RELAZIONE. Monitoraggio ed analisi dei parametri Escherichia coli ed Enterococchi intestinali sulle acque di balneazione anno 2007

RELAZIONE SULLA CAMPAGNA DI SPERIMENTAZIONE DEI NUOVI PARAMETRI MICROBIOLOGICI PREVISTI DALLA DIRETTIVA 2006/7/CE RELATIVA ALLA GESTIONE DELLA QUALITA DELLE ACQUE DI BALNEAZIONE Monitoraggio ed analisi dei parametri Escherichia coli ed Enterococchi intestinali sulle acque di balneazione anno 2007 A cura di: Area Tecnico Scientifica Dipartimento Regionale Laboratori Padova, novembre 2007 1

RELAZIONE SULLA CAMPAGNA DI SPERIMENTAZIONE DEI NUOVI PARAMETRI MICROBIOLOGICI PREVISTI DALLA DIRETTIVA 2006/7/CE RELATIVA ALLA GESTIONE DELLA QUALITA DELLE ACQUE DI BALNEAZIONE. Monitoraggio ed analisi dei parametri Escherichia coli ed Enterococchi intestinali sulle acque di balneazione anno 2007 A cura di: DIPARTIMENTO REGIONALE LABORATORI LABORATORI PROVINCIALI U.O. BIOLOGIA SEDI OPERATIVE DI: - ROVIGO: CECILIA MAINI, FRANCESCA MARTINELLO - VENEZIA: RITA FRATE, MARGHERITA SARTORI - VERONA: M.CRISTINA MOSCONI, MIRELLA PAPA 2

1. INTRODUZIONE E OBIETTIVI Il monitoraggio delle acque destinate alla balneazione è attualmente regolato dal D.P.R. 470/82 (e successive modifiche e integrazioni). I parametri microbiologici da ricercare sono Coliformi totali, Coliformi fecali e Streptococchi fecali. Il 24 marzo 2006 è entrata in vigore la Direttiva 2006/7/CE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 15 febbraio 2006, relativa alla gestione della qualità delle acque di balneazione che abroga la Direttiva 76/160/CEE dell 8 dicembre 1975. La nuova Direttiva dovrà essere recepita dagli Stati membri entro l inizio della stagione balneare 2008 ed introduce i nuovi parametri microbiologici Enterococchi Intestinali ed Escherichia coli che rappresentano la migliore corrispondenza possibile tra inquinamento di origine fecale e ripercussioni per la salute nelle acque destinate a scopi ricreativi. L Organizzazione Mondiale della Sanità da oltre un decennio ha riconosciuto la specie E.coli come indicatore primario di contaminazione fecale delle acque. Gli studi dell US EPA hanno inoltre contribuito ad avvalorare la necessità di sostituire, per la valutazione della qualità delle acque, il parametro Coliformi fecali con E.coli. La scelta, motivata dalla netta predominanza di E.coli nel materiale fecale e dalla minore sensibilità del microrganismo alle procedure di disinfezione, è stata ormai accreditata da tutta la comunità scientifica internazionale. Per quanto riguarda il gruppo dei microrganismi compresi sotto l unica definizione di Streptococchi fecali, negli ultimi anni, esso è stato soggetto ad ampia revisione. Gli studi più recenti hanno distinto, infatti, sulla base di caratteristiche fisiologiche e di tecniche di ibridizzazione del DNA, tre generi diversi di cui due, Enterococcus (che comprende le specie E. hirae, E. durans, E. faecalis, E. faecium) e Streptococcus (che comprende le specie S. bovis, S. equinus) comprenderebbero specie intestinali o di sicura origine fecale. Durante la campagna di balneazione 2007 l ARPAV ha avviato la sperimentazione dei metodi analitici per i parametri microbiologici, E.coli ed Enterococchi intestinali previsti dalla Direttiva 2006/7/CE. I metodi analitici utilizzati per la ricerca di Escherichia coli sono stati quelli riportati nelle seguenti norme: - UNI EN ISO 9308-3:2001 - APAT CNR IRSA 7030 F Man 29:2003 3

Il metodo previsto dalla norma UNI EN ISO 9308-3:2001 (metodo MPN) è uno dei due metodi indicati dalla Direttiva 2006/7/CE. Il campo di applicazione di tale norma specifica l utilizzo per la ricerca e l enumerazione di E.coli in acque superficiali e reflue particolarmente ricche di materiale in sospensione mediante inoculo in un terreno colturale liquido utilizzando il metodo miniaturizzato MPN. L altro metodo indicato dalla Direttiva 2006/7/CE sperimentato durante l anno 2006, che fa capo alla norma UNI EN ISO 9308-1:2002, e che prevede la filtrazione su membrana, a fronte di una maggior rapidità nella prima fase analitica, presenta bassa selettività e una crescita di fondo che può interferire con l enumerazione affidabile dei batteri coliformi ed E.coli. Tale metodica trova infatti idoneo campo di applicazione nell acqua disinfettata ed in acque potabili con carica batterica ridotta. Il metodo applicato APAT CNR IRSA 7030 F Man 29:2003 (metodo membrane filtranti MF), non è previsto dalla Direttiva 2006/7/CE ma è già in uso presso i laboratori ARPAV per la ricerca di E.coli in acque superficiali e reflue. Per la ricerca di Enterococchi intestinali si è fatto riferimento al metodo previsto dalla norma UNI EN ISO 7899-2:2003 che è stato confrontato con il parametro Streptococchi fecali previsto dal D.P.R. 470/82. Lo studio ha avuto come obiettivi: il confronto dei due metodi per la determinazione di E.coli il confronto di questi metodi con il metodo per la determinazione dei Coliformi fecali; il confronto dei metodi per la determinazione di Enterococchi intestinali e di Streptococchi fecali la valutazione delle correlazioni per evidenziare eventuali problematiche di carattere tecnico; 4

