Lavaggio Broncoalveolare - BAL

Lavaggio Broncoalveolare - BAL Alberto Pesci alberto.pesci@unimib.it Clinica Pneumologica Università degli Studi di Milano - Bicocca Azienda Ospedaliera San Gerardo - Monza

Lavaggio Broncolaveolare Introdotto come strumento di ricerca clinica da Reynolds and Newball nel 1974 Raccomandazioni della ERS nel 1989 (ERJ 1989;2:561) e nel 1999 (ERR 1999;9:25) Raccomandazioni dell ATS nel 1990 (ARRD 1990;141:S169)

Principi di Base e Tecnica del Lavaggio Broncoalveolare Definizione Aspetti tecnici della broncoscopia con BAL Indicazioni e controindicazioni Complicanze Dove effettuare il BAL Instillazione del liquido Recupero del liquido Processazione ed esame del BAL Costituenti normali del BAL

Definizione Il lavaggio broncoalveolare (BAL) è una tecnica che permette il recupero di componenti cellulari e non dalla superficie epiteliale del tratto respiratorio inferiore e differisce dal lavaggio bronchiale (BW) Il BAL, correttamente eseguito, campiona circa un milione di alveoli

Aspetti Tecnici della Broncoscopia con BAL Il BAL viene praticato come parte di una broncoscopia di routine. Viene consigliato il monitoraggio della funzione cardiaca, dell ossimetria e di fornire ossigeno supplementare (2-4 L/m) durante la metodica e fino a 30 m dopo, allo scopo di mantenere una saturazione superiore al 90% durante la procedura

Indicazioni Il BAL è ampiamente utilizzato in diverse malattie polmonari, peraltro gioca un importante ruolo nel management delle pneumopatie infiltrative diffuse: Eccellente nella diagnostica delle infezioni opportunistiche e delle forme neoplastiche Fornisce dati per una corretta diagnosi nelle forme idiopatiche Permette di valutare lo stadio di malattia e la risposta al trattamento (?)

Controindicazioni Aritmie cardiache gravi Instabilità emodinamica Recente infarto miocardico VEMS < 1 litro Asma con broncostruzione moderata Ipossiemia refrattaria Mancanza di cooperazione

Complicanze Febbre postbroncoscopia (2.5%) Polmonite (0.4%) Sanguinamento (0.7%) Broncospasmo (0.7%) L uso di grossi volumi di lavaggio aumenta l incidenza di complicanze. E stato segnalato un caso di pneumotorace

Dove Praticare il BAL Nelle malattie localizzate praticare il BAL nei segmenti coinvolti fornisce migliori risultati Nelle forme diffuse le sedi ottimali, a paziente supino, sono il lobo medio e la lingula Alcuni centri, nelle forme eterogenee, iniettano il liquido in due o tre sedi differenti

Instillazione del liquido Il BAL è praticato dopo l ispezione delle vie aeree e prima di biopsie o brushing La punta del broncoscopio deve essere incuneata in un bronco segmentario Viene iniettata soluzione fisiologica a 37 C La quantità instillata varia da 100 a 400 ml in aliquote da 20-60 ml

Recupero del liquido I Dopo che ogni aliquota è stata infusa essa viene recuperata con aspirazione dolce Durante l aspirazione deve essere evitato il collasso delle vie aeree (<100 mmhg) Il recupero totale varia dal 50 all 80% L abitudine al fumo, l età o la presenza di COPD riduce la quantità di liquido raccolto

Recupero del liquido II Un recupero di 100 ml non richiede ulteriori aliquote infusive Se il recupero totale è inferiore al 5% la procedura non è riuscita Se la differenza tra l instillato ed il recuperato è > a 100 ml cambiare area

Processazione ed Esame del Lavaggio Broncoalveolare Trattamento iniziale del campione di lavaggio Conta cellulare totale Lavaggi e citocentrifugazione Conta cellulare differenziata Espressione dei dati Adeguateza Componenti non-cellulari Immunofluorescenza e immunoistochimica

