RICERCA DEGLI ALOGENURI MEDIANTE CROMATOGRAFIA SU CARTA
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- Marisa Spinelli
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1 RICERCA DEGLI ALOGENURI MEDIANTE CROMATOGRAFIA SU CARTA 1
2 Cromatografia: cenni preliminari Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela omogenea nei suoi componenti (analiti), per permetterne la determinazione qualitativa e quantitativa. Le tecniche cromatografiche sono basate sulla distribuzione differenziale (ripartizione) dei vari componenti di una miscela omogenea fra due fasi, una chiamata fase stazionaria o fase fissa e l altra chiamata fase mobile o eluente, che fluisce in continuo attraverso la fase fissa. 2
3 La cromatografia La cromatografia trae il suo nome dal greco e significa: «Scrittura con il colore». La prima cromatografia fu eseguita dal botanico di origine russa Michail Tswett che, intorno al 1900 scoprì che in un estratto di foglie verdi si trovano sei pigmenti diversi (due clorofille e quattro carotenoidi). Esperimento di Tsweet nella sua forma più semplice. Un estratto di foglie verdi in etere di petrolio viene travasato nella colonna contenente la fase stazionaria, costituita da carbonato di calcio. All inizio i pigmenti sono localizzati in testa alla colonna. Con l aggiunta di un adeguata quantità di solvente, i diversi pigmenti sono trascinati verso il basso e si separano lungo la colonna formando una serie di bande di colore e larghezza diversi. Il nome di "Cromatografia" fu scelto da Tswett per le tracce a colori (due verdi e quattro gialle) che i sei pigmenti avevano lasciato lungo la colonna cromatografica. 3
4 Cromatografia: cenni preliminari Fase stazionaria (FS) La fase stazionaria è fissa, può essere un solido o un liquido. Può trovarsi all interno di una colonna oppure essere supportata su una superficie piana. Fase mobile (FM) La fase mobile è un liquido o un gas che scorre sulla fase stazionaria. Essa provoca la migrazione di un soluto nella direzione del suo scorrimento. FM FS Le sostanze da separare vengono trasferite da una fase all altra. La fase mobile e la fase stazionaria sono scelte in modo che i componenti della miscela da separare si distribuiscano tra le due fasi. 4
5 Interazione soluto-fasi Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono determinate da legami deboli o reversibili: legami idrogeno interazioni dipolo-dipolo interazioni dipolo-dipolo indotto forze di Van der Waals attrazione coulombiana interazioni steriche Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello stesso processo cromatografico. 5
6 Cromatografia: cenni preliminari Si distinguono varie tecniche cromatografiche: la cromatografia su colonna Si esegue in colonne di vetro riempite di un opportuna sostanza insolubile (allumina, silice, ecc.). la cromatografia planare cromatografia su strato sottile Si esegue su un sottile strato di sostanza adsorbente, per esempio su uno strato di gel di silice, che rappresenta la fase stazionaria, disposta su una lastra di vetro, alluminio, ecc. cromatografia su carta Si esegue su strisce di carta speciale, dove la soluzione si muove per capillarità. 6
7 CROMATOGRAFIA PLANARE Cromatografia su strato sottile (TLC, Thin Layer Chromatography) Cromatografia su carta (PC, Paper Chromatography) TLC: la fase stazionaria è supportata su lastre di vetro, fogli di alluminio (lastrine). PC: la fase stazionaria è rappresentata da fogli di carta da filtro speciale. Si tratta di un gruppo di tecniche di cromatografia liquida di semplicissima applicazione, spesso impiegate per analisi preliminari di tipo qualitativo. La fase mobile liquida può eluire sulla fase fissa trascinando gli analiti e separandoli attraverso una delle seguenti modalità: modalità ascendente (per capillarità) modalità discendente (per gravità) modalità orizzontale (per diffusione laterale). Con la cromatografia planare è possibile ottenere efficaci separazioni in tempi che variano tra 10 minuti e 2 ore. 7
