STUDIO 3D-QSAR PER INIBITORI DELLA CICLOOSSIGENASI-2 2 (COX-2): CONFORMAZIONI NEL SITO ATTIVO E MODELLAZIONE DELLA RISPOSTA FARMACOLOGICA.

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1 STUDIO 3D-QSAR PER IIBITORI DELLA CICLOOSSIGEASI-2 2 (COX-2): COFORMAZIOI EL SITO ATTIVO E MODELLAZIOE DELLA RISPOSTA FARMACOLOGICA. Sofia Cividini Stage: Bracco Imaging S.p.a Milano

2 Premesse L elevata specificità di riconoscimento e di interazione tra le diverse molecole, all interno di sistemi molto complessi come le cellule, è ciò che rende possibile l attuarsi dei complicati meccanismi biochimici che stanno alla base della vita degli organismi viventi. Per questo motivo, anche nella ricerca e nella progettazione di nuovi farmaci, il poter predire quali siano le modalità e l affinità di binding di un certo ligando nei confronti di una proteina target, come un enzima od un recettore, diventa il presupposto fondamentale per ottenere dei composti biologicamente attivi e per stabilire delle relazioni tra attività e struttura molecolare.

3 Premesse Per riuscire a capire nel dettaglio quali siano le basi energetiche dell interazione tra una proteina ed un certo composto, che potrebbe rappresentare un potenziale farmaco, è indispensabile conoscere in primo luogo la struttura tridimensionale (3D) del complesso proteina-ligando. La struttura 3D di un complesso proteina-ligando viene in genere risolta attraverso tecniche sperimentali come la cristallografia a raggi-x o la MR. In questi ultimi anni però si stanno sviluppando sempre di più anche metodologie informatiche che si pongono come possibile alternativa alle metodiche sperimentali tradizionali viste sopra nel tentativo di riuscire a predire la struttura tridimensionale di questi complessi. Queste metodologie nel loro insieme prendono il nome di molecular docking.

4 Molecular Docking L output di un tipico algoritmo di docking consiste in una lista di complessi proteina-ligando che sono ordinati e classificati per mezzo di una data funzione di scoring. Lo scopo di ogni funzione di scoring è quello di riuscire ad identificare la corretta modalità di legame tra ligando e recettore, andando a misurare l affinità di binding del complesso ligando-recettore stesso per lo più attraverso una funzione di energia libera di legame. Le funzioni di scoring rappresentano un po il punto debole degli algoritmi di docking perché: non esiste una funzione di scoring che abbia sempre il suo ottimo globale in accordo con l ottimo sperimentale non esistono attualmente algoritmi di ottimizzazione sufficientemente veloci per trovare l ottimo globale per una data funzione di scoring

5 FlexX FlexX è un programma completamente automatizzato per il docking molecolare, prende in considerazione la flessibilità del ligando, è veloce nell analizzare anche data set di molecole di medie o grandi dimensioni e dà risultati di posizionamento abbastanza soddisfacenti se confrontati con i risultati sperimentali. FlexX rappresenta un algoritmo per il posizionamento dei frammenti molecolari all interno del sito attivo di un recettore (pose clustering modificato) e si basa sul principio della costruzione incrementale. La costruzione incrementale consiste tipicamente di tre fasi: Selezione del frammento base (automatizzata) Posizionamento del frammento base all interno del sito attivo della proteina Costruzione del complesso

6 Scoring Function di FlexX La scoring function che FlexX utilizza per calcolare l energia libera del binding tra il ligando ed il recettore, è una leggera modifica della funzione empirica dell energia libera introdotta da Böhm. In FlexX, quindi, l energia di binding per un complesso ligando-recettore è stimata come la somma dei contributi di energia libera che derivano dal numero dei legami ruotabili nel ligando, dai legami idrogeno, dalle interazioni tra coppie ioniche, dalle interazioni idrofobiche dei gruppi aromatici e dalle interazioni lipofiliche. G ( R, α ) + G f ( R, α ) + G f ( R, α ) + G f ( R) = G0 + Grot rot + Ghb f io aro lipo * neutralh bonds ionicint aro.int lipo. cont

7 Farmaci anti-infiammatori non steroidei I classici farmaci antiinfiammatori non steroidei (SAIDs), usati nel trattamento dell infiammazione, del dolore e della febbre, hanno tutti la caratteristica di avere notevoli effetti collaterali a livello della mucosa gastrointestinale e dei reni. Agiscono attraverso l inibizione dell enzima prostaglandina-h 2 - sintasi, anche noto come cicloossigenasi (COX), che catalizza la conversione dell acido arachidonico in prostaglandina H 2. Attualmente sono note due isoforme di questo enzima: COX-1 e COX-2.

