Casistica Recenti Prog Med 2011; 102: Importanza della diagnosi molecolare nel riconoscimento delle alfa talassemie. Descrizione di un caso

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1 302 Casistica Recenti Prog Med 2011; 102: Importanza della diagnosi molecolare nel riconoscimento delle alfa talassemie. Descrizione di un caso Domenico Dell Edera 1, Antonio Malvasi 4, Andrea Tinelli 3, Eleonora Mazzone 1, Manuela Leo 1, Vito Monti 1, Annunziata Anna Epifania 2 Riassunto. Con il termine di alfa talassemie si intendono quei disordini ereditari dell emoglobina causati da ridotta o assente sintesi delle catene globiniche alfa. Il presente lavoro mette in evidenza come in presenza di una alfa2- Tal (-α/αα), denominata silente, la diagnosi biochimica risulta essere insufficiente. In questi casi, lo studio molecolare dei geni alfa globinici è necessario per la sua identificazione. A ragione di ciò, presentiamo il seguente caso clinico. È pervenuta alla nostra osservazione una donna di 29 anni, gravida alla 12 a settimana, per sottoporsi al test di screening prenatale per la sindrome di Down e di Edwards (bitest). Dall anamnesi effettuata alla coppia, si evinceva che entrambi presentavano indici ematologici dubbi: il signor T.G. presentava un quadro biochimico correlato ad alfa1-tal (MCV 58,8fl, MCH 19,8pg, HbA2: 1,9, HbF:0,4, globuli rossi 6,58x10 6 /ul ed Hb 13g/dl), che è stato confermato dall analisi molecolare (genotipo alfa Kb ). Particolari difficoltà interpretative ha presentato la paziente C.F. che aveva un fenotipo biochimico borderline (MCV 79,8fl, MCH 27,2pg, HbA2: 2.9, HbF: 0.6, globuli rossi 5,11x10 6 /ul, Hb 12,8 g/dl). Solo l analisi molecolare ha rilevato con certezza che la signora C.F. risultava essere fenotipicamente alfa2-tal (-α/αα) per la presenza della mutazione alfa2 init.cd(t>c) NcoI. Nell eventualità, come nel nostro caso, che vi sia una coppia in cui un coniuge risulta alfa2-tal (-α/αα) e l altro alfa1-tal (--/αα), occorre informare la coppia circa la possibilità di concepire un nascituro con emoglobinosi H (HbH). Lungi dagli autori l idea di sottoporre a diagnosi prenatale coppie a rischio di generare bambini con HbH; invece, va sottolineata l importanza di un attento studio dei parametri ematologici e una capillare e precisa informazione circa le implicazioni cliniche legate alle complicanze delle alfa talassemie. Parole chiave. Alfa talassemia, α2-tal, α1-tal, HbH, Hb Bart s. Summary. Importance of the molecular diagnosis in the screening of alpha-thalassemia. The term alpha thalassemia refers to inherited disorders of hemoglobin caused by reduced or absent synthesis of alpha globin chains. This paper highlights that in the presence of a alfa2-tal (-α/αα), called the silent, the biochemical diagnosis turns out to be insufficient. In these cases, the molecular study of alpha-globin genes is necessary for identification. In reason of this we present the following case report. A woman of 29 years, pregnant at 12 a weeks, arrived at our observation to undergo prenatal screening test for Down and Edwards syndromes (bitest). The medical history of the couple revealed that both had doubts haematological indices: Mr. T.G. had a biochemical framework related to alpha1-tal (MCV 58.8fl, MCH 19.8pg, HbA2: 1.9, HbF:0.4, erythrocytes 6.58x10 6 /ul ed Hb 13g/dl), which was confirmed by molecular analysis (genotype alfa Kb ). Particular difficulties of interpretation presented the C.F. patient who had a biochemical phenotype border line (MCV 79.8fl, MCH 27.2pg, HbA2: 2.9, HbF: 0.6, erythrocytes 5.11x10 6 /ul, Hb 12.8 g/dl). Only molecular analysis has found with certainty that Mrs. C.F. appeared to be phenotypically alpha2-tal (-α/αα) for the presence of the mutation alfa2 init.cd(t>c) NcoI. In the event, as in our case, there is a couple where one spouse is alpha2-tal (-α/αα) and the other alpha1-tal (--/αα), must have to inform the couple about the