Trattamento Iniziale del Campione di Lavaggio Il BAL deve essere trasportato entro 30 min al laboratorio, altrimenti va conservato in ghiaccio (cellule a 4 C fino a 24 h) E controverso se unire la prima aliquota di recupero alle seguenti Il liquido deve essere messo in un unico contenitore, misurato e ben miscelato Va filtrato su uno strato di garza sterile

Conta Cellulare Totale La conta cellulare totale va fatta su campione di liquido in emocitometro prima di centrifugare La conta viene espressa in Cellule/ml L emazie e le cellule epiteliali possono essere contate ma non incluse nella conta totale

Lavaggi e Citocentrifugazione Il BAL viene suddiviso in provette di vetro siliconato o plastica e centrifugato a bassa velocità per 10-20 m Il sovranatante viene rimosso e congelato (-80 C) per future indagini I pellets cellulari riuniti vengono risospesi in soluzione di Hank o PBS senza Ca++ e Mg++ per uno o due lavaggi Aliquote dei successivi pellets (4x10^4 cell/ml) vengono citocentrifugate (8-10 vetrini)

Preparazione Vetrini Citocentrifugato Filtri Millipore Strisci diretti

Conta Cellulare Differenziata La conta cellulare differenziata viene eseguita su preparati essiccati all aria e colorati con May-Grunwald-Giemsa o Wright-Giemsa o Diff Quick Viene utilizzato un microscopio ottico a 40-100X contando in campi random 200-500 cellule Altre colorazioni utilizzate di routine: Perls, Papanicolau, Gram, Ziehl Nielsen

Espressione dei Dati Vengono contati ed espressi in percentuale (e/o n assoluto) Macrofagi, Linfociti, Neutrofili ed Eosinofili Il numero delle cellule ciliate e squamose deve essere valutato ma non incluso nella conta cellulare differenziata Questa procedura è operatore-dipendente e dovrebbe essere eseguita da un citologo esperto (indispensabile controllo qualita )

Adeguatezza del BAL Campioni non soddisfacenti contengono: Meno di due milioni di cellule Cellule epiteliali > 5% Essudato mucopurulento Eccessive emazie da trauma endoscopico Alterazioni degenerative o cattiva colorazione

Componenti Non Cellulari La determinazione di componenti non cellulari (immunoglobuline, mediatori, citochine, etc.) è complessa e l utilizzo clinico controverso a causa della variabilità del recupero Sono stati utilizzati markers endogeni (Urea, Albumina) o esogeni (Blu di Metilene) Queste componenti vengono espresse come unità /mg Marker o come unità /ml di BAL

Componenti Normali del BAL Cellularità Totale 500 400 300 200 100 Fumatori Non Fumatori 0 Cellule/ml x 10^3 Am Rev Respir Dis 1990;141:S169

Componenti Normali del BAL Conta Cellulare Differenziata 100 80 60 40 20 Fumatori Non Fumatori 0 Ma. Li. Ne. Eo. Am Rev Respir Dis 1990;141:S169

Immunofluorescenza e Immunocitochimica Il fenotipo e lo stato di attivazione dei linfociti del BAL può essere studiato facilmente in citofluorimetria. I markers più utilizzati sono CD3 (T-linfociti), CD4 (T-helper), CD8 (T-citotossici/suppressor), CD20 (B-linfociti) A livello di ricerca possono essere ricercate citochine intracellulari La ricerca delle cellule di Langerhans (CD1+) può essere fatta con microscopio a fluorescenza o con immunocitochimica su citocentrifugato

Componenti Normali del BAL Popolazioni Linfocitarie 70 60 50 40 30 20 10 0 CD3+ CD4+ CD8+ CD20+ Fumatori Non Fumatori Am Rev Respir Dis 1990;141:S169

Il BAL è diagnostico: Forme Infettive Neoplasie Proteinosi Alveolare Granulomatosi a Cellule di Langerhans

