SAPIENZA Università di Roma Laurea magistrale in Ingegneria delle Nanotecnologie A.A Corso di Laboratorio di Biofotonica

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1 SAPIENZA Università di Roma Laurea magistrale in Ingegneria delle Nanotecnologie A.A Corso di Laboratorio di Biofotonica Prof. Francesco Michelotti SAPIENZA Università di Roma Facoltà di Ingegneria Civile e Industriale francesco.michelotti@uniroma1.it

2 Applicazioni dell ottica e della fotonica Tecniche Microscopiche (MSC) Fluorescenza convenzionale TIRF FLIM FRET, FRAP confocale a due fotoni di seconda armonica a super-risoluzione (SNOM, STED, PALM, STORM) Tecniche Non Microscopiche Label-free Surface plasmon Polaritons (SPP) Photonic crystals (PC) Raman e CARS Quantum dots Tecniche Non Microscopiche Citofluorimetria ELISA DNA-Chip Cycle-sequencing SOLID Altre Tecniche Non Microscopiche Southern Western Northern Utilizzano tutte l emissione di marcatori (labels) luminescenti

3 LEZIONE 6 Microscopie a super-risoluzione (STEP, PALM, STORM) Test ELISA

4 STED STimulated Emission Depletion Microscopy Nella microscopia STED il campione viene eccitato e la fluorescenza viene raccolta come in microscopia convenzionale wide-field. Un secondo fascio causa la diseccitazione per emissione stimolata dei fluorofori in una zona anulare intorno all asse.

5 STED STimulated Emission Depletion Microscopy S e t 1 S g t2>t1 t

6 STED STimulated Emission Depletion Microscopy La diffrazione limiterebbe la risoluzione anche in questo caso. Il vero meccanismo responsabile dell aumento di risoluzione è la saturazione della riduzione di fluorescenza mediante emissione stimolata. I SAT La risoluzione è data da: x 2nsin 1 I I SAT

7 STED STimulated Emission Depletion Microscopy

14 STED STimulated Emission Depletion Microscopy I SAT NOTA BENE Se non c è saturazione della riduzione di fluorescenza (I SAT = ) la risoluzione è quella data dalla formula di Abbe ovvero è limitata dalla diffrazione. x 2nsin 1 I SAT I 2nsin

15 STED STimulated Emission Depletion Microscopy Dye name (Manufacturer / Distributor) Exc. Exc. Wavelengt Pulse h Length STED Wavelengt h STED Pulse Length Repetition Rate Avg. STED Power Peak Irradiance Reported Spatial Pulse Resolution Energy (Direction) ATTO 532 (ATTO-TEC GmbH) 470 nm 80 ps 603 nm 280 ps 250 khz 0.5 mw 2 nj <25 nm (xy) Chromeo 488 (Actif Motif) 488 nm 140 ps 602 nm ~ 160 ps 250 khz 0.6 mw < 30 nm (xy) DY-485XL (Dyomics GmbH) 488 nm < 100 ps 647 nm ~ 200 ps 72 MHz (20 + 3) mw nm (xyz) GFP 490 nm 100 ps 575 nm 200 ps 80 MHz 7.2 mw ~ 70 nm (xy) ATTO 565 (ATTO-TEC GmbH) 532 nm ~ 90 ps nm ~ 90 ps 1 2 MHz nm (xy) MR 121 SE (Roche Diagnostics) 532 nm 10 ps 793 nm 107 ps 76 MHz 10.4 mw ~ 50 nm (z) NK51 (ATTO-TEC GmbH) 532 nm < 100 ps 647 nm ~ 200 ps 72 MHz Sulfonated & rigidized rhodamine derivatives (V. Boyarskiy, NanoBiophotonics, MPI Göttingen) Pyridine 2 / LDS 722 (Exciton, Radiant Dyes GmbH) 532 nm 100 ps 640 nm ~ 300 ps 80 MHz (20 + 3) mw 40 MW/cm nm (xyz) < 90 nm (xy) 554 nm 250 fs 760 nm 13 ps 76 MHz 33 nm (z) RH 414 (Invitrogen Corp.) 554 nm 250 fs 745 nm 13 ps 76 MHz 8.78 mw 30 nm (z) ATTO 590 (ATTO-TEC GmbH) 570 nm ~ 90 ps ATTO 633 (ATTO-TEC GmbH) 630 nm ~ 90 ps nm nm ~ 90 ps 1 2 MHz nm (xy) ~ 90 ps 1 2 MHz nm (xy) ATTO 647N (ATTO-TEC GmbH) 635 nm cw 750 nm cw cw 423 mw ~ 50 nm (xy) JA 26 (K.H. Drexhage, Siegen University) 635 nm 68 ps 775 nm 300 ps 76 MHz 800 MW/cm 2 16 nm (x)