possibility of conceiving a child with hemoglobin H (HbH). Far from the authors refer to the idea of prenatal diagnosis for couples at risk to bear children with HbH, but it is worth highlighting the importance of a careful study of the blood parameters and an extensive and precise information about the clinical implications related to complications of alpha thalassemia. Key words. Alpha-thalassemia, α2-tal, α1-tal, HbH, Hb Bart s. Introduzione Le alfa talassemie sono causate da alterazioni genetiche a carico dei geni deputati alla produzione delle catene alfa dell emoglobina. Per quanto attiene la trasmissione familiare a seconda se si ha la compromissione di un gene o di due geni alfa si parlerà di α + (genotipo: -α/αα) o α 0 (--/αα, o -α/-α) 1. Tale difetto si tradurrà in parziale o del tutto assente sintesi delle catene α globiniche. Dalle varie combinazioni di questi due quadri genici α 0 e α + si hanno i quattro fenotipi dell alfa talassemia: HbH, Hb Bart s, α2 Talassemia (α2 TAL), α1 Talassemia (α1 TAL) 2,3. La malattia da HbH è caratterizzata da un deficit di sintesi di alfa catene molto marcato. La sintesi di catene alfa non riesce a saturare le catene beta in eccesso le quali si legano formando il tetramero β4 (HbH), molto instabile, che precipita nell eritrocita (corpi di Heinz). 1 Laboratorio di Genetica Medica; 2 Laboratorio di Patologia Clinica ed Analisi di Laboratorio, Presidio Ospedaliero Madonna delle Grazie, Matera; 3 Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia, Presidio Ospedaliero Vito Fazzi, Lecce; 4 Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia, Clinica Santa Maria, Bari. Pervenuto il 24 marzo 2011.

2 D. Dell Edera et al.: Importanza della diagnosi molecolare nel riconoscimento delle alfa talassemie. Descrizione di un caso 303 La malattia da HbH è la forma clinicamente di tipo intermedio dell alfa talassemia e geneticamente deriva dalla doppia eterozigosi α 0 /α + (--/-α). Delezione o mutazione di tutti e quattro i loci α costituisce la più grave forma di α-talassemia ed è associata ad idrope fetoplacentare 4. Non essendovi sintesi di catene α, il prodotto del concepimento non è vitale, è idropico e presenta solamente tetrameri γ 4 (Hb di Bart s) e β 4 (HbH). Geneticamente è una omozigosi α 0. La delezione o mutazione di due loci α (--/αα o - α/-α) porta come effetto fenotipo allo sviluppo della forma denominata α 1 -TAL. Il deficit di sintesi non è molto elevato da causare la malattia, trattasi, infatti di portatori sani. Il quadro ematologico è caratterizzato da anemia, microcitosi e ipocromia che sono però di grado lieve. Questa condizione è spesso scambiata con un deficit marziale e trattata in modo inappropriato con ferro. Lo stato di portatore silente deriva dalla delezione o mutazione di un solo gene α-globinico e come conseguenza fenotipico porta allo sviluppo della forma denominata α 2 -Tal (-α/αα) e non mostra alcun segno ematologico o clinico rilevabile. Questa ultima condizione viene il più delle volte misconosciuta a causa della normalità del quadro biochimico-ematologico. La diagnosi certa di α 2 - TAL richiede lo studio molecolare dei geni alfa globinici 5,6. L α 1 -TAL può essere sospettata in base alla diminuzione del volume corpuscolare medio (M.C.V.) e del contenuto medio di emoglobina (MCH) del globulo rosso; l HbA2 è normale o diminuita; anche in questo caso la diagnosi di certezza si può avere solamente dallo studio molecolare dei geni alfa globinici. La tabella 1 riassume l aspetto fenotipico delle varie forme di talassemia. Il presente lavoro vuole sottolineare come l individuazione di soggetti α 2 -Tal presenta particolari difficoltà interpretative valutando solamente il quadro biochimico-ematologico. Inoltre, l individuazione di coppie in cui un soggetto è α 2 -Tal e l altro α 1 -Tal, impone una corretta informazione circa il rischio concreto che tali coppie possano generare figli con emoglobinosi