2. MATERIALI E METODI Determinazione di Enterococchi intestinali Il metodo applicato per la ricerca degli Enterococchi intestinali è contenuto nella norma UNI EN ISO 7899-2:2003. Consiste nella filtrazione su membrana del campione e successiva deposizione della stessa su un terreno selettivo Slanetz-Bartley Agar; la prova di conferma si esegue su terreno agarizzato Bile Aesculina Azide Agar che sfrutta la capacità dei batteri di idrolizzare l esculina, creando un precipitato nero caratteristico a 44 C dopo 2 ore. Determinazione di Escherichia coli Per la ricerca di Escherichia coli la norma UNI EN ISO 9308-3: 2001 prevede l utilizzo di un metodo enzimatico miniaturizzato che si basa sulla presenza dell enzima β-glucuronidasi che reagisce con uno specifico substrato 4-metilumbelliferil-β D-glucuronide (MUG) presente nei 96 pozzetti della micropiastra. In presenza dell enzima il substrato reidratato, con le diluizioni del campione, libera un composto fluorescente visibile nell ultravioletto a 366 nm. I risultati vengono espressi in MPN/100 ml. Il metodo F APAT CNR IRSA 7030 F Man 29:2003 consiste nella filtrazione su membrana e sfrutta lo stesso principio enzimatico del metodo precedente utilizzando il terreno Tryptone Bile X- Glucuronide Agar (TBX) addizionato con sostanze cromogene che rendono le colonie tipiche di colore blu-verde. I risultati sono espressi in UFC/100 ml. 5

Analisi statistica L elaborazione dei dati è stata eseguita impostando in fogli di calcolo Excel: a) l analisi della regressione lineare b) il coefficiente di correlazione campionaria R c) il test t di Student accoppiato. Per le prime due elaborazioni statistiche sono state utilizzate le funzioni di Excel mentre il t di Student accoppiato è stato impostato manualmente nel foglio di calcolo. Nella ricerca ambientale, le situazioni più ricorrenti sono quelle del confronto tra due medie campionarie. In questi casi, la distribuzione t di Student può essere derivata dal rapporto tra la differenze delle due medie campionarie ed il suo errore standard: t = differenza fra 2 medie campionarie errore standard della differenza fra le due medie campionarie Il test t accoppiato è contenuto nella norma UNI 6807-72: 1972 Metodi statistici per il controllo della qualità: confronto fra due serie di dati appaiati, significatività della differenza da zero della media delle serie di differenze e viene solitamente utilizzato per il confronto tra metodi analitici su serie di campioni; si avvale del criterio per cui ogni coppia di osservazioni fatte sullo stesso campione (serie) ha un fattore in comune e quindi le due osservazioni non sono indipendenti. Quindi ci sono 2n osservazioni, ma solo n campioni. Con i dati dipendenti tra loro, è preferibile applicare il test t di Student accoppiato poiché lavora sulle differenze tra le coppie di dati; il test è stato utilizzato nella sua forma bilaterale o a due code. I dati di una serie non sono permutabili indipendentemente da quelli dell altra serie e la numerosità dei dati deve essere la stessa. Nel caso da noi descritto si devono testare cinque condizioni sperimentali (Coliformi fecali, E.coli MPN, E.coli UFC, Streptococchi fecali, Enterococchi intestinali ) su di un insieme di elementi (campioni di acqua di mare e di lago) e confrontare i risultati a coppie. Il valore di t ottenuto viene messo a confronto con i valori critici di t corrispondenti a n-1 gradi di libertà e a probabilità bilaterale del 95 % e 99%. L ipotesi H 0 che si vuole testare è: accettare che dal confronto tra il valore di t calcolato e il valore critico dato dalle tabelle statistiche, le due serie provengano da una medesima popolazione e quindi la differenza tra le medie delle due serie sia non significativa. 6

Pertanto si deve verificare che: a. Per t calc t v 99% la differenza è significativa e le serie di dati appartengono a due popolazioni differenti, per tanto l ipotesi H 0 viene respinta b. Per t v 99% t calc t v 95% la situazione è dubbia e la differenza viene considerata semisignificativa c. Per t calc < t v 95% si accetta l ipotesi zero cioè la differenza non è significativa ν = gradi di libertà, che nel nostro caso sono infiniti per n > 100 dati. Dovendo confrontare dei valori espressi in UFC/100 ml, che possono arrivare fino a zero, con quelli del metodo MPN il quale presenta una sensibilità minima di 15 MPN/100 ml, abbiamo inserito il valore convenzionale 1 (uno) per tutti i risultati inferiori a 15 MPN/100 ml e sulla base di questa scelta sono state fatte tutte le elaborazioni (ARPAT, 2004). 7