16 STED STimulated Emission Depletion Microscopy Operando sulla focalizzazione del fascio STED si può ottenere una riduzione di fluorescenza 3D e migliorare anche la risoluzione assiale

17 STED STimulated Emission Depletion Microscopy Visualizzazione di singole vescicole in una sinapsi. Più precisamente si vede la proteina sinaptotagmina che è inglobata nella membrana delle vescicole. Le vescicole hanno una dimensione media di 40nm e sono riempite di neurotrasmettitori.

18 STED STimulated Emission Depletion Microscopy Immagine confocale e STED ottenuta mediante un microscopio Leica

19 STED STimulated Emission Depletion Microscopy

20 PALM Photo-Activated Localisation Microscopy STORM - STochastic Optical Reconstruction Microscopy La base di base di entrambe le tecniche è quella di: Marcare il campione da osservare con cromofori Portare medianti un impulso di luce i cromofori in uno stato dark da cui possono essere fotoattivati in uno stato fluorescente mediante un secondo impulso di luce; A causa della natura stocastica della fotoattivazione, solo pochi e ben separati cromofori saranno accesi. La probabilità che vengano attivati due cromofori vicini è bassissima. L emissione di tali cromofori viene fittata mediante curve gaussiane recuperando la coordinata dell emettitore; Al termine dell emissione le poche molecole attivate vengono irportate nello stato dark e un altro impulso di luce di fotoattivazione attiva altri cromofori random Il processo è ripetuto molte volte costruendo l immagine molecola per molecola.

21 PALM Photo-Activated Localisation Microscopy STORM - STochastic Optical Reconstruction Microscopy Sono due tecniche sostanzialmente identiche che fanno uso di una massiccia analisi statistica dei dati di fluorescenza. CCD n La posizione di un fluoroforo viene determinata con alta precisione fittando la figura di diffrazione che viene a crearsi su un dispositivo di rivelazione a CCD.

22 PALM Photo-Activated Localisation Microscopy STORM - STochastic Optical Reconstruction Microscopy Il campione viene illuminato con impulsi di luce che attivano stocasticamente pochi fluorofori a volta. La probabilità che si attivino due fluorofori contigui viene minimizzata. Le posizioni dei fluorofori vengono fittate ad ogni impulso. CCD Non ci si trova mai in condizioni di sovrapposizione delle figure di diffrazione sotto il criterio di Rayleigh. Il processo viene ripetuto fino a ricostruire l immagine.

23 PALM Photo-Activated Localisation Microscopy STORM - STochastic Optical Reconstruction Microscopy Confronto tra TIRF e PALM ottenuata mediante un microscopio Zeiss. Marcatura mediante anticorpi di tubulina in cellule coltivate.

24 STED STimulated Emission Depletion Microscopy PALM Photo-Activated Localisation Microscopy STORM - STochastic Optical Reconstruction Microscopy Riassunto delle tecniche

26 Tecniche non microscopiche ELISA - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ELISA è un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato antigene, tipicamente appartenente a un microorganismo patogeno, grazie all'uso di uno specifico anticorpo. Esistono due varianti del test ELISA: Elisa non Competitivo ed Elisa Competitivo. Il test Elisa non competitivo può essere condotto secondo due varianti: metodo diretto e metodo indiretto. I test sono colorimetrici e la lettura avviene mediante uno spettrofotometro.

