo per il quale è stato rilevato un livello di carica pari a circa 1 unità logaritmica, molto probabilmente dovuto a contaminazioni di tipo ambientale. Rilevante è apparsa la presenza di specie ascrivibili ai batteri lattici termofili e mesofili, utili per la caseificazione, che hanno mostrato livelli di carica rispettivamente pari a circa 3 e 5 log UFC/mL. Inoltre, meritevole di attenzione è stata la presenza degli enterococchi il cui livello di carica si attestava intorno a circa 4 log UFC/mL. Il quadro microbiologico relativo alla cagliata e alla cagliata matura (figura 4.1) fa apprezzare elevati livelli di carica di batteri lattici termofili e una costante assenza per la maggior parte dei microrganismi indesiderati. I dati ottenuti, oltre a indicare un ottimale andamento del processo di caseificazione, consentono di affermare che la materia prima impiegata e alcuni intermedi di lavorazione, presentano una buona qualità microbiologica relativamente sia agli aspetti igienico-sanitari sia quelli tecnologici. 13

16 10,00 Livelli di carica log UFC/g 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 Latte "L" Cagliata "C" Cagliata matura "CM" 1,00 0,00 CMT Lattobacilli mesofili Lattobacilli termofili Cocchi lattici mesofili Cocchi lattici termofili Enterococchi Enterobatteri Coliformi fecali Coliformi totali Pseudomonas spp. Figura Risultati delle analisi microbiologiche eseguite sui campioni di latte crudo, e intermedi di lavorazione (cagliata e cagliata matura) della lavorazione di caciocavallo molisano. La dinamica di crescita dei microrganismi oggetto d indagine durante la maturazione dei campioni sperimentali di Caciocavallo Molisano è riportata in Figura 4.2. Dall attenta analisi dei dati ottenuti è emerso un sostanziale aumento dei batteri lattici termofili fino al settimo giorno di maturazione, epoca alla quale la totalità dei gruppi microbici indesiderati presenti al momento della formatura, ha mostrato livelli di carica irrilevabili. In seguito, con il progredire della maturazione, sia i lattobacilli termofili sia i cocchi lattici termofili, hanno fatto apprezzare un andamento decrescente fino al quarantacinquesimo giorno, facendo registrare livelli di carica rispettivamente pari a circa 4 log UFC/g che mostrano una riduzione superiore alle tre unità logaritmiche rispetto ai valori registrati al settimo giorno. Interessante è stata la persistente dinamica di sviluppo dei LAB mesofili, per i quali è emerso un costante trend positivo durante l intero periodo di maturazione. Infatti, le forme cocciche ma soprattutto quelle bastoncellari, hanno raggiunto elevati valori di carica dopo 45 giorni, mostrando livelli di carica compresi tra 6 e 7 unità logaritmiche. Tale dato è stato confermato anche dall andamento costantemente crescente mostrato dai livelli di carica della carica mesofila totale che si attestava, a fine maturazione, su livelli pari a circa 7,6 log UFC/g di prodotto. 14