H. Materiali e metodi Su richiesta ginecologica è pervenuta alla nostra osservazione una donna di 29 anni, gravida alla 12 a settimana, per sottoporsi al test di screening prenatale del I trimestre per la sindrome di Down e di Edwards (bitest). Dall anamnesi effettuata alla coppia, si evinceva che i coniugi presentavano indici ematologici dubbi. Per i motivi suddetti si è proceduto alla ripetizione dei seguenti esami in entrambi i coniugi: studio della morfologia eritrocitaria su striscio a fresco; esame emocromocitometrico mediante analizzatore Sysmex XE 2100 (Dasit, Cornaredo, MI); valutazione delle frazioni emoglobiniche mediante sistema High-Pressure Liquid Chromatography (H.P.L.C.) Tosoh G7 [Tosoh Bioscience S.r.l., Rivoli (TO)]; dosaggio sideremia e ferritinemia. Inoltre, su entrambi i coniugi, si è proceduto allo studio dei geni α globinici e alla ricerca della mutazione δ + cod.27(g T) 7. Per far ciò sono stati utilizzati campioni di sangue raccolti in EDTA-K 3. L analisi molecolare eseguita comprendeva i seguenti passaggi: 1. Isolamento del DNA partendo da 25µl di sangue utilizzando kit di estrazione della Promega Italia S.r.l. (DNA IQ TM System, cod.c6701). 2. Amplificazione in multiplex delle sequenze di interesse per i geni α globinici. 3. Rilevazione degli amplificati mediante Ibridazione inversa non radioattiva su striscia : l amplificazione e l ibridazione inversa su striscia è stata ottenuta utilizzando il kit della Nuclear Laser Medicine (MI)(cod. AC028). Il test genetico è volto all accertamento della presenza di 21 diverse mutazioni nei geni α-globinici. Le mutazioni studiate sono elencate nella tabella Amplificazione, seguita da digestione enzimatica, per la ricerca della mutazione δ + cod.27(g T) (sostituzione di una singola base nel codone 27 del primo esone del gene δ). L enzima di restrizione utilizzato è il HaeIII (Bio- Labs- New England). Il prodotto così ottenuto viene sottoposto ad elettroforesi su gel di agarosio (3%) in tampone TAE 1X e colorazione con bromuro di etidio. 5. Amplificazione, seguita da digestione enzimatica per la ricerca della singola sostituzione nucleotidica nel codone d inizio del gene α: α2init.cd(t C)NcoI (mrna: codone di inizio AUG corrisponde sul DNA a TAC, se la C è sostituita da una T avremo che da TAC TAT; in questo modo l aminoacido metionina sarà sostituito dall isoleucina). L enzima di restrizione utilizzato è NcoI (BioLabs ñ New England). Il prodotto così ottenuto viene sottoposto ad elettroforesi su gel di agarosio (3%) in tampone TAE 1X e colorazione con bromuro di etidio. Tabella 1. Fenotipo Hb MCH MCV HbA 2 HbF HbH Hb Bart s alla nascita α 2 TAL N N N N % α 1 TAL N N N % M. da HbH -- pres % Hb Bart s IDROPE FETO-PLACENTARE N= normale

3 304 Recenti Progressi in Medicina, 102 (7-8), luglio-agosto 2011 Tabella 2. Posizione Mutazione Test strip A -3.7 Singola delezione -4.2 Singola delezione -20.5Kb Doppia delezione --MED Doppia delezione --SEA Doppia delezione --THAI Doppia delezione --FIL Doppia delezione α1 cd14 G>A α1 cd59 G>A Hb Adana Test strip B Anti-3.7 Triplicato a α2 int cd [T>C] α2 cd 19 [-G] α IVS 1 5nt α2 cd 59 [G>A] α2 cd 125 [T>C] (Hb Quong SZE) α2 cd 142 [T>C] (Hb Constant Spring) α2 cd 142 [T>A] (Hb Icaria) α2 cd 142 [A>T] (Hb Pakse) α2 cd 142 [A>C] (Hb Koya Dora) α2 poly A-1 [AATAAA>AATAAG] α2poly a-1 [AATAAA>AATGAA] Tabella 3. Indici ematologici del signor T.G. Esito Unità Valori di riferimento Eritrociti 6, /µl 4, Hb 13 g/dl 11,8 15,1 MCV 58,8 fl MCH 19,8 pg HbA 2 1,9 % < 3,0 HbF 0,4 % < 1,0 Sideremia 107 γ60 100% Ferritinemia 110 ng/ml donne: 6 81 uomini: Tabella 4. Indici ematologici del signora C.F.. Esito Unità Valori di riferimento Eritrociti 5, /µl 4,0 5,10 Hb 12,8 g/dl 11,8 15,1 MCV 79,8 fl MCH 27,2 pg HbA 2 2,9 % < 3,0 HbF 0,6 % < 1,0 Sideremia 96 γ60 100% Ferritinemia 290 ng/ml donne: 6 81 uomini: Risultati Gli indici ematologici del signor T.G. sono riportati nella tabella 3, mentre