8 Cicloossigenasi-2 (COX-2) COX-1 rappresenta la forma espressa costitutivamente nella maggior parte dei tessuti ed è responsabile della produzione di prostaglandine (PG) citoprotettive soprattutto a livello della mucosa gastrointestinale e dei reni. COX-2 viene indotta selettivamente da diversi fattori come citochinine pro-infiammatorie (IL-1), fattori di crescita (TFα) ed endotossine. Facilita il rilascio delle prostaglandine coinvolte nel processo infiammatorio. La specificità degli inibitori selettivi di COX-2 nei confronti di questo enzima è dovuta soprattutto alla sostituzione della Ile523 presente in COX-1 con una Val in COX-2 che allarga di circa il 25% il sito di binding dell enzima.

9 Struttura tridimensionale di COX-2

10 Scopo della ricerca Lo scopo della nostra ricerca è stato quello di riuscire a trovare dei modelli quantitativi che fossero in grado di stabilire una relazione funzionale tra la struttura delle molecole di inibitori selettivi per l enzima cicloossigenasi-2 (COX-2) e la loro attività farmacologica di inibizione. A tale proposito, quindi, sono state utilizzate le metodologie di: docking molecolare 3D-QSAR

11 Data set di analisi Sono state analizzate complessivamente le strutture di 49 molecole di inibitori della cicloossigenasi-2, appartenenti a 19 famiglie e sub-famiglie diverse. Come misura dell attività farmacologica (variabile dipendente) è stato usato il log1/ic 50 espresso in µm. Questo valore è stato determinato in vitro e rappresenta la concentrazione del composto a cui l attività dell enzima viene ridotta del 50%.

12 Dataset di strutture di inibitori di COX-2 A.1 A.2 B.1 B.2 R 4 R 4 B.3 B.4 C D.1 R2 D.2 E.1 E.2 F R1 R 4 n= (CH 2 )n

13 Dataset di strutture di inibitori di COX-2 G H I J.1 O S S J.2 K L S R3 " R 4

14 Metodiche di selezione delle migliori conformazioni per il 3D-QSAR Avendo a disposizione la struttura 3D dell enzima COX-2 con il ligando SC-558 co-cristallizzato, la selezione delle migliori conformazioni da usare per la costruzione dei modelli quantitativi 3D-QSAR, è stata condotta con particolare accuratezza utilizzando la metodologia del docking molecolare con il software FlexX per la maggior parte degli inibitori in studio. Per gli inibitori c-5-1j, c-5-1h, d2-20p, f-34, f-30, f-38, g-29, j1-26, j1-10b, j2-33, j2-34, k-6b, in seguito a problemi legati alla natura del software FlexX, è stato invece necessario condurre una ricerca conformazionale con Sybyl direttamente all interno del sito di binding dell enzima in modo da simulare una sorta di docking, utilizzando il ligando SC-558 del raggio- X come riferimento per il posizionamento delle molecole stesse.

15 Docking molecolare PREPARAZIOE DELLA STRUTTURA DEL RECETTORE E DEL LIGADO el processo di preparazione della struttura recettoreligando vengono neutralizzate le catene laterali che non si trovano nel sito di binding del recettore e che non formano ponti salini. el processo di rifinimento invece viene attuata una minimizzazione ristretta del complesso co-cristallizato per riorientare i gruppi idrossilici delle catene laterali ed alleviare i possibili clashes sterici.

16 Docking molecolare PREPARAZIOE DELLE MOLECOLE DI IIBITORI DI COX-2 Le 49 molecole di inibitori selettivi di COX-2 sono state dapprima disegnate e poi sottoposte a minimizzazione: utilizzando il campo di forza Tripos ed il metodo di Powell (parametri standard) settando a 0.05 kcal/mol*ǻ il parametro di convergenza dell energia a gradiente usando un numero di iterazioni variabile da 1000 a 3000 le cariche atomiche parziali necessarie per il calcolo dell energia di interazione elettrostatica sono state calcolate con il metodo di Gastaiger-Huckel.

17 Docking molecolare CAMPIOAMETO DELLE GEOMETRIE DI ITERAZIOE CO FLEXX Il campionamento delle geometrie di interazione consiste nell esplorazione delle conformazioni e degli orientamenti del ligando che consentono di ottenere la migliore interazione con il sito del recettore. Il campionamento è stato eseguito utilizzando 7 database contenenti rispettivamente le molecole delle seguenti famiglie: Pirrolici Imidazolici Ciclopentenici Benzenici Pirazolici Spiroeptenici, Spiroeptadienici, Isoxazoli, Tiofeni Classe J1, Classe J2, Classe K, Classe L

18 Docking molecolare CAMPIOAMETO DELLE GEOMETRIE DI ITERAZIOE CO FLEXX Fatta eccezione per le molecole viste in precedenza per cui non è stato possibile ottenere un complesso ligandorecettore con l uso di FlexX, per le restanti molecole il numero di conformazioni che si collocavano all interno del sito attivo dell enzima variava da un minimo di 1 ad un massimo di 30. Per ciascuna di queste conformazioni sono state calcolate le seguenti scoring functions che rappresentano l affinità di binding tra enzima ed inibitore: G-Score PMF-Score D-Score Chem-Score F-Score

19 Scoring function ChemScore La funzione di scoring ChemScore è stata quella che ha permesso di selezionare le conformazioni che hanno dato luogo al nostro miglior modello quantitativo struttura-attività a 6 variabili. Include termini per: i legami idrogeno le interazioni metallo-ligando i contatti lipofilici l entropia rotazionale, con un termine intercetta.