17 Infine, gli enterococchi, presenti sin dall inizio della maturazione (circa 5 log UFC/g), hanno evidenziato una dinamica di crescita pressoché costante durante l intero periodo di tempo considerato, facendo evincere un leggero incremento solo ed esclusivamente al quattordicesimo giorno di maturazione. Il quadro microbiologico emerso ha messo in luce le caratteristiche del microbiota caratterizzante la maturazione del Caciocavallo Molisano fino al quarantacinquesimo giorno di maturazione. Dall insieme dei dati microbiologici emerge che il latte, gli intermedi di lavorazione e il Caciocavallo sono contraddistinti da un ottimale qualità microbiologica e che l impiego di sieroinnesto, opportunamente condizionato, consente lo sviluppo e il sopravvento delle differenti specie di LAB pro-tecnologici. L elevata persistenza delle specie mesofile ascrivibili ai LAB, più resistenti alle stringenti condizioni ecologiche generate con il protrarsi della maturazione, ha evidenti benefici sui caratteri finali del prodotto finito. Tale persistenza è legata alla presenza degli NSLAB, rappresentati tendenzialmente da specie mesofile comunemente presenti nel prodotto finito ma non incluse generalmente nelle colture starter selezionate convenzionalmente utilizzate dalle industrie lattiero-casearie. 10,00 9, Livelli di carica log UFC/g 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 CMT Lattobacilli mesofili Lattobacilli termofili Cocchi lattici mesofili Cocchi lattici termofili Enterococchi Enterobatteri Coliformi totali Coliformi fecali Pseudomonas spp. Figura Dinamica di sviluppo dei microrganismi utili e indesiderati presenti nei campioni sperimentali di Caciocavallo durante l intero periodo di maturazione. Le epoche di analisi 0, 7, 14, 28 e 45 giorni di maturazione, sono riportate in legenda. 15

18 4.2 IDENTIFICAZIONE DEGLI ISOLATI I test fenotipici condotti sui 1025 isolati di batteri lattici provenienti dal latte, dagli intermedi di lavorazione e dal prodotto finito hanno consentito di delineare una prima collocazione tassonomica a livello di genere. In dettaglio, l insieme dei test fenotipici e biochimici condotti ha permesso di stabilire in maniera presuntiva l appartenenza degli isolati a cinque differenti generi: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc ed Enterococcus. I dati relativi all identificazione fenotipica uniti a quelli relativi all identificazione genotipica mediante PCR-DGGE e sequenziamento hanno permesso di identificare la totalità dei microrganismi a livello di specie facendo apprezzare una elevata eterogeneità. E. faecalis 4% E. faecium 8% Lc. lac)s 7% Ln. mesenteroides 3% Ln diace)lac)s 6% Lb. helve)cus 13% Lb. delbrueckii 11% Lb. rhamnosus 11% Lc. cremoris 6% Lb. paracasei 8% Lb. casei 9% S. thermophilus 14% Figura 4.3 Distribuzione percentuale delle specie del microbiota lattico caratterizzante la filiera del caciocavallo molisano. Come è possibile apprezzare dalla Figura 4.3 S. thermophilus, Lb. helveticus e Lb. delbrueckii rappresentano le specie microbiche più rappresentative della comunità lattica. Degna di interesse è anche la presenza di lattobacilli mesofili, quali Lb. rhamnosus, Lb. casei, Lb. paracasei e di ceppi riconducibili alle specie Lc. cremoris e Lc. lactis. Minoritaria è la presenza di ceppi riferibili alle specie del genere Enterococcus (E. faecalis e E. faecium) e alla specie Ln. diacetilactici. 16

19 L eterogeneità di specie è accompagnata anche da una ampia biodiversità tra i differenti ceppi riferibili alle medesime specie. Infatti, i risultati derivanti dall analisi RAPD-PCR (dati non mostrati) hanno fatto apprezzare un elevato polimorfismo tra i profili di ceppi appartenenti alla stessa specie. 4.3 CARATTERIZZAZIONE TECNOLOGICA La valutazione delle caratteristiche tecnologiche degli isolati ha fornito preliminari indicazioni riguardanti l attitudine alla caseificazione. La velocità di acidificazione è tra i criteri base per la selezione di una coltura starter poiché condiziona l intero processo produttivo per quanto riguarda i tempi di lavorazione e la qualità finale del prodotto. L attività proteolitica e la produzione di aromi rappresentano importanti attività protecnologiche in quanto partecipano alla definizione del profilo aromatico dei formaggi stagionati a pasta filata. I risultati concernenti la caratterizzazione tecnologica riportati nelle Figure 4.4; 4.5, Capacità acidificante 2.0 delta ph 6 ore lattobacilli cocchi lattici coccobacilli eterofermentanti Figura 4.4 Attività acidificante esibita da ceppi di batteri lattici a lattobacilli, cocchi lattici e coccobacilli eterofermentanti Dalla figura 4.4 è possibile apprezzare che la maggior parte dei ceppi sono protagonisti di una capacità acidificante medio-bassa. Tuttavia sono degni di attenzione alcuni ceppi riferibili ai lattobacilli termofili e ai cocchi lattici termofili. 17

