XXIX Scuola Annuale di Bioingegneria. Bressanone, 13-17 settembre 2010 Francesca Ceroni Biotecnologie tradizionali 1) DNA ricombinante 2) PCR 3) Sequenziamento automatizzato Biologia Sintetica 4) Approccio ingegneristico Bressanone GNB 2010 1
Overview 1) Programma Genetico 2) Clonaggio molecolare 3) Implementazione in cellule 4) Analisi della funzionalità Il programma genetico Un insieme di parti genetiche assemblate fra loro che introdotte nella cellula realizzano un circuito genetico con una funzione di interesse. funzione Cellula Bressanone GNB 2010 2
Le componenti del programma genetico - Geni - Promotori - Sequenze RBS - Terminatori - sirna/mirna/riboswitch - Plasmide Il plasmide Cellula Bressanone GNB 2010 3
Costruzione delle parti biologiche 1) Costruzione de-novo attraverso sintesi chimica 2) Costruzione mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) Parte Biologica Reazione a catena della polimerasi (PCR) T di melting 95 C dei primers 72 C Melting Annealing Extending Bressanone GNB 2010 4
T di melting 95 C dei primers 72 C Melting Annealing Extending Primo Ciclo Secondo Ciclo Terzo Ciclo Overview 1) Programma Genetico 2) Clonaggio molecolare 3) Implementazione in cellule 4) Analisi della funzionalità Bressanone GNB 2010 5
Clonaggio molecolare Insieme dei passaggi sperimentali per la realizzazione del programma genetico Clonaggio molecolare Bressanone GNB 2010 6
Clonaggio molecolare a) Reazione di Digestione b) Isolamento dei frammenti di DNA: elettroforesi su gel c) Reazione di Ligazione d) Trasformazione di cellule batteriche e) Selezione delle colonie Clonaggio molecolare a) Reazione di Digestione b) Isolamento dei frammenti di DNA: elettroforesi su gel c) Reazione di Ligazione d) Trasformazione di cellule batteriche e) Selezione delle colonie Bressanone GNB 2010 7
Enzimi di Restrizione Endonucleasi sito-specifiche in grado di tagliare una sequenza di DNA Sticky ends Blunt ends Sito di Restrizione Reazione di digestione DNA + Enzima Bressanone GNB 2010 8
Clonaggio molecolare a) Reazione di Digestione b) Isolamento dei frammenti di DNA: elettroforesi su gel c) Reazione di Ligazione d) Trasformazione di cellule batteriche e) Selezione delle colonie Elettroforesi su gel Si caricano i campioni nei pozzetti si applica il potenziale Bressanone GNB 2010 9
Verifica e analisi della corsa su gel Transilluminatore DNA ladder Campioni Clonaggio molecolare a) Reazione di Digestione b) Isolamento dei frammenti di DNA: elettroforesi su gel c) Reazione di Ligazione d) Trasformazione di cellule batteriche e) Selezione delle colonie Bressanone GNB 2010 10
Reazione di ligazione Ligasi Clonaggio molecolare a) Reazione di Digestione b) Isolamento dei frammenti di DNA: elettroforesi su gel c) Reazione di Ligazione d) Trasformazione di cellule batteriche e) Selezione delle colonie Bressanone GNB 2010 11
Trasformazione batterica: Shock Termico Batteri - Ca 2+ + ligazione 30 min in ghiaccio Ca 2+ Ca 2+ Shock termico 1 min a 42 C Ca 2+ Ca 2+ 2 min in ghiaccio cellula 1 h a 37 C in agitazione Clonaggio molecolare a) Reazione di Digestione b) Isolamento dei frammenti di DNA: elettroforesi su gel c) Reazione di Ligazione d) Trasformazione di cellule batteriche e) Selezione delle colonie Bressanone GNB 2010 12
Selezione delle colonie Si piastrano i batteri Si lascia O/N a 37 C E necessario procedere allo screening del prodotto di ligazione Overview 1) Programma Genetico 2) Clonaggio molecolare 3) Implementazione in cellule 4) Analisi della funzionalità Bressanone GNB 2010 13
Organismo di studio Nucleo Membrana plasmatica Citoplasma Citoplasma DNA DNA Parete cellulare Eucarioti Procarioti Implementazione del programma nelle cellule Bressanone GNB 2010 14
Overview 1) Programma Genetico 2) Clonaggio molecolare 3) Implementazione in cellule 4) Analisi della funzionalità Proteine Fluorescenti come Reporter GFP λex 501 nm P romotore RBS GFP RBS Gene 1 λem 511 nm Utilizzo di Tag di degradazione per lo studio del comportamento dinamico Cellula Bressanone GNB 2010 15
Microscopia in Fluorescenza Cellule batteriche Fluorescenza in singola cellula Fluorescenza media Analisi statica! Analisi dinamica della risposta a livello di singola cellula La microfluidica vuole consentire l analisi del comportamento dinamico dei circuiti genici a livello di singola cellula Figura tratta da: Bennett M, Hasty J. (2009). Nature Reviews Genetics, 10(9):628-38. Bressanone GNB 2010 16
Quanto altro? 1) Sviluppo di nuove tecnologie per l automazione 2) Cellula minima e Genoma minimo Università di Bologna Dip. di Elettronica, Informatica e Sistemistica (DEIS) Bressanone GNB 2010 17
ICM. Laboratorio di Ingegneria Cellulare e Molecolare per lo Studio dei Bionanosistemi. II Facoltà di Ingegneria Cesena Prof. Emanuele Giordano Dott.ssa Alice Pasini Ing. Simone Furini Bressanone GNB 2010 18
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Gel elettroforesi + EtBr Trasformazione Batterica : Elettroporazione Cuvetta Elettrodi Contatti Batteri+ ligazione www.wikipedia.org/wiki/elettroporazione Bressanone GNB 2010 20
Implementazione in cellule batteriche Trasformazione Implementazione in cellule eucariote Trasfezione Trasfezione Metodi Chimici Fisici Liposomi Elettroporazione Bressanone GNB 2010 21
Citometria a Flusso http://missinglink.ucsf.edu Espressione Stabile Bressanone GNB 2010 22
Analisi dinamica della risposta a livello di singola cellula Figura tratta da: Ryley, J. & Pereira-Smith, O. M.. Yeast 23, 1065 1073 (2006). La Biologia Sintetica una definizione? è un nuovo approccio per rendere più facile l ingegnerizzazione della biologia (D.Endy) Bressanone GNB 2010 23