3. RISULTATI LABORATORI PROVINCIALI DI VENEZIA E ROVIGO La sperimentazione per gli Enterococchi intestinali e per Escherichia coli metodo APAT CNR IRSA 7030 F Man 29:2003 (MF), è iniziata ad aprile, mentre per Escherichia coli con il metodo UNI EN ISO 9308-3:2001 (MPN) è iniziata il 27 giugno a Venezia e il 17 luglio a Rovigo. I campioni di cui sono stati prodotti i dati sperimentali per entrambi i parametri e che sono oggetto delle valutazioni statistiche di seguito riportate, sono stati complessivamente n. 583. Poiché uno degli obiettivi finali di questo lavoro è stata la comparazione di due metodi, specialmente per quanto riguarda E. coli, il data set è stato analizzato in modo unitario, non suddiviso per stazione o per litorale, per evitare di ottenere i dati frammentati, insufficienti per le singole analisi statistiche. Solo per E. coli sono state elaborate due regressioni lineari, la prima con i dati completi e la seconda eliminando dal data set le coppie di dati al limite inferiore di sensibilità e cioè quelli con 15 MPN/100ml. I n.583 campioni coinvolti nella sperimentazione per il parametro E. coli metodo MPN sono così ripartiti: Distribuzione percentuale dei valori di E.coli in MPN /100 ml >30MPN/100 ml 3% 30MPN/100 ml 5% <15MPN/100 ml 75% 15MPN/100 ml 17% Fig. 1: Percentuali dei campioni relative ai valori di E.coli secondo la norma UNI EN ISO 9308-3:2001 (metodo MPN) 8

Per i confronti statistici di seguito riportati, è stato eliminato un dato routinario fuori limite nei dati di Rovigo (per E. coli, 955 MPN/100 ml; 120 UFC/100 ml), per cui il numero finale di campioni analizzati è 86. Confronto dei metodi per E. coli Il confronto è stato impostato prima considerando l intero data set (n. 583 dati Fig. 2) e poi considerando le n. 45 coppie di dati ( Fig. 3 ) con valori superiori a 15 MPN/100ml. Questa pulizia dei dati è stata fatta per vedere se, impostando la regressione solo sui dati maggiormente significativi per entrambi i metodi, la correlazione migliorava, anche se la numerosità si è ridotta del 92%. APAT-CNR IRSA 7030 F (UFC/100 ml) 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Escherichia coli 0 50 100 150 200 250 300 350 UNI EN ISO 9308-3 MPN/100ml) y = 0.3485x + 0.6007 coeff. di correlazione R = 0.672 test T- accoppiato t = 6.491 Fig.2 E.coli APAT CNR IRSA 7030 F vs E.coli UNI EN ISO 9308-3 considerando l intero data set 9

APAT CNR- IRSA 7030 F UFC/100 ml) 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Escherichia coli 0 50 100 150 200 250 300 350 UNI EN ISO 9308-3(MPN/100ml) y = 0.2783x + 8.1011 coeff. di correlazione R = 0.515 test T- accoppiato t = 4.491 Fig.3 E.coli APAT CNR IRSA 7030 F vs E.coli UNI EN ISO 9308-3 considerando n. 45 dati significativi. Il confronto tra t-calcolato e il valore critico per un test a due code in entrambi i casi evidenzia che: Fig. 2 t calc (fig2) 6.491 >> t 99% 2.576 con infiniti gradi di libertà Fig. 3 t calc (fig3) 4.491 >> t 99% 2.69 con 44 gradi di libertà Viene respinta pertanto in entrambi i casi l ipotesi iniziale H0, in quanto la differenza delle medie delle due serie è significativa e quindi le serie appartengono statisticamente a due popolazioni diverse. La pendenza della retta di regressione è inferiore a 1 in entrambi i grafici, evidenziando una sovrastima dei conteggi di E.coli col metodo MPN. 10

Confronto tra E. coli e Coliformi fecali metodo membrane filtranti E.coli vs Coliformi fecali Coliformi fecali (UFC/100ml) 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 APAT CNR- IRSA 7030 F (UFC/100 ml) y = 0.786x + 1.6476 coeff.di correlazione R= 0.725 test t-accoppiato t= 3.372 Fig. 4 E.coli APAT CNR IRSA vs Coliformi fecali considerando i n.583 campioni Dall analisi dei dati in Fig. 4 si evince che t calc 3.372 >> t 99% 2.58 con infiniti gradi di libertà Si respinge pertanto l ipotesi zero per cui la differenza è significativa e quindi i due gruppi non sembrano statisticamente correlati. La correlazione sembra essere maggiore per valori prossimi allo zero. La pendenza della retta di regressione è inferiore a 1, evidenziando una sovrastima dei conteggi di E.coli a svantaggio di Coliformi fecali. Questo potrebbe essere anche attribuito alla lettura delle colonie dei Coliformi fecali che possono presentare in alcuni casi colorazioni soggettivamente interpretabili. 11