20 Per quanto concerne la capacità proteolitica, l azione più performante è stata fatta apprezzare dai ceppi riferibili ai lattobacilli mesofili e agli enterococchi (Figura 4.5). Capacità proteolitica 2.5 diametro alone chiarificazione (mm) lattobacilli cocchi lattici coccobacilli eterofermentanti Figura 4.5 Attività proteolitica esibita da ceppi di batteri lattici a lattobacilli, cocchi lattici e coccobacilli eterofermentanti Figura 4.6 Attività proteolitica esibita da ceppi di batteri lattici a lattobacilli, cocchi lattici e coccobacilli eterofermentanti 18

21 4.4 FORMULAZIONE DI COLTURE STARTER Sulla base delle attività di interesse tecnologico e nel rispetto della biodiversità sono stati scelti 12 ceppi da candidare come costituenti di colture starter a composizione complessa. In particolare sono stati scelti 3 ceppi appartenenti alla specie S. thermophilus, 2 alla specie Lb. helveticus, 2 alla specie Lb. rhamnosus, 1 alla specie Lb. casei; 1 alla specie Lb. paracasei; 1 alla specie Lc. lactis; 1 alla specie Ln. diacetilactici e 1 alla specie E. faecalis. I dodici ceppi sono stati utilizzati in combinazioni differenti per la formulazione di 3 colture starter collaudate in prove di caseificazione. La combinazione dei differenti ceppi ha tenuto in considerazione la capacità acidificante, l intensità dell attività proteolitica, la formazione di aromi esibita dai ceppi nonché la tutela della biodiversità microbica. La coltura starter I ha previsto l impiego dei ceppi riferibili alle specie S. thermphilus e Lb. helveticus, selezionati in virtù del loro potere acidificante, in associazione con ceppi di interesse proteolitico ed aromatizzante riferibili alle specie Lb. rhamnosus, Lb. casei; Lb. paracasei e Lc. lactis. Le colture starter II e III, oltre ai ceppi previsti per la coltura starter I, sono state addizionate rispettivamente dei ceppi riferibili alle specie E. faecalis e Ln. diacetilactici. Il ceppo ascrivibile a Enterococcus faecalis, pur non essendo costituente abituale celle colture starter, è stato impiegato poiché in grado di produrre una moderata acidificazione accompagnata da elevata attività proteolitica e aromatizzante. Un discorso analogo è alla base della scelta del ceppo di Ln. diacetilactici che pur non rientrando convenzionalmente tra le colture starter per la produzione di paste filate, potrebbe contribuire notevolmente al corredo aromatico del prodotto essendo considerato un aromatizzante per eccellenza. In merito a tale scelta, è opportuno precisare che il ceppo pur essendo caratterizzato da metabolismo etero-fermentante, non genera alcun fenomeno alterativo poiché non trovandosi in condizioni ideali di sviluppo, è contraddistinto da un basso tasso di crescita. 19

22 Considerazioni conclusive Il caciocavallo molisano, il latte impiegato e gli intermedi di produzione rappresentano nicchie ecologiche che accolgono una straordinaria biodiversità di batteri riferibili alla comunità lattica. Elemento che non può essere assolutamente trascurato nella definizione di strumenti biotecnologici a garanzia della qualità del prodotto. Pertanto, la formulazione di colture starter deve essere rispettosa non solo di criteri volti all esaltazione di talune attività di interesse tecnologico ma deve tutelare il ricco patrimonio della biodiversità microbica propria delle paste filate molisane. Sulla base di tali risultati e considerazioni sono state formulate 3 differenti colture starter in grado di garantire elevati standard 20