Processi di decadimento degli stati elettronici eccitati: Descrizione generale dei processi di decadimento Emissione di Fluorescenza Intersystem Crossing e Fosforescenza Internal Conversion. 1
Diagramma di Jablonski k jl =costante di velocità per il processo j riferito allo stato L (unità di misura s -1 ) IC= Conversione Interna r= decadimento radiativo nr= decadimento non radiativo Fluorescenza: Emissione da stati di singoletto elettronico Fosforescenza: Emissione da stati di tripletto elettronico Luminescenza: termine generico usato indifferentemente per qualsiasi stato elettronico. 2
Decadimento dallo stato di singoletto: Fluorescenza Il decadimento accompagnato da emissione di fotoni viene descritto nella teoria di Einstein da due processi: emissione stimolata, la cui probabilità per unità di tempo è proporzionale a B eg ρ(ν), e emissione spontanea, proporzionale al termine A eg e e hν hν B eg ρ(ν ) g A eg g A temperatura ambiente, per transazioni nel UV-Visibile, quando la popolazione di stato eccitato è piccola rispetto a quella di stato fondamentale, il processo di emissione stimolata è trascurabile se confrontato con l emissione spontanea. In queste condizioni il processo di fluorescenza è dominato dall emissione spontanea. 3
Emissione di Fluorescenza risolta in lunghezza d onda L emissione di fluorescenza dipende dagli stessi parametri molecolari da cui dipende l assorbimento dal momento che, per la teoria di Einstein: 3 3 8πhν n A eg = B 3 ge Bge µ c eg 2 Per quanto concerne la parte elettronica perciò valgono le stesse considerazioni fatte nel caso dell assorbimento. Sono permesse solo quelle transizioni per cui: d Ψ ˆ * τ finµ Ψ Dove lo stato iniziale è uno stato elettronico eccitato e lo stato finale è lo stato elettronico fondamentale. ini 2 4
L emissione di fluorescenza Origina da stati di singoletto elettronico. Ha efficienza non trascurabile solo per lo stato di singoletto elettronico di più bassa energia, mentre per tutti gli altri stati di singoletto elettronico vengono favoriti i processi che coinvolgono decadimenti non-radiativi. All interno dello stato di singoletto elettronico di più bassa energia, anche se si eccita uno stato vibronico di alta energia si ha rilassamento non radiativo verso il livello più basso di energia vibrazionale, da cui ha luogo il processo di emissione. 5
Spettro di assorbimento e fluorescenza Zn-tetrafenilporfirina in tetraidrofutrano S 2 S 2 Gli spettri sono normalizzati a 1 rispetto al massimo di assorbimento/emissione della banda dovuta alla transizione dal singoletto S 1. S 1 6
Influenza della struttura vibrazionale dello stato elettronico fondamentale: Anche per il processo di emissione si applica l approssimazione di Franck-Condon, ovvero si considerano transizioni verticali (freccia verde) che partono dalla posizione di equilibrio dello stato vibrazionale di più bassa energia dello stato elettronico eccitato ed arrivano a tutti i livelli vibrazionali dello stato elettronico fondamentale. Se i due minimi delle curve di energia potenziale non coincidono, si osserva una progressione di bande nello spettro di emissione, simile a quella osservata per lo spettro di assorbimento, ma a differenza dell assorbimento, la spaziatura tra le bande riflette le frequenze di vibrazione dello stato elettronico fondamentale. 7
Esempio 2,0 1,5 356.2 375.4 Antracene in etanolo assorbimento fluorescenza Intensita' (a.u.) 1,0 0,5 323.5 339 379 400 423 309.2 448 0,0 300 400 500 lunghezza d' onda (nm) ν 8
Per la maggior parte dei cromofori che hanno bassa simmetria, la banda di fluorescenza presenta uno spettro allargato, da cui non si evincono informazioni sulla sottostruttura vibrazionale. O O -O O O 2Na+ Fluorescein CF 3 Coumarin 540A N O O Cl- (CH 3 CH 2 ) 2 N O N+(CH 2 CH 3 ) 2 COOH Rhodamine B 9
Mirror Symmetry Se si confronta lo spettro di assorbimento con quello di fluorescenza, si osserva che in taluni casi appaiono come l immagine speculare l uno dell altro. In realtà una vera immagine speculare si ottiene riportando gli spettri in funzione delle frequenze e tenendo conto della natura dei segnali misurati: l attenuazione del fascio in un caso, e l intensità di luce emessa in tutte le direzioni dal mezzo nell altro : ε ( ν ) ν µ fi 2 3 F ( ν ) ν µ fi 2 La presenza di mirror symmetry riflette il fatto che le progressioni vibrazionali sono analoghe tra stato fondamentale ed eccitato. Di conseguenza se le frequenze vibrazionali non cambiano, anche la struttura della molecola non si modifica sostanzialmente tra stato elettronico fondamentale e quello eccitato. 10