Forme Infettive Germi il cui isolamento è diagnostico: Pneumocystis carinii Toxoplasma Gondii Strongyloides Legionella Histoplasma capsulatum Coccidioides Immitis Blastomyces dermatididis Mycobacterium Tuberculosis Mycoplasma Pneumoniae Respiratory Sincitial Virus

Forme Infettive Germi il cui isolamento non è diagnostico ma può orientare la diagnosi ed il trattamento: Herpes Simplex Cytomegalovirus Aspergillus Fumigatus Candida Albicans Cryptococcus MOTT Batteri (cfu > 10 5 )

Galattomannano su BAL Autore Rivista OD index Cutoff Sensibilità % Specificità % Hong M Nguyen JCM 2007 >1 100 88 Meerssema W Am J Respir Crit Care Med 2008 0.5 88 87 Francesconi A JCM 2006 0,75 100 100 Husain S Transplantion 2007 0.5 60 95 1 60 98 Musher JCM 2004 1 61 98 0.5 76 94 Penack Annals of Oncology 2008 0.5 100 100 Clancy JCM 2007 1 100 90.8

Combined measurement of procalcitonin and soluble TREM-1 in the diagnosis of nosocomial sepsis. Gibot S et al, Scand J Infect Dis. 2007;39(6-7):604-8. Conclusions: the combined measurement of serum Procalcitonin (PCT) and BAL soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (strem-1) concentrations could be of interest in detecting the presence of a nosocomial sepsis and in discriminating VAP versus extrapulmonary infection.

Pulmonary infiltrates in non-hiv immunocompromised patients 200 150 100 50 n Totale n Positivi Cambio Terapia 0 Sangue Sputo PSB BAL Rano et al. Thorax 2001;56:379

Il BAL è di aiuto diagnostico: Sarcoidosi Polmonite da Ipersensibilità Pneumoconiosi (asbestosi, silicosi, berilliosi, cobalto) Alveolite Emorragica Polmonite Eosinofila Polmonite Organizzativa Criptogenetica (COP) Polmonite da Farmaci Danno Alveolare Diffuso (DAD)

Sarcoidosi Alveolite T linfocitaria (>16%) a prevalenza di CD4+ con ratio CD4+/CD8+ aumentata Ratio CD4+/CD8+ > 3.5 (sensibilità 53%, specificità 94%) Ratio CD4+/CD8+ < 1 (valore predittivo negativo del 100%) Neutrofili > 2% ed Eosinofili > 1% (diagnosi improbabile)

Polmonite da Ipersensibilità Alveolite T linfocitaria (>20%, spesso > 50%) a prevalenza di CD8+ con ratio CD4+/CD8+ ridotta (< 1%) T linfociti a fenotipo CD3+/CD8+/CD56+/CD 57+ Mastociti > 1% Macrofagi Schiumosi

Alveolite Linfocitaria nel BAL ratio CD4/CD8 Aumentata Uguale Ridotta Sarcoidosi Tubercolosi Polmonite Iper. Berilliosi LAM Silicosi Asbestosi Malattia Crohn Artrite Reumatoide Farmaci Indotta BOOP Infezione HIV Eur Respir Rev 1992;2:75

Eosinophils are not found in the lungs of normal individuals, so their presence in tissue or BAL identifies a pathologic process. Most common conditions associated with BAL eosinophilia: - ILD (e.g. IPF, sarcoidosis, SLE, and HP, 40%) - AIDS-related pneumonia (17%) - Idiopathic EP (15%) - Drug-induced lung disease (12%) Extremely high numbers of eos may be seen in BAL fluids in: - Parasitic infections - Drug reactions - ABPA - Acute and chronic EP - Hypereosinophilic sd. - CSS Travis WD et al: Non-Neoplastic Disorders of the Lower Respiratory Tract, AFIP 2002

Lavaggio Broncoalveolare 80 70 60 50 40 30 20 10 0 macrofagi linfociti neutrofili eosinofili BOOP IPF CEP HP Costabel U et al, ERJ 1992;5:791