20 Ricerca conformazionale con Sybyl Per le molecole c-5-1j, c-5-1h, d2-20p, f-34, f-30, f-38, g-29, j1-26, j1-10b, j2-33, j2-34, k-6b, è stato utilizzato il protocollo di ricerca conformazionale presente in Sybyl, il quale permette di campionare tutti gli angoli torsionali energeticamente accessibili. Con questa metodica il numero delle conformazioni generate era molto alto per cui è stato necessario eseguire una procedura di filtraggio per ridurne il numero. Anche per queste conformazioni sono quindi state calcolate le scoring functions elencate in precedenza.

21 Descrittori molecolari per 3D-QSAR Per il calcolo dei descrittori molecolari (variabili indipendenti) è stato utilizzato il software Dragon, sviluppato dal gruppo di ricerca del Prof. Todeschini. Per tutte le conformazioni ottenute sono stati quindi calcolati i seguenti descrittori molecolari 3D che sono dipendenti dalla conformazione della molecola, ma sono indipendenti dai suoi movimenti roto-traslazionali: Randic molecular profiles RDF descriptors WHIM descriptors Geometrical descriptors 3D-MoRSE descriptors GETAWAY descriptors G-Score PMF-Score D-Score ChemScore F-Score

22 Creazione dei data set di conformazioni per il 3D-QSAR Sono stati creati 5 dataset contenenti ognuno 49 conformazioni molecolari, una per ciascun tipo di molecola considerata. Ogni data set rappresenta una funzione di scoring e contiene, per ogni tipo molecolare, la conformazione che meglio rappresenta l affinità di binding del complesso ligandorecettore per quella determinata funzione scelta. In ogni data set poi sono stati riportati tutti i descrittori 3D calcolati con Dragon più la funzione di scoring specifica per quel data set (variabili indipendenti) ed il log1/ic 50 (variabile dipendente), che rappresenta l attività di inibizione di COX-2 da parte degli inibitori considerati, per un totale di 722 variabili.

23 Modelli di regressione lineare multipla. Prima di sottoporre i nostri data set all analisi di 3D-QSAR, è stata eseguita una procedura di filtraggio per rimuovere eventuali ridondanze che avrebbero potuto aggravare il costo del calcolo senza apportare informazione utile. In questo modo il numero dei descrittori è stato ridotto ad un massimo di 388. Per stabilire una relazione funzionale di tipo quantitativo tra i nostri descrittori (variabili indipendenti) e il log1/ic 50 (variabile dipendente) è stato utilizzato un programma che si basa su di un algoritmo genetico e che usa un metodo di regressione lineare multipla. Sono quindi stati calcolati i 10 migliori modelli da 1 a 6 variabili.

24 RISULTATI I migliori modelli a 6 variabili Modello Variabili Selezionate Q 2 Loo % % ChemScore SHP2, RDF015p, Mor20u, Mor26u, G3s, R3m G-Score SHP2, RDF015p, Mor20u, Mor26u, G3s, HATS4m F-Score G(..O), RDF105u, RDF100m, RDF025e, Mor20u, Mor29e D-Score G(..O), Mor20u, Mor12v, Mor17e, E3v Gs PMF-Score SHP2, G(..O), RDF030e, Mor12p, Gs, R3v

25 Coefficienti del modello ChemScore Modello ChemScore Variabili: SHP2, RDF015p, Mor20u, Mor26u, G3s, R3m oggetti: 49 descrittori: 359 Intercetta b1 b2 b3 b4 b5 b

26 Validazione del modello ChemScore con il metodo Leave-more-out M odello ChemScore: validazione con il metodo Leavemore-out 74 73,5 73 Q2 (%) 72, , , % perturbazione

27 COCLUSIOI Il modello ChemScore a 6 variabili ha dimostrato di avere : una capacità di predizione piuttosto significativa pari al 73.4% una resistenza piuttosto buona alle eventuali perturbazioni introdotte sull insieme dei dati utilizzati, dal momento che con una perturbazione del 30%, si è avuto un calo solo del 2.2% nella capacità di predizione (71.2%) rispetto al modello non perturbato.