Analisi genomiche e prevenzione delle malattie rare

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Rosa Neri
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1 Novità e criticità nella diagnostica in pediatria Fano Analisi genomiche e prevenzione delle malattie rare Antonino Forabosco Laboratorio genetica medica «cante di montevecchio Università di urbino

2 Una malattia rara è considerata ogni malattia che ha, nella popolazione generale, una prevalenza inferiore ad una data soglia, codificata dalla legislazione di ogni singolo paese. Nella UE si è stabilito di ritenere rara una malattia che colpisce meno di 5 persone su , (meno di 1 su 2000)

3 Non può essere considerata rara: a) la sindrome di Down perché oggi interessa ancora 1 caso ogni nati vivi b) l autismo(disturbi Spettro Autistico) poiché la sua prevalenza : per il Centro Statunitense per il Controllo delle Malattie è di 1 su 68 bambini in età scolare in Piemonte, è di 42 su bambini nella fascia di 6-10 anni.

4 Le malattie rare più frequenti nella nostra popolazione sono: a) la sordità congenita 1:2.000 nati b) la fibrosi cistica 1:2.500 nati c) il RM X-linked 1:1.000 nati maschi Sono tutte MALATTIE MENDELIANE e cioè monogeniche, le prime due autosomiche recessive, la terza recessiva legata all X.

5 Secondo l'oms, le malattie rare oggi conosciute sono tra le 7mila e le 8mila e sono per: a) 80% genetiche (mendeliane) b) 20% complesse e cioè dovute a fattori genetici ed ambientali.

6 Ad oggi nella UE le malattie rare incidono sul 6-8% della popolazione, in pratica sono interessate da 27 a 36 milioni di persone. L attivazione di programmi di contrasto a queste malattie appare così indispensabile.

7 Caso clinico Simona, di anni 10, è stata inviata per una valutazione sindromologica sulla base di una condizione clinica sintetizzata da ritardo mentale di grado medio con impaccio motorio globale in aggiunta a dismorfismi multipli

All osservazione si riscontra: brachicefalia, bozze frontali evidenti facies larga, rime palpebrali rivolte verso l'alto, naso con radice larga, ipoplasia malare, lieve macroglossia, accentuato

8 All osservazione si riscontra: brachicefalia, bozze frontali evidenti facies larga, rime palpebrali rivolte verso l'alto, naso con radice larga, ipoplasia malare, lieve macroglossia, accentuato prognatismo brachidattilia con piega palmare unica bilaterale, palmo di entrambe le mani ricoperto di cicatrici da esiti di ustione e dita con importante onicofagia i genitori segnalano cambiamenti repentini e violenti dell umore, auto ed etero aggressività

9 Il cariotipo, eseguito con procedura standard, è risultato: femminile normale Questo consente di escludere una possibile trisomia 21 a mosaico come diversi elementi del quadro clinico potevano lasciar prospettare

10 NUOVE TECNOLOGIE DI ANALISI GENOMICHE a) Ibridazione genomica comparativa su microarray o «cariotipo molecolare» (Array.CGH : Array-Comparative Genomic Hybridization), b) Sequenziamento di nuova generazione (NGS: Next Generation Sequencing)

11 Entrambe queste nuove tecnologie NON sono in grado di: a) identificare riarrangiamenti cromosomici bilanciati, b) rilevare mosaicismi nei quali una linea cellulare è poco rappresentata (<20%)

12 L introduzione di queste tecnologie nella diagnostica pediatrica ha portato una vera rivoluzione nella diagnostica del complesso delle malattie rare In sintesi questa rivoluzione è data dal passaggio nella diagnosi dall approccio «genetico» a quello «genomico»

13 La GENETICA nel suo studio del vivente parte dall individuo e dai suoi caratteri (in medicina parte dalla clinica) per giungere alla loro informazione cromosomica e/o genica Individuo/Carattere GENE

14 La GENOMICA si muove invece in un modo che rovescia quello della genetica: parte dal genoma per giungere al carattere/individuo Genoma Carattere/Individuo

15 GENOMA È il «sistema informazionale dei viventi» con i suoi caratteri: a) morfo-strutturali b) di contenuto informazionale

16 Trisomia 21

17 Traslocazione reciproca bilanciata

18 IBRIDAZIONE COMPARATIVA mediante FISH (Fluorescent in situ Hybridization)

19 CARIOTIPO FISH CARIOTIPO MOLECOLARE

20 Profilo array-cgh di una duplicazione interstiziale 10q11.22 La dimensione della duplicazione è di circa 4,8 Mb. Il punto di rottura prossimale è tra 45,478 e 46,578 Mb quello distale tra 51,264 e 51,676 Mb.

21 «Cariotipo molecolare» è il termine corretto a rappresentare i dati della array-cgh. Questa tecnica, come il cariotipo, permette di apprezzare VARIAZIONI QUANTITATIVE del genoma sino a livello dei geni, ma come il cariotipo, non è in grado di leggere l informazione presente in essi. Per questo dato è necessario ricorrere al SEGUENZAMENTO

22 TECNICHE DI SEQUENZIAMENTO 1977 Generazione 0 Sequenziamento chimico 1985 Generazione 1 Sanger Dye-terminator 1996 Generazione 2 NGS preamplificazione 2006 Generazione 3 NGS su singola molecola

23 NEXT GENERATION SEQUENCING Riduzione dei costi

24 Grazie ai costi e ai tempi estremamente ridotti del NGS è possibile analizzare un elevato numero di frammenti di DNA in parallelo fino ad ottenere la sequenza completa (o quasi) di un dato genoma