8 Esecuzione tecnica della cromatografia planare 1. Preparazione della fase stazionaria (lastrina o carta) 2. Preparazione della camera di eluizione o camera di sviluppo Si tratta in genere di recipienti di vetro di forma e volume opportuni dotati di un coperchio a tenuta. L eluente deve essere collocato sul fondo del recipiente, in modo da raggiungere il livello di 2-3 cm. Si chiude il coperchio e si lascia condizionare la camera con l eluente (condizionamento). 3. Deposizione del campione Con una matita morbida si traccia una linea di partenza del campione a cm dal bordo inferiore della lastrina o della carta da filtro speciale. Il campione può essere deposto sulla linea o come macchia (deposizione a goccia) o come striscia (deposizione lineare) attraverso l impiego di siringhe micrometriche (V = μl) o capillari. 4. Eluizione La lastrina o il foglio di carta è appoggiata nella camera di eluizione assicurandosi che il solvente non lambisca le macchie. L eluizione può avvenire per modalità ascendente (per capillarità), modalità discendente (per gravità) o modalità orizzontale (per diffusione laterale). 8
9 Esecuzione tecnica della cromatografia planare 9
10 Cromatografia planare Il risultato è (spesso ma non sempre) visualizzabile sotto forma di macchie colorate, ognuna dovuta ad un componente della miscela. Il riconoscimento delle sostanze può avvenire per confronto con standard di riferimento. Il parametro che caratterizza gli analiti è il cosiddetto R f o fattore di ritardo. R f = d analita d eluente 0 < R f < 1 d eluente I valori ottimali sono compresi tra 0.4 e 0.8. La separazione per cromatografia su carta è possibile quando i valori di R f differiscono di almeno 0.1. d analita A A B C Miscela (A+B+C) 10
11 Visualizzazione dei risultati Se le macchie non risultano colorate e quindi non visibili all occhio umano è possibile ricorrere a due metodi per visualizzare il risultato della separazione. Rivelazione con luce UV Se le sostanze da rilevare contengono gruppi cromofori (doppi legami coniugati, carbonili, carbossili, etc.) è sufficiente illuminare la lastrina con una lampada UV che emetta tra 254 e 366 nm. Illuminando la lastrina o la carta si osservano macchie luminose sul fondo scuro. Se le sostanze non contengono gruppi cromofori, prima o dopo l eluizione, si può impregnare la lastrina o il foglio di carta speciale di una sostanza fluorescente ai raggi UV. Illuminando la fase stazionaria con le apposite lampade si osserveranno macchie scure su uno sfondo fluorescente. Rivelazione con reagenti chimici La lastrina è spruzzata con una soluzione contenente sostanze in grado di reagire con i costituenti della miscela separata, generando composti colorati. In alcuni casi può essere necessario scaldare leggermente la lastrina per favorire la reazione. 11
12 SEPARAZIONE DI CLORURI, BROMURI E IODURI mediante cromatografia planare ascendente su carta Materiali: - camera di eluizione (o di sviluppo) - fase stazionaria: carta da filtro speciale - capillare - cilindro graduato Procedimento: Preparare la miscela di eluizione: Acetone/H 2 O = 8:2 (30 ml tot. camere piccole, 60 ml camere grandi). Saturare l atmosfera della camera cromatografica con i vapori del solvente (circa 1 ora). Tracciare sulla carta da filtro speciale una linea orizzontale a circa 3 cm dal bordo inferiore. Seminare con un capillare le sostanze in esame (NaCl o NaBr o NaI), solubilizzate in acqua, e la miscela in acqua dei tre sali. Disporre verticalmente la carta da filtro speciale nella camera di eluizione e chiudere ermeticamente (circa 1 ora). Quando il fronte del solvente si sposta fino a 3 cm dal bordo superiore togliere la carta da filtro speciale e lasciare asciugare. Spruzzare una soluzione di AgNO N sulla carta da filtro speciale. Osservare le macchie e calcolare Rf. 12
13 3 cm 3 cm I Br Cl miscela I Br Cl Miscela I + Br + Cl 13
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