Fluorescence Quantum Yield (Resa quantica di fluorescenza) Si definisce resa quantica di fluorescenza il rapporto tra il numero di fotoni emessi dal sistema rispetto al numero di fotoni assorbiti. Φ = n n ph emessi ph assorbiti n ph emessi A eg = k S r 1 n ph assorbiti k S r 1 + k S1 IC + k ISC = k TOT Φ = n n ph emessi ph assorbiti = k k S r 1 TOT Varia tra 0 e 1 11
Schema di uno spettrometro di fluorescenza reticolo specchio reticolo sorgente λ emi fenditura λ exc specchio lenti fenditura Detector Tubo fotomoltiplicatore campione 12
Spettro di Emissione di Fluorescenza: Si eccita il campione a una λ exc fissa e si misura l intensità di fluorescenza in funzione di λ emi. Si ottengono gli spettri di fluorescenza descritti nelle precedenti slides. λ exc e λ emi Spettro di Eccitazione di Fluorescenza: g 13 Si mantiene fissa la lunghezza di emissione λ emi e si misura l intensità di fluorescenza in funzione λ exc. Se nel campione è presente una sola specie che assorbe ed emette lo spettro di eccitazione di fluorescenza è analogo allo spettro di assorbimento. E utile per campioni che presentano forte diffusione della luce, per i quali non si può misurare uno spettro di assorbimento. λ exc λ emi e g 13
Spettro di Emissione ed eccitazione di Fluorescenza: Spettro di emissione di fluorescenza e di eccitazione di fluorescenza del 9-metilantracene Intensità (a.u.) Se si confronta questa immagine con quella dell antracene nella slide 8 si nota che lo spettro di eccitazione di fluorescenza è analogo a quello di assorbimento. Nelle misure di eccitazione di fluorescenza è molto importante correggere il segnale per l intensità di emissione della lampada alle diverse frequenza di eccitazione. Nelle misure di emissione di fluorescenza è importante correggere il segnale rispetto alla risposta spettrale del rivelatore e degli elementi ottici (lenti e reticolo di emissione) che raccolgono la fluorescenza. 14
Spettro di Emissione ed eccitazione di Fluorescenza: coralli http://www.advancedaquarist.com/2006/9/aafeature 15
Fluorescenza risolta nel tempo: Si eccita il campione con una sorgente di r.e.m. impulsata. Le molecole generate nello stato eccitato decadono nel tempo. L emissione di fluorescenza avrà luogo fino a quando c è popolazione nello stato elettronico eccitato. Si misura l intensità delle fluorescenza I(τ) in funzione del ritardo τ tra l applicazione dell impulso di r.e.m. e il momento in cui il detector misura la fluorescenza stessa. I n ( τ ) = (0) exp( τ τ ) flu ( τ ) n ( τ ) e e n e L intensità di fluorescenza per un insieme di molecole presenta un decadimento esponenziale il cui tempo caratteristico (tempo di vita di e) è uguale all inverso della somma di tutte le costanti di velocità caratteristiche del decadimento dallo stato eccitato. e τ e = 1 k e TOT 16
Fluorescenza risolta nel tempo: Tempi caratteristici: 10 ps-10 ns 17
Processi di decadimento non radiativo o conversione interna: Coinvolgono la trasformazione dell eccitazione vibronica in calore. Il rilassamento di energia trasferisce quanti di energia vibrazionale all introno fino a che si raggiunge l equilibrio termico. Si distinguono due processi: (i) rilassamento vibrazionale all interno di uno stesso stato elettronico (tempo caratteristico di decine di ps) e (ii) processi in cui, grazie alla sovrapposizione tra funzioni d onda vibrazionali di stati elettronici differenti (ad es. fondamentale ed eccitato), si ha rilassamento non radiativo tra stati elettronici diversi (da decine di ps a decine di ns) (i) (ii) e e 18
Processo di Intersystem Crossing e Fosforescenza: S n T 1 S 0 Il processo di intersystem crossing e la fosforescenza prevedono il passaggio del sistema da una configurazione elettronica di singoletto ad una di tripletto 19
Processo di Intersystem Crossing (ISC)e Fosforescenza: Iprocesso di ISC e fosforescenza sono resi possibili dalla presenza di accoppiamento spinorbita per le funzioni mono-elettroniche. Da un punto di vista classico l energia di interazione V int di un momento di dipolo magnetico con un campo di induzione magnetica è descritta: V int r = μ M r H Per un elettrone il momento magnetico viene identificato col momento magnetico di spin e il campo di induzione magnetica è quello generato dal moto orbitalico dell elettrone: E int r r r r r E v = μs Horb Horb = c Dove E è il campo elettrico associato al moto dell elettrone e v la sua velocità. Per una carica puntiforme (elettrone) il campo generato dipende dalla distanza r dalla carica stessa: r r E = K el r 20
