Applicazione della tecnologia Chip ad analisi di interesse biologico e forense

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1 Applicazione della tecnologia Chip ad analisi di interesse biologico e forense

2 CHIP/Q-TOF

3 1 Impostare la pompa 2 3 Selezionare Operate 4 Il sistema è pronto

4 Analisi di Apolipoproteine estratte da plasma umano di soggetti sani e pazienti con cardiopatie e diabete

5 Le lipoproteine ad alta densità (HDL) proteggono le pareti delle arterie dal progredire dell arteriosclerosi. Questo effetto protettivo è da attribuirsi principalmente all abilità delle HDL di rimuovere l eccesso di colesterolo dai macrofagi presenti nelle arterie. L apolipoproteina A-I (Apo A-I) è la più abbondante tra tutte le HDL (circa 70%) ed è stata dimostrata la sua capacità nel rimuovere il colesterolo e i fosfolipidi cellulari attraverso processi di trasporto mediati da una proteina di membrana chiamata ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1). Stress ossidativo e altri stati patologici possono modificare la struttura dell Apo A-I con conseguente sua diversa attività.

6 Lo scopo di questo lavoro preliminare è mettere in evidenza modificazioni proteiche legate soprattutto a fenomeni ossidativi. Sono state analizzate le frazioni di apolipoproteine ottenute da plasmi di : - 1 soggetto sano con elevati valori di HDL; - 3 soggetti sani con valori normali di HDL; - 3 pazienti diabetici; - 3 pazienti infartuati di età inferiore a 40 anni.

7 Intens. [a.u.] La separazione della frazione di apolipropoteine è stata effettuata tramite ultracentifugazione sequenziale. L ottenimento della frazione di HDL, purificata dalle altre proteine plasmatiche, è stata controllata con la spettrometria di massa MALDI campioni APOA1 29_01_08\Bertazzo1a10 H2O 01%TFA _1\1SLin m/z

8 Analisi del digerito triptico della frazione plasmatica contenente Apo A-I Preparazione del campione: 5 mg di proteina estratta liofilizzata Diluizione in 60 di ml NH 4 CO 3 (ph 8.5) + Tripsina (1:40) Iniezione: 1 ml in HPLC-CHIP MS

9 Metodica cromatografica: Enrichment column: Zorbax 300SB-C18, 40 nl, 5 mm Analytical column: Zorbax 300SB-C18, 75mm x 43 mm, 5 mm Loading flow rate: 4 ml/min Loading mobile phase: H 2 O + 3% acetonitrile Injection volume: 1 ml CHIP flow rate: 400 nl/min Mobile phase: A: H 2 O + 0.1% HCOOH B: CH 3 CN % HCOOH Minuti %B Condizioni ESI: VCap: 1900 V Fragmentor: 170 V Gas temperature: 325 C Drying gas: 5 L/min

10 Separazione cromatografica del digerito triptico di APO A-1 standard Iniettato 1ul di digerito triptico 8,3ng di APO A1 cioè <300 fentomoli

11 Esempio di cromatogramma ottenuto del digerito triptico della frazione di apolipoproteine di plasma di un paziente diabetico

12 m/z Rt1 Rt2 Rt3 Rt4 Rt5 Rt medio STD dev Deviazione standard <0.05 per tutti i peptidi

13 Esempio di modificazioni proteiche osservate nei pazienti diabetici 1) Peptide [ ] WQEEMELYR Modificato M [136] % peptide ossidato nel paziente diabetico: 70% % peptide ossidato nel soggetto sano: 0%

14 WQEEM(Ox)ELYR b 2 NH 3 [M+2H -H 2 O O] 2+ y 7 b 2 y 3 y 5 y 8 HH y6 3 y 9

15 2) Peptide [ ]: KWQEEM(Ox)ELY(NO 2 )RQK % peptide ossidato nel paziente diabetico: 60% % peptide ossidato nel soggetto sano: 0%

16 Esempio di modificazioni proteiche osservate nei pazienti infartuati 1) Peptide [37-47]: DLATVY(NO 2 )DVLK % peptide nitrato nel paziente infartuato: 100% %peptide nitrato nel soggetto sano: 0%

17 2) Peptide [ ]: VQPY(NO 2 )LDDFQKK % peptide nitrato nel paziente infartuato: 100% %peptide nitrato nel soggetto sano: 0%

18 Tabella preliminare riassuntiva delle modificazioni osservate nei pazienti analizzati Table 2: Modified peptides found in tryptic digest of lipoprotein plasma fractions. Peptide m/z of [M+2H] 2+ Healthy subjects Diabetic patients Heart stroke Patients Ipo- Patients WQEEM(Ox)ELYR [ ] DLATVY(NO 2 )DVLK [37-47] VQPY(NO 2 )LDDFQKK [ ] KWQEEM(Ox)ELY(NO 2 )RQK [ ] QEM(Ox)SKDLEEVK [ ] QEM(Ox)SKDLEEVKAK [ ] / 2/3 / / / / 3/3 / / / 2/3 / / 2/3 3/3 / / / 3/3 / / 3/3 1/3 /

19 Conclusioni I risultati preliminari ottenuti mostrano come nel caso di pazienti diabetici ed infartuati (con età inferiore ai 40 anni) siano presenti delle modificazioni dell Apo A-I. In particolare sono state notate l ossidazione della metionina e la nitrazione delle tirosina. Lo studio proseguirà con l aumento della numerosità dei pazienti e sulla separazione tramite cromatografia di immunoaffinità delle nitroapolipoproteine.