Confronto di E. coli MPN e Coliformi fecali Coliformi fecali (UFC/100ml) 140 120 100 80 60 40 20 0 E.coli vs Coliformi fecali 0 50 100 150 200 250 300 350 UNI EN ISO 9308-3 (MPN/100 ml) y = 0.382x + 1.4039 coeff.di correlazione R= 0.679 test T-accoppiato t= 4.781 Fig. 5 E.coli UNI EN ISO 9308-3 vs Coliformi fecali considerando i n. 583 campioni Il confronto dei metodi in Fig. 5 evidenzia t calc 4.781 >> t 99% 2.58 con infiniti gradi di libertà Si rifiuta perciò l ipotesi zero per cui la differenza è significativa e quindi i due gruppi non sono statisticamente correlati e le serie appartengono a due popolazioni differenti. La pendenza della retta di regressione è inferiore a 1, evidenziando una sottostima dei conteggi di Coliformi fecali a vantaggio di E.coli con il metodo MPN. Anche in questo caso il metodo UNI EN ISO 9308-3 sovrastima i conteggi, come già visto in Fig. 2 e 3. 12

Confronto Enterococchi e Streptococchi metodo membrane filtranti Streptococchi fecali (UFC/100ml) 140 120 100 80 60 40 20 0 Streptococchi fecali vs Enterococchi intestinali 0 50 100 150 200 250 300 350 Enterococchi intestinali (UFC/100 ml) y= 0.382x + 1.4039 coeff.di correlazione R= 0.620 test T-accoppiato t= 2.522 Fig. 6 Enterococchi vs Streptococchi metodo considerando i n.583 campioni La correlazione dei parametri è maggiore per valori vicini allo zero. Si ha che t 99% 2.58 > t calc 2.522 > t 95% 1.96 con infiniti gradi di libertà Pertanto la correlazione si definisce dubbia, cioè la differenza si considera semisignificativa. La spiegazione del mancato e peraltro atteso verificarsi di correlazione potrebbe ricadere sui diversi terreni e tempi di incubazione previsti per le prove di conferma. La correlazione dubbia può essere attribuita all elevata variabilità microbiologica che è statisticamente riconosciuta. 13

LABORATORIO PROVINCIALE DI VERONA La sperimentazione per Enterococchi intestinali e per Escherichia coli metodo APAT CNR IRSA 7030 F Man 29:2003 (MF) è iniziata ad aprile, mentre per Escherichia coli con il metodo UNI EN ISO 9308-3:2001 (MPN) è iniziata l 11 giugno. I campioni di cui sono stati prodotti i dati sperimentali per entrambi i parametri, sono complessivamente n. 780 per Enterococchi intestinali ed Escherichia coli metodo MF; 486 per Escherichia coli metodo MPN. Poiché uno degli obiettivi di questo lavoro è stata la comparazione tra due metodi per E. coli, il data set è stato analizzato in modo unitario, non suddiviso per stazione di campionamento, per evitare di ottenere i dati frammentati, insufficienti per le singole analisi statistiche. Solo per E. coli sono state elaborate due regressioni lineari, la prima con i dati completi e la seconda eliminando dal data set le coppie di dati al limite inferiore di sensibilità del metodo e cioè quelli con 15 MPN/100 ml. I n.486 campioni coinvolti nella sperimentazione per il parametro E. coli metodo MPN sono così ripartiti Distribuzione percentuale dei valori di E. coli in MPN /100 ml >30 MPN/100 ml 6% 30 MPN/100 ml 4% <15 MPN/100 ml 82% 15 MPN/100 ml 8% Fig. 7 - Percentuali dei campioni relative ai valori di E.coli secondo la norma UNI EN ISO 9308-3:2001 (metodo MPN) 14

Confronto dei metodi per E. coli Il confronto è stato impostato prima considerando l intero data set (n. 486 dati Fig. 8) e poi considerando le n. 47 coppie di dati ( Fig. 9 ) con valori superiori a 15 MPN/100 ml. Questa pulizia dei dati è stata fatta per vedere se, impostando la regressione solo sui dati maggiormente significativi per entrambi i metodi, la correlazione migliorava, anche se la numerosità si è ridotta del 90%. 1000 Escherichia Coli APAT CNR IRSA 7030F (UFC/100 ml) 900 800 700 600 500 400 300 200 100 y = mx+b y = 0.636x + 0.925 coeff. di correlazione R = 0.964 test t-accoppiato t = 2.658 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 UNI EN ISO 9308-3:2001 ( MPN/100 ml) Fig. 8 - E.coli APAT CNR IRSA 7030F vs E.coli UNI EN ISO 9308-3:2001 considerando l intero data set Per valori di MPN <15/100 ml è stato introdotto il valore convenzionale: 1 La pendenza della retta di regressione si presenta inferiore ad 1 evidenziando cioè che il metodo MPN fornisce una stima di E.coli più elevata rispetto ai valori di E.coli metodo APAT CNR IRSA 7030F Come riportato, per il confronto del metodo MPN per E.coli con il parametro Coliformi fecali (Fig. 11), il valore più elevato ottenuto con metodo MPN può essere attribuito al fatto che esso viene ricavato attraverso un calcolo statistico oppure perché il terreno di coltura indicato dal metodo APAT è più selettivo. L analisi dei dati mediante il test-t al 99% restituisce: t calc 2.66 > t 99% 2.58 con infiniti gradi di libertà. 15