26 NATURE VOL OCTOBER

28 ORGANIZZAZIONE INFORMAZIONALE del GENOMA UMANO Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) Consortium (2012)

29 L'ESOMA è la parte del genoma che è in grado di esprimere per una proteina: è la fetta codificante del genoma.

30 ESOMA UMANO Contiene circa esoni che costituiscono circa il 2% del genoma e si stima che contenga fino all 85% di tutte le mutazioni patogene. Pertanto, il suo sequenziamento (exome sequencing) rappresenta un approccio efficace e molto meno costoso rispetto al sequenziamento dell intero genoma. (La comunità tecnico-scientifica è intenzionata portare a il costo del sequenziamento dell intero genoma)

31 Exome Sequencing Il sequenziamento dell esoma di un individuo ha oggi due alternative: a) Whole Exome Sequencing (WES) tutti i e passa geni del genoma umano, b) Clinical Exome Sequencing (CES), i circa geni fino ad ora noti per essere associati a malattia

32 Sta. ed a costi progressivamente decrescenti

33 Simona Il suo quadro clinico aveva diversi elementi che potevano portare a prospettare la sua possibile condizione sindromica e di conseguenza a richiedere, «come da tradizione», le indagini genetiche suggerite da questa sindrome

34 Ad esempio «il palmo di entrambe le mani ricoperto di cicatrici da esiti di ustione, le dita con onicofagia e la segnalazione dei genitori di repentini e violenti cambiamenti dell umore e di auto ed etero aggressività» ci poteva portare ad indagare il complesso delle sindromi da auto ed etero-aggressività e/o insensibilità al dolore

35 La motivazione d invio ritardo mentale di grado medio con impaccio motorio globale in aggiunta a dismorfismi multipli era tuttavia PIÙ CHE SUFFICIENTE a proporre l avvio della strategia diagnostica suggerita dalle disponibilità delle nuove tecnologie. Per il basso costo e la rapidità dell esame la prima è l array-cgh

36 L analisi del cariotipo molecolare array-cgh ha evidenziato nella bambina un cariotipo femminile con delezione di 3,5 MB a livello del braccio corto del cromosoma 17 tra 16,68 e 20,23 Mb in 17p11.2

37 16,68Mb 20,23Mb

38 Sindrome di Smith-Magenis (SMS) facies cherubinica con guance paffute ipoplasia mediana del viso, ponte nasale depresso prognatismo. obesità e bassa statura brachidattilia, piede piatto o cavo

39 Sindrome di Smith-Magenis (SMS) ritardo nel linguaggio (96%) insensibilità al dolore (75%) ritardo mentale medio (100%) disturbo del sonno (100%); stereotipie (100%) auto aggressività (100%)

40 Delezione cromosomica 90% Mutazione puntiforme 10% Retinoic Acid Induced 1 (RAI1)

42 La SMS, che nel 90% dei casi deriva da micro-delezione e nel restante 10% dei casi da mutazione puntiforme, si può diagnosticare: a) nel primo caso con CGH-Array come abbiamo visto b) nel secondo caso con NGS usando «Clinical Exome Sequencing»

43 Partial of Clinical Exome Sequencing

44 La SMS è una malattia dominante che si presenta in FORMA SPORADICA perché la: a) delezione è de novo si verifica al concepimento b) mutazione è dominante aploinsufficiente che comporta la presenza della malattia nei portatori IN ENTRAMBI I CASI I GENITORI NON SONO PORTATORI

45 PROGNOSI GENETICA a) gli eterozigoti per microdelezione o per mutazione dominante aploinsufficiente (se sono fertili) hanno il 50% di probabilità di trasmettere la condizione ai figli, b) il rischio di ricorrenza dei genitori è pari a quello della popolazione generale per quella condizione (per la SMS è 1:25.000).

46 CONCLUSIONE DIAGNOSI GENETICA DI CONDIZIONI CLINICHE PEDIATRICHE a) Cariotipo standard b) Array CGH per tutte le anomalie cromosomiche numeriche/strutturali c) NGS-Clinical Exome Sequencing per: le malattie rare dominanti da aplo-insufficienza le malattie recessive

49 INTERVENTI GENOMICI (PREVENTIVI) PER LE MALATTIE MENDELIANE

50 Nelle malattie mendeliane il gene determina la malattia in modo TUTTO O NIENTE Questo si traduce nel fatto che è praticamente impossibile la riduzione del rischio di malattia senza agire : a) a livello del concepimento b) con strategie di «non nascita» che impongono la definizione dell assetto genetico del concepito e/o dei suoi genitori

51 1 - MALATTIE DOMINANTI DE NOVO SCREENING PREIMPIANTO/PRENATALE (POSTCONCEPIMENTO): a) con array CGH per tutte le anomalie cromosomiche numeriche/strutturali b) con Clinical Exome Sequencing-NGS per tutte le malattie rare dominanti da aplo-insufficienza

2- MALATTIE RECESSIVE: a) SCREENING PRECONCEZIONALE con Clinical Exome Sequencing-NGS in un componente della coppia b) successivo riscontro nel partner delle eventuali mutazioni

52 2- MALATTIE RECESSIVE: a) SCREENING PRECONCEZIONALE con Clinical Exome Sequencing-NGS in un componente della coppia b) successivo riscontro nel partner delle eventuali mutazioni ritrovate c) diagnosi preimpianto o prenatale (postconcepimento) in caso di esito positivo e cioè di presenza in entrambi i componenti la coppia della mutazione nel medesimo gene

53 Grazie per l attenzione

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