20 Metodo preliminare LC-CHIP/Q-TOF per la determinazione di xenobiotici in campioni di saliva

21 Table 1: Drugs and their metabolites under study Compound Analyte Formula MH + Class Cocaine benzoylecgonine (BZE) C16H19O4N cocaine (COC) C17H21O4N Acetylmorphine (6MAM) C19H21O4N morphine (MOR) C17H19O3N Opiates codeine (COD) C18H21O3N norbuprenorphine (NBUP) C25H35O4N buprenorphine (BUP) C29H41O4N methadone (MTD) C21H27O1N amphetamine (AMP) C9H13N methylendioxyamphetamine (MDA) C10H13O2N Amphetamines metamphetamine (MAMP) C10H15N methylendioxymetamphetamine (MDMA) C11H15O2N methylendioxyethylamphetamine (MDEA) C12H17O2N Anesthetics fluoxetine (FLU) C17H18ONF olanzapine (OLZ) C17H20N4S zopiclone (ZPC) C17H17O3N6Cl aminoclonazepam (7-ACLZP) C15H12ON3Cl zolpidem (ZPD) C19H21O1N aminoflunitrazepam (7-AFNTZ) C16H14ON3F bromazepam (BRZP) C14H10ON3Br Benzodiazepines oxazepam (OXZ) C15H11O2N2Cl lorazepam (LRZP) C15H10O2N2Cl alprazolam (ALPZ) C17H13N4Cl clonazepam (CLZP) C15H10O3N3Cl flunitrazepam (FNTZ) C16H12O3N3F nordiazepam (NDZ) C15H11ON2Cl diazepam (DIAZ) C16H13ON2Cl ketamine (K) C13H16ONCl Antidepressants venlafaxine (VEN) C17H27O2N amitriptyline (AMI) C20H23O

22 The collected OF (20 ml) were fortified with four solutions containing the 30 analytes (Table 1) at different concentrations (10 ng/ml, 20 ng/ml, 50 ng/ml and 100 ng/ml) and with Internal Standards (ISs). The OF fortified samples were extracted by SPE technique. 1 ml of the final solutions has been analyzed by LC-Chip/Q-TOF technique.

23 Metodica cromatografica: Enrichment column: Zorbax 300SB-C18, 40 nl, 5 mm Analytical column: Zorbax 300SB-C18, 75mm x 43 mm, 5 mm Loading flow rate: 4 ml/min Loading mobile phase: H 2 O + 3% acetonitrile Injection volume: 1 ml CHIP flow rate: 400 nl/min Mobile phase: A: H 2 O + Ammonium acetate 5 mm B: CH 3 CN % HCOOH Min. %B ESI conditions: VCap: 1750 V Fragmentor: 120 V Gas temperature: 325 C Drying gas: 5 L/min Reference masses: m/z m/z

24 AMP MDA MAMP MDMA MDEA MDPA (IS)

25 VEN COC 7-ACLZP 7-AFNTZ

26 BZE K MOR COD 6MAM ZPD BRZP NBUP BUP LRPZ BZE K MOR COD 6MAM ZPD BRZP NBUP BUP LRPZ OXZ CLZP FNTZ ALPZ NDZ AMI FLU DIAZ MTD ZPC OXZ CLZP FNTZ ALPZ NDZ AMI FLU DIAZ MTD ZPC BZE K MOR COD 6MAM ZPD BRZP NBUP BUP LRPZ BZE K MOR COD 6MAM ZPD BRZP NBUP BUP LRPZ OXZ CLZP FNTZ ALPZ NDZ AMI FLU DIAZ MTD ZPC OXZ CLZP FNTZ ALPZ NDZ AMI FLU DIAZ MTD ZPC

27 Area ratio y = x R 2 = y = x R 2 = y = x R 2 = BUP NDZ BZE Lineare (BZE) Lineare (NDZ) Lineare (BUP) [Analyte]/[IS]

28 THC-COOH THC-COOH-d 3 THC-d 3 THC

29 Conclusioni Dai risultati preliminari ottenuti la tecnologia LC- Chip/Q-TOF può essere applicata all analisi di xenobiotici, considerando che possono essere disponibili Chip con fase stazionaria specifica. Gli aspetti positivi di questa tecnica sono: piccola quantità di soluzione di analita (1 ml); tempo di analisi breve (18 min.); minimo consumo di solvente (4nL/min).

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