Viene pertanto respinta l ipotesi iniziale (ipotesi zero) per cui la differenza è significativa e quindi i due gruppi non sono statisticamente correlati e le serie appartengono a popolazioni differenti. APAT CNR IRSA 7030F (UFC/100 ml) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Escherichia coli 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 UNI EN ISO 9308-3:2001 (MPN/100 ml) y = mx+b y = 0.632x + 3.402 coeff. di correlazione R = 0.959 test t-accoppiato t = 2.780 Fig. 9 - E.coli APAT CNR IRSA 7030F vs E.coli UNI EN ISO 9308-3 considerando n.47 dati significativi In questo grafico sono riportati i risultati con valore superiore alla soglia di sensibilità del metodo (15 MPN/100 ml). Si è voluto verificare se si otteneva una migliore correlazione poiché per valori MPN <15/100 ml era stato introdotto un valore convenzionale di 1. La pendenza della retta di regressione si presenta inferiore ad 1, in linea con il valore di Fig. 8, evidenziando cioè che il metodo MPN fornisce una stima di E.coli più elevata rispetto ai valori di E.coli metodo APAT CNR IRSA 7030F L analisi dei dati mediante il test-t al 99% restituisce: t calc 2.78 > t 99% 2.68 con 50 gradi di libertà Il valore di t ottenuto supera di poco il valore tabellare al 99% di probabilità. Non si accetta pertanto l'ipotesi zero per cui la differenza è significativa e quindi i due gruppi non si possono considerare statisticamente correlati. 16

Confronto tra E. coli e Coliformi fecali metodo membrane filtranti Coliformi fecali (UFC/100 ml) 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 E.coli vs Coliformi fecali 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 E.coli APAT CNR IRSA 7030F (UFC/100 ml) y = mx+b y = 0.947x + 2.708 coeff. di correlazione R = 0.750 test t-accoppiato t= 1.632 Fig. 10 - E.coli APAT CNR IRSA 7030F vs Coliformi fecali considerando n. 780 campioni La pendenza della retta di regressione si presenta prossima ad 1 indicando significativa correlazione tra i due parametri in esame; valutazione avvalorata dall analisi dei dati mediante il test-t al 95% che restituisce: t calc 1.63 < t 95% 1.96 con infiniti gradi di libertà viene quindi accettata l'ipotesi zero per cui la differenza tra le serie di dati non è significativa e quindi i due gruppi sono statisticamente correlati. Il valore dell intercetta della retta di regressione di 2.71 è in linea con il concetto che i Coliformi fecali includono, oltre ad una netta predominanza di E.coli, anche una piccola frazione di coliformi termotolleranti di origine fecale (Klebsiella pneumonie, Enterobacter cloacae, ). 17

Confronto tra E.coli MPN e Coliformi fecali Coliformi fecali (UFC/100ml) 700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 E.coli vs Coliformi fecali 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 E.coli UNI EN ISO 9308-3:2001 (MPN/100 ml) y=mx+b y = 0.472x + 3.820 coeff. di correlazione R= 0.887 test t-accoppiato t= 1.501 Fig. 11- E. coli UNI EN ISO 9308-3:2001 vs Coliformi fecali considerando n. 486 campioni Per valori di MPN <15/100 ml è stato introdotto il valore convenzionale: 1 La pendenza della retta di regressione si presenta inferiore ad 1 evidenziando cioè che il metodo MPN fornisce una stima di E.coli più elevata rispetto ai valori di Coliformi fecali. Il valore più elevato ottenuto con metodo MPN può essere attribuito al fatto che esso viene ricavato attraverso un calcolo statistico oppure perché il terreno di coltura per la ricerca di Coliformi fecali è più selettivo. L analisi dei dati mediante il test-t al 95% restituisce: t calc 1.50 < t 95% 1.96 con infiniti gradi di libertà Si accetta pertanto l'ipotesi zero per cui la differenza non è significativa e quindi i due gruppi sono statisticamente correlati. 18

Confronto tra Enterococchi e Streptococchi metodo membrane filtranti Enterococchi intestinali vs Streptococchi fecali Streptococchi fecali (UFC/100 ml) 200 150 100 50 0 0 100 200 Enterococchi intestinali (UFC/100 ml) y = mx+b y = 0.995x + 0.022 coeff. correlazione R = 0.997 test t-accoppiato t = 0.074 Fig. 12 - Enterococchi vs Streptococchi considerando n. 780 campioni Il valore della pendenza della retta di regressione prossimo ad uno ed il valore dell intercetta della retta di regressione prossimo allo zero indicano che i due metodi hanno risposto, secondo le aspettative, in modo simile. L utilizzo del terreno Bile Aesculina Azide Agar per la prova di conferma degli Enterococchi non introduce nessuna variazione significativa. Dall'analisi dei dati si evince che il valore del t-calcolato confrontato con il valore di t-tabellare al 95% per un test a due code risulta: t calc 0.074 < t 95% 1.96 con infiniti gradi di libertà. La correlazione viene pertanto considerata significativa in quanto viene accettata l'ipotesi zero per cui la differenza delle medie delle due serie non è significativa. I due gruppi sono quindi statisticamente correlati. Il metodo per la ricerca di Enterococchi intestinali differisce da quello per la ricerca di Streptococchi fecali solo per le prove di conferma. Si è scelto quindi di utilizzare la membrana filtrante ricavata da un unica filtrazione del campione per entrambe le prove di conferma. Con questa scelta viene eliminato l errore introdotto dalla variabilità microbiologica del campione. 19