27 ELISA non Competitivo

28 ELISA non Competitivo Preparazione dei pozzetti di una apposita piastra da saggio in polistirene mediante immissione di una soluzione dell'anticorpo primario, specifico per l'antigene da ricercare. L'anticorpo aderisce al fondo dei pozzetti per mezzo di gelatina di pesce. L'eccesso viene lavato via. Aggiunta dei campioni umani nei quali bisogna saggiare la presenza dell'antigene caratteristico dell organismo patogeno. Lavaggio con soluzione tampone. L'antigene, se presente, si lega specificamente con l'anticorpo. L eccesso viene lavato via. Aggiunta degli anticorpi secondari. Tali anticorpi sono coniugati con un enzima, tipicamente perossidasi o fosfatasi alcalina.

29 ELISA non Competitivo Gli anticorpi secondari si legano selettivamente all'antigene, se presente. L'eccesso viene lavato via. L assenza dell antigene specifico per l anticorpo comporta che l anticorpo secondario (e il relativo enzima ad esso coniugato), con il lavaggio, venga lavato. Aggiunta di p-nitrofenilfosfato, che provoca una reazione con l enzima coniugato all'anticorpo secondario producendo p-nitrofenolo di colore giallo. Aggiunta di idrossido di sodio per bloccare la reazione tra enzima e p- nitrofenilfosfato. Lettura del risultato mediante uno spettrofotometro.

30 ELISA non Competitivo

31 ELISA Competitivo Anticorpi provenienti da un saggio non marcati sono incubati in presenza dei loro antigeni. Tali complessi anticorpo/antigene sono immessi nei pozzetti di una piastra funzionalizzati con gli stessi antigeni. La piastra viene sciacquata in modo da rimuovere gli anticorpi non legati. Si immettono anticorpi secondari specifici per il primo anticorpo. Gli anticorpi secondari sono accoppiati ad un enzima. Si aggiunge un substrato e gli enzimi rimanenti causano un cambiamento cromatico. Nel test ELISA competitivo, più alta è la concentrazione di antigeni nel saggio e più debole è il segnale. Il vantaggio è di poter utilizzare campioni impuri ed essere ancora in grado di legare selettivamente qualsiasi antigene presente.

32 ELISA Competitivo

33 Tecniche non microscopiche ELFA - Enzyme-Linked Fluorescence Assay ELFA è un evoluzione del test ELISA. L enzima legato all anticorpo secondario converte il substrato in un composto luminescente La lettura avviene mediante un fluorimetro Figure 1: Fluorescence image of a 96-well platereader plate filled with an ELISA. The red framed wells contain known concentrations and the blue framed wells the unknowns. The wells marked with other colours contain control solutions.

34 Tecniche non microscopiche ELFA - Enzyme-Linked Fluorescence Assay

35 Tecniche non microscopiche ELFA - Enzyme-Linked Fluorescence Assay

36 Tecniche non microscopiche Sequenziamento DNA Introduzione al metodo Sanger Il metodo di Sanger permette di sequenziare il DNA utilizzando delle tecniche biochimiche associate all utilizzo di marker radioattivi. Si avvale di reazioni di polimerizzazione di sequenze di amminoacidi (Nobel Chimica 1980) e della tecnica della corsa elettroforetica (Nobel Chimica 1958) sangerseq.exe

37 Tecniche non microscopiche Cycle sequencing Evoluzione metodo Sanger Il metodo di Sanger permette di sequenziare il DNA utilizzando delle tecniche biochimiche associate all utilizzo di marker radioattivi. Si avvale di reazioni di polimerizzazione di sequenze di amminoacidi (Nobel Chimica 1980) e della tecnica della corsa elettroforetica (Nobel Chimica 1958) cycseq.exe

38 Tecniche non microscopiche Cycle sequencing Esempio

39 Tecniche non microscopiche Cycle sequencing Esempio

40 Tecniche non microscopiche Cycle sequencing SOLID - Ulteriore evoluzione SOLID.wmv