CLASSICHE GENETICA BIOTECNOLOGIE MODERNE BIOLOGIA CELLULARE TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE INGEGNERIA GENETICA

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1 CLASSICHE BIOTECNOLOGIE GENETICA MODERNE BIOLOGIA CELLULARE TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE INGEGNERIA GENETICA BIOLOGIA MOLECOLARE BIOCHIMICA

2 CREAZIONE A FINI MEDICI DI MICRO-ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (MOGM) PIANTE O ANIMALI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM) CELLULE ANIMALI IN COLTURA E GENETICAMENTE MODIFICATE

3 Cellula batterica Duplicazione cellulare

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7 ESPERIMENTO DI CLONAGGIO Gene codificante per una proteina (di qualsiasi origine) Produzione di proteina ricombinante

8 mrna eucariotico trascrittasi inversa cdna

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11 PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI DI PRIMA GENERAZIONE Proteine identiche a quelle naturali INSULINA ERITOPOIETINA G-CSF FATTORI ANTIEMOFILICI VACCINI RICOMBINANTI DI SECONDA GENERAZIONE Proteine che sono state manipolate (muteine) VACCINI RICOMBINANTI tpa ANTICORPI

12 Biofarmaci o Farmaci proteici In un primo tempo solo come farmaci che replicano la funzione. La loro attività è uguale a quella naturale. Oppure come farmaci che bloccano la funzione (anticorpi, decoy receptors). Le proprietà farmacologiche non sono migliorate rispetto al prodotto naturale

13 PROTEINE RICOMBINANTI IN USO Insulina umana (diabete di tipo I) Ormone della crescita umano (nanismo) tpa Attivatore del plasminogeno (anticoagulante per il trattamento delle trombosi) Fattori della coagulazione (emofilia) Molecole antivirali (interferone) Interleuchine (stimolatori del sistema immunitario) Eritropoietina- EPO (anemie, doping)

14 PROINSULINA

15 INSULINA MATURA

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18 VACCINI RICOMBINANTI contro Epatite B Epatite C Meningococco Malaria (??) Colera Pertosse

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21 DNA ACTAGGCCTA TGATCCGGAT MUTAGENESI ACTAGCCCTA TGATCGGGAT proteina Ala Leu Gly Ala Glu Gly Gene codificante per una proteina (MODIFICATO) Produzione di proteina Ricombinante MODIFICATA

22 Mutagenesi oligonucleotide-diretta VACCINO PER LA PERTOSSE ATTIVATORE TISSUTALE DEL PLASMINOGENO

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25 Mutagenesi oligonucleotide-diretta INSULINA INSULINA Lys-Pro: inversione in posizioni 28 e 29 oppure mutazione Pro/Asp maggiore solubilità e minore formazione di polimeri. Altre mutazioni per causare precipitazione a ph neutro dopo iniezione per un rilascio graduale Insulina per via orale

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27 Mutagenesi oligonucleotide-diretta Cys-less IL-2 e INF-beta mutazioni Cys/Ser per diminuire le modificazioni ossidative e aumentarne la stabilità (in vivo e on-shelf stability) His- enriched G-CSF Introduzione di residui di His (neutri a ph >7.2 e protonati a ph inferiori) Diversa affinità per il recettore alla membrana o nell endosoma. (Trattamento di neutropenie)

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36 Mouse Chimeric Humanized

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38 ANTICORPI IN TERAPIA Blocco di interazioni ligando-recettore (p.e. HER2, estrogeni, TNF) Blocco di funzioni proteiche (p.e. oncogeni) Stimolo di segnalazione intracellulare (p.e. apoptosi) (sia anticorpi interi che frammenti) Reclutamento di componenti del sistema immunitario a seguito del binding (stimolo immunità cellulare) (anticorpi interi)

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42 Recettore della famiglia EGFR ANTICORPO Herceptin (Trastuzumab) Prima per la diagnostica poi Per la terapia

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44 Anticorpi monoclonali umani? Eticamente non fattibile (pericolosità ed invasività) Messa a punto di strategie per la produzione di Anticorpi Monoclonali Umani

45 Messa a punto di strategie per la produzione di Anticorpi Monoclonali Umani 1) Uso di topi transgenici nei quali i loci germinali delle immunoglobuline del topo sono stati sostituiti dai corrispondenti loci umani. Generazione di HMab con i metodi tradizionali dell ibridoma