4. CONCLUSIONI Quando in campo sperimentale si testa la correlazione tra due metodi con il calcolo della regressione lineare e il t di Student accoppiato ci si aspetta che la retta di regressione lineare y = mx + b tra le serie di dati abbia l intercetta (b) quanto più vicina a zero, la pendenza (m) vicina ad 1 ed il coefficiente di correlazione R tendente ad 1, nonché un t di Student che avvalori i risultati della regressione e la verifica dell ipotesi nulla H 0. 4.1 CONSIDERAZIONI SUI RISULTATI DEL MARE DI ROVIGO E DI VENEZIA Le serie dei parametri microbiologici Escherichia coli (con entrambi i metodi) contro Coliformi fecali non risultano tra loro correlate mentre le serie dei parametri Enterococchi intestinali contro Streptococchi fecali hanno soddisfatto in parte le aspettative di correlazione. Il fatto che tutte le cinque serie di dati (E.coli MPN, E.coli UFC, Enterococchi intestinali, Streptococchi fecali e Coliformi fecali) contengano elevata prevalenza (oltre 50%) di campioni con valore uguale a zero non consente di valutare la bontà delle metodiche su un ampio range di risultati. I due metodi APAT e UNI EN ISO per E.coli (Fig. 2 e 3) non manifestano correlazione, il metodo UNI EN ISO tende a sovrastimare la presenza batterica rispetto al metodo di filtrazione su membrana. Questo può essere dovuto alla maggiore selettività del terreno di coltura TBX utilizzato seguendo il metodo APAT. Il metodo APAT risulta più sensibile alle basse concentrazioni batteriche permettendo il conteggio anche di una sola colonia, mentre la soglia minima di rilevabilità del metodo UNI EN ISO è pari a 15 MPN/100 ml, quindi concentrazioni batteriche inferiori (da 0 a 14) vengono raggruppate nel valore <15 MPN/100 ml. Anche l analisi delle serie di dati di E.coli ottenute con i metodi APAT CNR IRSA 7030 F Man 29:2003 e UNI EN ISO 9308-3:2001 messe a confronto con la serie di dati dei Coliformi fecali (Fig. 4 e 5) evidenzia la mancata correlazione. La pendenza della retta di regressione anche in questo caso evidenzia una stima maggiore dei risultati ottenuti con metodo MPN e ciò porta a concludere che, complessivamente, tale metodo tende a fornire risultati più elevati. Risultati statisticamente non soddisfacenti sono stati ottenuti dal confronto tra il parametro E.coli metodo APAT CNR IRSA 7030F Man 29: 2003 (metodo membrane filtranti) ed il parametro 20

Coliformi fecali (metodo membrane filtranti). Tale considerazione è sostenuta dal valore della pendenza della retta di regressione prossima < 1. Le serie di dati riguardanti il parametro Enterococchi intestinali (metodo UNI EN ISO 7899-2:2003) e quelle dei dati del parametro Streptococchi fecali (metodo secondo il D.P.R. 470/82) hanno soddisfatto in parte le aspettative di correlazione (Fig.6). 4.2 CONSIDERAZIONI SUI RISULTATI DEL LAGO DI GARDA Parametro Escherichia coli: Mettendo a confronto le serie dei dati per il parametro E.coli secondo i metodi APAT CNR IRSA 7030F Man 29:2003 (MF) e UNI EN ISO 9308-3:2001 (MPN) si può notare che il coefficiente di correlazione è prossimo al valore uno ma l analisi dei dati mediante il test t, seppur per poco, evidenzia che le serie dei dati appartengono a popolazioni differenti (Fig. 8 e Fig. 9). Come prima considerazione possiamo concludere che il metodo UNI EN ISO 9308-3:2001 (MPN) tende a fornire una stima di E.coli più elevata rispetto al metodo APAT CNR IRSA 7030 F Man 29:2003 (MF). Dall analisi dei risultati microbiologici per il parametro E.coli, ottenuti con i metodi APAT CNR IRSA 7030 F Man 29:2003 (metodo membrane filtranti-mf) ed UNI EN ISO 9308-3:2001 (metodo MPN), messi a confronto con i risultati del parametro Coliformi fecali previsto dal D.P.R. 470/82 si evidenzia (Fig. 10 e Fig. 11) che tali metodi sono statisticamente correlati. Si può comunque notare una stima maggiore per i risultati di E.coli ottenuti con metodo MPN confrontati con quelli relativi al parametro Coliformi fecali (metodo MF). Dai risultati ottenuti per E. coli (metodo MF) confrontati con i Coliformi fecali (metodo MF) emerge che la correlazione è buona e la leggera sovrastima per Coliformi fecali, valore di intercetta 2.71, è da attribuire al fatto che il parametro Coliformi fecali include prevalentemente E.coli ed una frazione minima di altri coliformi fecali (Klebsiella pneumonie, Enterobacter cloacae, ). La tendenza generale del metodo MPN a fornire stime più elevate può essere attribuito al fatto che il risultato, espresso come MPN, si basa su un calcolo statistico. Altro importante aspetto da tenere in considerazione riguarda la composizione dei due terreni di coltura utilizzati che si differenziano per la presenza di diversi agenti selettivi. E scientificamente riconosciuto che i sali biliari presenti nel terreno TBX (APAT - MF) determinano una sottostima del parametro E.coli. Alla luce di queste considerazioni si può concludere che il metodo MF tende a sottostimare mentre il metodo MPN fornisce un dato più preciso. 21