Danno da Farmaci Reazione Citotossica Atipie cell. (citomegalia, bizzarria, nucleoli e nucleo ipercromasici, multinucleazione) Bleomicina, Metotrexate nitrosourea, busulfan, ciclofosfamide Emorragia Alveolare Alveolite Linfocitaria Siderofagi Emazie 40-50% linfociti Aumento CD8+ D-penicillamina, olio minerale, anfotericina B Metotrexate, sali d oro nitrofurantoina, azatioprina, amiodarone, ciclofosfamide, busulfan Alveolite Neutrofila Aumento neutrofili Bleomicina, Busulfan Alveolite Eosinofila Polmonite Lipidica Reazione eosinofila allergica Macrofagi con ampi vacuoli vuoti (Oil Red+) Nitrofurantoina, penicillina, sulfasalazina Gocce nasali oleose, lassativi

BAL Findings in Idiopathic Interstitial Pneumonia S.Veeraraghavan et al. Eur Respir J 2003;22:239

BAL in Fibrotic Idiopathic Interstitial Pneumonia Ryu YJ et al. Respiratory Medicine 2006

BAL in Fibrotic Idiopathic Interstitial Pneumonia Ryu YJ et al. Respiratory Medicine 2006

Significance of Bronchoalveolar Lavage for the Diagnosis of IPF. Ohshimo S et al. Am J Respir Crit Care Med 2009 [Epub ahead of print] CONCLUSIONS: BAL lymphocytosis changed diagnostic perception in six of 74 patients who would have been misdiagnosed as having IPF without BAL.

IPF rapid progressors do not have more BAL neutrophils and or eosinophils than slow progressors

BAL in IPF Diagnostic Value A finding of raised neutrophils (>3-4%) and raised eosinophils (>2%) is characteristic of IPF, but not diagnostic A lone increase in BAL lymphocytes or eosinophils is uncommon and these observations may influence diagnostic confidence The BAL cell count does not differentiate between fibrotic NSIP and UIP An increase in BAL lymphocytes is in favor of NSIP (idiopathic or secondary)

Alveolite Neutrofila Fibrosi Polmonare Idiopatica (UIP) Polmonite Interstiziale Desquamativa (DIP) Polmoniti Batteriche Connettiviti Bronchioliti Asbestosi Granulomatosi di Wegener Polmonite Interstiziale Acuta (AIP) ARDS

Alveolite Linfocitaria Sarcoidosi Berilliosi Polmonite da Ipersensibilità Tumori Silicosi Tubercolosi Infezioni Virali Connettiviti Farmaci Polmonite Interstiziale Linfocitaria (LIP)

Alveolite Eosinofila Polmonite Eosinofila Acuta e Cronica Churg Strauss Syndrome Sindrome Ipereosinofila Aspergillosi Bronco Polmonare Allergica Eosinofilia Polmonare Tropicale Farmaci Fibrosi Polmonare Idiopatica

Alveolite Mista (linfociti e neutrofili) Polmonite Organizzativa Criptogenetica (COP o BOOP) Connettiviti Polmonite Interstiziale Nonspecifica (NSIP)

Alterata Morfologia dei Macrofagi Alveolari Polmoniti da Ipersensibilità Proteinosi Alveolare Bronchiolite Respiratoria-ILD Alveolite Emorragica Polmonite Lipoidea

Il BAL come Metodica di Staging e Monitoraggio L utilizzo del BAL come metodica di staging per valutare l attività di malattia ed ottenere informazioni prognostiche è ancora dibattuto Non è ancora provato se BAL seriati abbiano un ruolo nel monitoraggio dell evoluzione della malattia e nel guidare il trattamento

Conclusioni Il BAL è una metodologia sicura, rapida e poco costosa nella diagnostica delle pneumopatie infiltrative diffuse La resa diagnostica migliore sia nei pattern alveolari E diagnostico in alcune condizioni (tumori, infezioni, Proteinosi, Istiocitosi x) e di aiuto diagnostico in altre (sarcoidosi, HP, OP, eosinofilie, DAD, embolia grassosa, pneumoconiosi) Per una corretta valutazione del BAL è indispensabile collaborazione tra Clinico- Radiologo e Patologo