46 1) Uso di topi transgenici nei quali i locus germinali delle immunoglobuline del topo sono stati sostituiti dai corrispondenti umani. Generazione di HMab con i metodi tradizionali dell ibridoma 2) Metodi per l espressione di frammenti anticorpali quali Fab o scfv di derivazione umana

47 scfv Single chain Fv Fab Antigen binding Antigen binding Fragment

48 (Gly 4 -Ser) 3

49 2) Metodi per l espressione di frammenti anticorpali quali Fab o scfv Tecnologia del phage display Viene imitata, in vitro, la generazione di grandi repertori di sequenze anticorpali e la successiva selezione clonale di anticorpi specifici LIBRARY SPECIFICHE O NAIVE

50 IN VIVO IN VITRO Library fagica di tutte le possibili combinazioni Selezione ed espansione con la tecnica del panning Produzione di uno specifico frammento anticorpale

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56 ANTIGENE

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60 PEG-ilated proteins

61 PEG-ilated proteins PEGylation increases the hydrodynamic radius of a biopharmaceutical and shields its surface towards the periphery. Thus the stability of these conjugates against proteases is increased, their immunogenicity is reduced and their renal excretion is decelerated. Consequently, PEGylation secures a prolonged half-life of the biopharmaceutical, reduces side effects and finally increases efficiency of the therapy.

62 Anticorpi e gene terapy In genere ScFv CIRCOLANTI: Secrezione di Ab da cellule geneticamente modificate, come cellule autologhe modificate ex-vivo o eterologhe incapsulate. INTRACELLULARI: Intrabodies, con sequenze di localizzazione al RER (peptide segnale e seq. SEKDEL), al nucleo (NLS), alla membrana interna (seq di farnesilazione) Down-regulation di oncogeni overespressi (ErbB-2, ciclina E) o di forme mutate (Ras, Src)

63 Library sintetiche Combinazione in vitro di V H e V L Mutazioni random delle CDR

64 MUTAZIONI RANDOM IN VITRO MOLECULAR EVOLUTION Allo scopo di Migliorare affinità proteina ligando (CDR di frammenti anticorpali) Aumentare la stabilità Cambiare la specificità di un enzima L analisi dei mutanti è la tappa più difficile (20 n possibilità! Per soli 7 residui = 1.2x10 9 possibili mutanti!). E possibile la mutazione di zone ciscoscritte di una proteina Tecnica di selezione più usata: phage display.

65 Error prone PCR ([Mn 2+ ] sbilanciamento dntp Analoghi di basi Oligonuclotidi mutati DNA shuffling

66 Fig.1 Mutazyme DNA Polymerase

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71 MUTAZIONI RANDOM IN VITRO MOLECULAR EVOLUTION Su anticorpi: Mutazioni delle CDRs per migliorare affinità e selettività Su altre proteine (WO/2008/040758) PEPTIDES WITH HIGH AFFINITY FOR THE PROLACTIN RECEPTOR FIELD OF THE INVENTION The present invention is related to variants of prolactin, which variants binds to the prolactin receptor with higher affinity as well as method for producing such variants. Such prolactin variant mutations may for instance be useful for producing prolactin antagonists for the treatment of breast cancer.

72 Prolactin antagonists in breast cancer therapy Prolactin (PRL) is a potent growth factor for mammary epithelium and PRL has been associated with the development and growth of breast tumours. Breast cancer cells often over-express the PRL receptor (PRL-R). For treatment of breast cancer it is useful a PRL antagonist in order to prevent binding of PRL to the PRL-R on the tumour. PRL binds two molecules of PRL-R through two regions of one molecule of PRL referred to as binding site 1 (BS1, high affinity ) and binding site 2 (BS2, low affinity). Variants of PRL solely able to bind via BS1 will have antagonistic properties.

73 MUTAZIONI RANDOM IN VITRO MOLECULAR EVOLUTION Mutante del TNF (proinfiammatorio) per avere un dominante negativo (DN) Non riconosce il recettore ma è capace di formare eterotrimeri con il TNF dell individuo Questi eterotrimeri sono incapaci di legarsi al recettore AZIONE ANTI-INFIAMMATORIA

74 Infliximab (Remicade) is a drug used to treat autoimmune diseases. It is a chimeric MAb and it has been approved by the U.S. Food and Drug Administration for the treatment of psoriasis, Crohn's disease, ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis, rheumatoid arthritis, sarcoidosis and ulcerative colitis. Adalimumab (brand name HUMIRA) is a humanized MAb

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