Le due procedure sperimentate per la ricerca di E.coli (MPN e MF) richiedono tempi analitici molto differenti. Il metodo MPN necessita infatti di molte fasi preparatorie ed è stato stimato un tempo medio di circa 15 minuti a campione. Il metodo APAT CNR IRSA 7030F Man 29:2003 non prevede invece nessuna fase di allestimento del test ed un tempo medio di circa 2 minuti per l esecuzione del test (Tab. 1). Con queste considerazioni risulta preferibile, nonostante la tendenza alla sottostima del dato, l applicazione del metodo APAT CNR IRSA 7030 F Man 29:2003 (MF) che comunque bene correla con la ricerca di Coliformi fecali (MF). Parametro Enterococchi intestinali: Per quanto riguarda la sperimentazione ai fini del confronto tra la serie di dati riguardanti il parametro Enterococchi intestinali (metodo UNI EN ISO 7899-2:2003) e quella dei dati del parametro Streptococchi fecali (metodo secondo il D.P.R. 470/82) i risultati ottenuti hanno ampiamente soddisfatto le aspettative di correlazione (Fig. 12). 22

CONSIDERAZIONI FINALI GENERALI Le due procedure sperimentate per la ricerca di E.coli (MPN e MF) richiedono tempi analitici molto differenti. Il metodo MPN necessita infatti di molte fasi preparatorie: portare in soluzione il diluente D.S.M. (Diluente Speciale per Micropiastre) liofilizzato, allestirlo nelle provette, autoclavare ed infine preparare le provette per le diluizioni. Nel caso di acque di mare la diluizione 1/2 è preparata con acqua distillata e la diluizione 1/20 col il D.S.M; per le acque dolci entrambe le diluizioni richiedono esclusivamente l utilizzo del diluente. È stato stimato un tempo medio di circa 15 minuti a campione che comprende tutte le fasi suddette fino all inoculo della rispettiva micropiastra. Il metodo APAT CNR IRSA 7030F Man 29: 2003 non prevede invece nessuna fase di allestimento del test e un tempo medio di circa 2 minuti per l esecuzione del test (Tab. 1). Anche i tempi per la lettura sono diversi: da 36 h per il metodo UNI EN ISO alle 24 h del metodo APAT. Inoltre il paragrafo riguardante lo scopo ed il campo di applicazione della norma UNI EN ISO 9308-3:2001 specifica che il metodo non è adatto per acqua potabile e per altri tipi di acque per cui il valore guida è meno di 15 conte per 100 ml. Questa indicazione potrebbe costituire un limite all applicabilità di tale metodo considerando l elevata percentuale dei dati ottenuti con valori inferiori a 15 MPN/100 ml (mare: 75% - Fig. 1; lago: 82% - Fig. 7). Possiamo concludere che per il monitoraggio delle acque destinate alla balneazione: sia preferibile utilizzare il metodo APAT (MF), malgrado la tendenza alla sottostima del dato, per l'identificazione ed il conteggio di Escherichia coli in quanto più pratico (Tab. 1) e più sensibile alle basse concentrazioni batteriche. Tale metodo permette il conteggio anche di una sola colonia, mentre la soglia minima di rilevabilità del metodo UNI EN ISO è pari a 15 MPN/100 ml, quindi concentrazioni batteriche inferiori (da 0 a 14) vengono raggruppate nel valore <15 MPN/100 ml. Se l esigenza è attenersi ai metodi indicati dalla Direttiva 2006/7/CE, il metodo MPN per la ricerca di E.coli risulta molto più pratico e veloce nel fornire un risultato rispetto al metodo delle membrane filtranti, norma UNI EN ISO 9308-1:2002, sperimentato durante la campagna di balneazione 2006. Si ricorda inoltre che il metodo UNI EN ISO 9308-1:2002 è molto complesso per quanto riguarda l esecuzione delle prove di conferma. Inoltre presenta limiti imputabili a scarsa selettività del substrato per crescita di batteri interferenti, già dimostrato da più autori, e la prova di conferma tradizionale relativa alla produzione di indolo, sempre secondo la letteratura scientifica, non sembra essere sufficiente per 23