i valori ematologici della signora C.F. sono riportati nella tabella 4. Dall analisi molecolare dei geni α globinici, si evince (figura 1) che il signor T.G. risulta essere fenotipicamente α (--/αα) in quanto presenta una delezione 20.5Kb che determina la perdita di due geni, d altro canto la signora C.F. risulta essere fetonipicamente α + (- α/αα) in quanto presenta una singola sostituzione nucleotidica nel codone d inizio del gene α [α2 init.cd (T C)NcoI] che determina la perdita di un gene α ed un fenotipo α + (figura 2). Nelle figure 3 e 4 si riportano i risultati ottenuti delle amplificazioni seguite da digestione enzimatica con gli enzimi HaeIII per il gene δ e NocI per il gene α. Dalle corse elettroforetiche si deduce che entrambi i coniugi non presentano la mutazione δ + cod.27(g T) (figura 3). Per quanto riguarda la mutazione α2 init Cd(T C) NcoI si osserva, come già visto nella reverse dot blot, che il signor T.G. risulta negativo, mentre la signora C.F. presenta la mutazione (figura 4). Discussione Dall analisi dei dati si evince che il fenotipo del signor T.G. risulta essere di facile individuazione per le particolari caratteristiche ematologiche riscontrate (MCV, MCH, HbA 2 : 1,9, globuli rossi al di sopra della norma), le quali sono state confermate dall analisi molecolare, che ha messo in evidenza il genotipo α Kb associato al fenotipo biochimico α 1 -TAL. Difficoltà interpretative ha presentato la signora C.F. in quanto aveva un fenotipo biochimico borderline (MCV poco al di sotto della norma e MCH, HbA 2, HbF, globuli rossi ed emoglobina nella norma). Tale quadro risulta essere di difficile interpretazione alla luce della quasi normalità degli indici ematologici. La presenza di una modesta microcitosi, associata a frazioni emoglobiniche normali e alla presenza del marito con α 1 -TAL e al fatto che la signora era gravida alla 12 a settimana ci ha spinti ad attuare lo studio molecolare dei geni α globinici.

4 D. Dell Edera et al.: Importanza della diagnosi molecolare nel riconoscimento delle alfa talassemie. Descrizione di un caso 305 In questo modo siamo riusciti a rilevare che la suddetta risultava essere fetonipicamente α + detta anche α 2 -TAL (-α/αα) per la presenza della mutazione α2 init.cd (T C) NcoI che determina la perdita di un solo gene α. Solo un attento esame dei parametri ematologici, ponendo particolare attenzione all MCV, permette di evidenziare quelle forme di talassemia che, generalmente, rimarrebbero misconosciute. In questi casi la diagnosi molecolare risulta l unico mezzo in grado di riconoscerle. Conclusioni Figura 1. Dall analisi delle reverse dot blot si evince che il signor T.G. presenta una delezione di 20.5Kb che determina la perdita di due geni α ed un fenotipo α 0. Figura 2. Dall analisi delle reverse dot blot si evince che la signora C.F. presenta una singola sostituzione nucleotidica nel codone d inizio del gene α: α2init.cd (T C) NcoI che determina la perdita di un gene α ed un fenotipo α +. Il caso da noi descritto dimostra come, di fronte a soggetti α2-tal, il solo screening biochimico possa risultare insufficiente. L identificazione delle cosiddette forme silenti pone implicazioni cliniche ed etiche importanti per quanto riguarda l approccio alla diagnosi prenatale. Risulta indispensabile quindi una esatta individuazione del portatore sano, con successiva indagine approfondita nei riguardi del coniuge. Nell eventualità, come nel nostro caso, che vi sia una coppia in cui un coniuge risulta α 2 -TAL (-α/αα) e l altro α 1 -TAL (--/αα), occorre informare la coppia circa la possibilità di concepire un nascituro con emoglobinosi H. Lungi dagli autori l idea di sottoporre a diagnosi prenatale coppie a rischio di generare bambini con HbH; va sottolineata l importanza di un attento studio dei parametri ematologici e di una capillare e precisa informazione circa le implicazioni cliniche legate alle complicanze delle talassemie.