La costante K el dipende a sua volta dal tipo di orbitale in cui si trova l elettrone e dalla carica del nucleo cui l elettrone è associato. Sostituendo nell espressione per l energia di interazione si ha: E int r K r r r ( ) = ( ) = l r el Kel r v μ r p μ Kel r = μs S S c c cm Dove l è il momento orbitale angolare associato al moto dell elettrone. Passando dall espressione classica all espressione quantomeccanica il termine che descive l energia di interazione spin-orbita e quindi la possibilità di mescolare stati a molteplicità diversa è dato da: Ĥ SO = J SO La costante di accoppiamento J SO ha le seguenti proprietà: per un dato orbitale atomico aumenta all aumentare della carica Z del nucleo in una molecola, il suo valore dipende principalmente dall atomo che ha valore di Z più elevato per molecole contenenti solo atomi della prima riga del sistema periodico (molecole organiche) è molto piccolo. μˆ S lˆ e 21
Inoltre, per poter avere interazione spinorbita è necessario che il momento totale rimanga invariato, per cui se si ha una variazione di un fattore uno nel momento totale di spin (ad esempio da singoletto a tripletto, è necessario avere un analoga e opposta variazione del momento angolare orbitalico. 22
Il mescolamento di stati elettronici con spin totale diverso dipende dall energia di interazione spin-orbita tra questi stati: d r d s * Ψ T m ( r,s)ĥsoψsn ( r, s) e dalla distanza in energia tra gli stati T m e S n considerati. Per cui sarà più probabile avere accoppiamento spin-orbita tra stati di singoletto e tripletto eccitati che tra gli stati di tripletto eccitati e lo stato elettronico fondamentale. La possibilità di avere un interazione non nulla tra le configurazioni elettroniche di tripletto e singoletto fa si che gli stati elettronici reali siano dati dal mescolamento di più configurazioni elettroniche, anche con molteplicità di spin diverso. Grazie a questo è possibile avere sia processi che danno luogo a Intesrsystem crossing non radiativo, promosso da sovrapposizione tra le funzioni d onda vibrazionali dei due stati, sia processi di decadimento radiativo attraverso emissione di un fotone: fosforescenza. La fosforescenza è tanto più probabile, quanto più distanti energicamente sono i due stati. 23
Intersystem Crossing: L efficienza di intersystem crossing dallo stato di singoletto di più bassa energia allo stato di tripletto di più bassa energia viene definita come: Φ ISC = N n T ph assorbiti n T è il numero di molecole eccitate che dallo stato di singoletto decadono allo stato di tripletto, ed N ph assorbiti è il numero di fotoni assorbiti. n T Φ ISC k ISC N nt = = N( ph ass) ph assorbiti k S R 1 k k + k S R 1 ISC S1 IC + k + k S1 IC ISC + k ISC
Fosforescenza: Il processo di fosforescenza coinvolge l emissione radiativa dallo stato elettronico di tripletto eccitato di più bassa energia allo stato di singoletto fondamentale. Poiché lo stato di tripletto eccitato si trova a energia più bassa dello stato di singoletto eccitato, la fosforescenza cadrà a enregie (lunghezze d onda) inferiori (maggiori) rispetto alla fluorescenza. e (S=1) ISC T (S=3) Intensità (a.u.) Assorbimento Fluorescenza Fosforescenza λ exc g (S=1) ν λ(nm)
Fosforescenza: Esempi di fosforescenza per molecole organiche aromatiche a T=77K. A temperatura ambiente il decadimento dallo stato di tripletto è dominato da processi non raditivi. L aggiunta di bromo aumenta notevolmente il processo di ISC e la resa quantica di fosforescenza.
Fosforescenza: Esempi di molecole che danno fosforescenza o fluorescenza ritardata (fluorescenza emessa a tempi lunghi per ripopolamento dello stato di singoletto dallo stato di tripletto) Eosin B Erythrosin Rose Bengal Emission (a.u.) 520 600 680 760 nm
Tempi di decadimento per i diversi stati eccitati S n τ Sn ~ 10 fs-10ps S 1 T 1 pump t ISC ~ 1-100 ns τ S1 ~ 1-10ns τ T1 ~ 100 ns-10ms Verde: Fluorescenza S 0 t = 0 τ vib ~ 1-10 ps Viola: Fosforescenza 28
Green Fluorescing Protein GFP is a protein extracted from the jellyfish Aequorea Victoria. Its fluorescent properties arise from the presence of a fluorophore placed inside the proteic structure, and well protected from external agents that can induce fluorescence quenching. 29
The fluorophore, inside the proteins, forms spontaneously when the protein folds, without any help from enzyme activity. The final fluorophore displays and extended double bond deloclayzed system, coupled with electron-donor and electron-acceptor groups, that shifts absorption in the visible. 30