discriminare la specie E.coli mentre una più esatta e rapida interpretazione del risultato viene fornita con la prova di idrolisi del MUG. il confronto tra le serie di dati riguardanti il parametro Enterococchi intestinali (metodo UNI EN ISO 7899-2:2003) ed il parametro Streptococchi fecali (metodo secondo il D.P.R. 470/82) ha soddisfatto, per la sperimentazione sulle acque di mare, in parte le aspettative di correlazione (Fig.6). Tuttavia per acque con basse concentrazioni batteriche, condizione più frequente, possono essere due metodiche equivalenti. Per quanto riguarda invece la sperimentazione sulle acque del lago di Garda i risultati hanno ampiamente soddisfatto le aspettative di correlazione (Fig. 12). Poiché i due metodi sperimentati si differenziano unicamente per la prova di conferma, nel caso del lago di Garda, si è scelto di sperimentare la parte analitica relativa alle prove di conferma utilizzando le colonie cresciute sulla membrana filtrante derivata da un unica filtrazione del campione; eliminando quindi l errore introdotto dalla variabilità microbiologica del campione stesso. per un buon confronto tra metodi è auspicabile che i metodi vengano confrontati sull intero intervallo di applicazione ed in particolare su valori prossimi ai limiti di legge. 24

Tab. 1 Riassunto per il confronto tra i due metodi per l analisi di E.coli UNI EN ISO 9308-3 :2001 APAT CNR IRSA 7030 F MAN 29: 2003 PRINCIPIO DEL METODO CAMPO DI APPLICAZIONE I FASE ANALITICA II FASE ANALITICA: CONFERME TEMPI PER L ELABORAZIONE DEL DATO ANALITICO TEMPI DI ALLESTIMENTO ED ESECUZIONE DEL TEST SENSIBILITÀ DEL METODO COSTI DEL MATERIALE PROBLEMATICHE ANALITICHE MPN (Most Probabile Number) MF (Membrane filtranti) Il metodo si applica a tutti i tipi di Il metodo si applica per le acque acque superficiali dolci - salmastre e superficiali dolci o marine e per reflue, particolarmente a quelle le acque reflue anche sottoposte a ricche di materia in sospensione. trattamento Laboriosa : allestimento diluizioni Semplice: filtrazione diretta del scalari campione Nessuna prova di conferma Nessuna prova di conferma richiesta richiesta Minimo 36- massimo 72 ore (dopo le 36 ore la lettura può essere fatta in qualsiasi momento). L incubazione 24 ore, non necessita di conferme può essere prolungata nei fine settimana senza problemi Stimati circa 15 minuti a campione tra preparazione tubi per le diluizioni Stimati circa 2 minuti ed inoculo pozzetti della micropiastra. <15 MPN/100 ml 0 UFC/100 ml Minimi :1 euro per Elevati: 8 euro per determinazione determinazione La regione Toscana ha sperimentato il metodo per le acque marine ed ha segnalato possibili interferenze da La metodica analitica non organismi marini autoctoni: presenta problematiche tecnicoanalitiche. componente eterotrofa (batteri) o autotrofa (fitoplancton) con sovrastima del dato. 25

COMPONENTI SELETTIVI TERRENO DI COLTURA ANALOGIA TRA LE METODICHE Sali biliari. Il terreno di coltura risulta molto selettivo Salicina e Triton x 100 determinando una sottostima del dato. Entrambi i metodi si basano sul rilevamento dell attività β- glucoronidasica evidenziabile dall idrolisi di β-glucoronidi con rilascio di composti cromogeni (MF) o fluorescenti (MPN) BIBLIOGRAFIA BARONE E. ET AL. 2007 - Attendibilità di Metodi utilizzati per la determinazione di coliformi ed E. coli in acque da destinare al consumo umano - Biologia Ambientale, 21 (1): 37-42, Reggio Emilia MELLEY A. IOZZELLI M. 2002 Controllo e tutela delle acque costiere in Toscana. Regione Toscana- ARPAT, Firenze, 70pp MELLEY A. 2004 La sperimentazione in Toscana sulla proposta di Direttiva Europea per le acque di balneazione.- estratto da La Toscana Regione Mediterranea: conferenza straordinaria sull ambiente marino e costiero, Portoferraio 28-30 ottobre 2004 Regione Toscana-ARPAT, 27 pp APAT IRSA-CNR 2003 Metodi analitici per le acque Manuale e linee guida Vol.3 sez. 7030 29/2003. MILLER J.C., MILLER J.N. 1988 -Statistics for analitical chemistry Second edition. SOLIANI L. et al.2007 Manuale di statistica per la ricerca e la professione - statistica univariata e bivariata, parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche - www.dsa.unipr.it\soliani\soliani 26

RIFERIMENTI Iozzelli, Melley Studio sperimentale sulla nuova direttiva europea per le acque di balneazione Edifir, 2004 APAT IRSA CNR Metodi analitici per le acque Manuale e linee guida Vol. 3, 29/2003 UNI 6807-72 Metodi statistici per il controllo della qualità. Confronto fra due serie di dati appaiati. Significatività della differenza da zero della media delle serie di differenze. UNI EN ISO 9308-3 Qualità dell acqua. Ricerca ed enumerazione di Escherichia coli e batteri coliformi. Metodo miniaturizzato (Numero Più Probabile) per la ricerca ed enumerazione di Escherichia coli in acque superficiali e reflue Bonadonna e M. Ottaviani Rapporti ISTISAN 07/5 Metodi analitici di riferimento per le acque destinate al consumo umano ai sensi del DL.vo 31/2001. Metodi microbiologici 27