5 306 Recenti Progressi in Medicina, 102 (7-8), luglio-agosto Figura 3. tracciato elettroforetico ottenuto dopo amplificazione e digestione con enzima HeaIII per la ricerca della mutazione δ + cod.27 (G T). In presenza della mutazione l enzima HeaIII taglia il frammento amplificato in tre pezzi, in assenza della mutazione l enzima taglia il frammento in due pezzi. Pozzetti 1 e 4: Dna amplificato e digerito della signora C.F., assenza di mutazione nel gene δ (presenza di due bande elettroforetiche). Pozzetti 2 e 5: Dna amplificato e digerito del signor T.G., assenza di mutazione nel gene δ (presenza di due bande elettroforetiche). Pozzetti 3 e 6: Controllo positivo (presenza di tre bande elettroforetiche). Figura 4. tracciato elettroforetico ottenuto dopo amplificazione e digestione con enzima NocI per la ricerca della mutazione α2 init.cd (T C) NcoI. In presenza della mutazione l enzima NocI taglia il frammento amplificato in tre pezzi, in assenza della mutazione l enzima taglia il frammento in due pezzi. Pozzetto 1: Dna amplificato e digerito della signora C.F., presenza della mutazione α2 init.cd (T C) NcoI (presenza di tre bande elettroforetiche). Pozzetti 2, 3 e 4: Dna amplificato e digerito del signor T.G., assenza di mutazione α2 init.cd (T C) NcoI nel gene α (presenza di due bande elettroforetiche). A tal proposito, lo studio molecolare del difetto genetico ha permesso di individuare coppie a rischio per talassemia intermedia e di assumere una informazione più completa e corretta circa l eventuale nascita di un figlio affetto da HbH. Bibliografia 1. Harteveld CL, Higgs DR. Alpha Thalassaemia. Orphanet J Rare Dis 2010; 5: Pan LL, Eng HL, Kuo CY, Chen WJ, Huang HY. Usefulness of brilliant cresyl blue staining as an auxiliary method of screening for alpha-thalassemia. J Lab Clin Med 2005; 145: Liang ST, Wong VC, So WW, Ma HK, Chan V, Todd D. Homozygous alpha-thalassaemia: clinical presentation, diagnosis and management. A review of 46 cases. Br J Obstet Gynaecol 1985; 92: Petrou M, Brugiatelli M, Old J, et al. Alpha thalassaemia hydrops fetalis in the UK: the importance of screening pregnant women of Chinese, other South East Asian and Mediterranean extraction for alpha thalassaemia trait. Br J Obstet Gynaecol 1992; 99: Chui DH, Waye JS. Hydrops fetalis caused by alphathalassemia: an emerging health care problem. Blood 1998; 91: Higgs DR. A Review of the molecular genetics of the human globin gene cluster. Blood 1989; 73: Foglietta E, Deidda G, Graziani B, Modiano G. Detection of globin gene disorders by a simple PCR methodology. Haematologica 1996; 81: Indirizzo per la corrispondenza: Dott. Domenico Dell Edera Presidio Ospedaliero Madonna delle Grazie UOS Dipartimentale Laboratorio di Genetica Medica Via Montescaglioso Matera ducati98@libero.it.