La proteina p53: struttura, funzioni e mutazioni

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1 , La proteina p53: struttura, funzioni e mutazioni F. FIDALE', L. VERDUN DI CANTOGN02, E. AROASIO', F. PECCHI03, D. LISCIN I Servizio di Laboratorio Analisi, Dipartimento di Oncologia,, Azienda USL TO l, TORINO 2 Sezione di Patologia Generale, Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperim.entale, Università degli Studi, TORINO 3 Servizio di Laboratorio Analisi, Azienda USL 6, VENERIA REALE (TO) 4 Servizio di Anatom.ia Patologica, Dipartimento di Oncologia, Azienda USL TO l, TORINO RIASSUNTO La p53 é sicuramente una delle proteine più studiate negli ultimi anni, a causa delle svariate ed importanti funzioni svolte nella cellula: controllo del ciclo cellulare, della sintesi e riparazione del DNA, della differenziazione e della morte cellulare programmata (apoptosi). Essa é quindi ben rappresentativa dell'attività dei prodotti dei geni oncosoppressori, che agiscono come una barriera fisiologica contro l'espansione clonale delle cellule. Nel presente articolo sono dapprima riportati i dati relativi agli studi cristallografici che hanno permesso di chiarire la struttura del core e del dominio di oligomerizzazione della p53: il primo costituisce infatti la porzione della molecola direttamente coinvolta nel legame con il DNA (a livello di una sequenza di consenso), mentre il secondo permette la tetramerizzazione della proteina, accelerandone l'interazione con il DNA e favorendo l'attivazione della trascrizione genica. Nella seconda parte dell'articolo sono riportati i risultati di alcuni lavori di epidemiologia molecolare, che hanno descritto in maniera dettagliata l'associazione tra le mutazioni finora riscontrate nel gene della p53 ed i vari tipi di neoplasia umana. Le mutazioni a questo gene sono estremamente comuni nei carcinomi, con percentuali di presenza che arrivano all'ottanta per cento in alcuni sottotipi istologici. L'analisi dello spettro mutazionale della p53 (che può essere condotta con tecniche immunoistochimiche o con metodiche di biologia molecolare) essenziale per chiarire i diversi meccanismi della cancerogenesi, integrando ipotesi cellulari e molecolari. SUMMARY p53 was named "the protein of the year" and its multiple functions during the celi cycle were carefully described. p53 is involved in the control of cellular replication, in the synthesis and rearrangement of DNA, in celi differentiation and apoptosis. The activity of p53 can well describe the oncosuppressor activity of the kind of genes that run against clonai expansion. We first/y in first the crystallography study of the p53 core and the oligomerization domain. The core of the protein attaches direct/y the consensus sequence in DNA and the oligomerization's domain, producing the tetrameric form and starts and makes the transcription process active. Results of studies of molecular epidemiology and the associations of p53 mutations to human cancer are described. The percentage of mutations is high in cancer and some neoplasias have 80% of mutations. The different mutations in p53 are exploited and described by immunohystochemical or molecular biology methods. The study of this spectrum of mutation is important to make clear cancer growth. PAROLE CHIAVE: proteina p53, geni oncosoppressori, struttura mo/eco/are, epidemiologia mo/eco/are p53: GENERALITA' E FUNZIONI I geni oncosoppressori I geni oncosoppressori, tra cui i più noti sono RB (gene del retinoblastoma) e p53 (1), costituiscono generalmente siti molto vulnerabili al danno del DNA. Essi agiscono come barriere fisiologiche contro l'espansione clonale e sono in grado di inibire la crescita e la metastasi delle cellule soggette ad incontrollata proliferazione a causa di mutazioni agli oncogeni. (2) La perdita dell'attività oncosoppressoria può avvenire per danneggiamento diretto del genoma causato da mutazioni, riarrangiamento cromosomico e mancata disgiunzione, inversione genica e ricombinazione mitotica. L'attività oncosoppressoria può anche essere neutralizzata dall'interazione con altre proteine cellulari o con oncoproteine virali. A differenza degli altri geni oncosoppressori, i quali esercitano la loro funzione solo in determinati tessuti o linee cellulari, il gene p53 si è ben conservato durante l'evoluzione ed omologhi della p53 umana sono stati trovati in pesci, anfibi, uccelli, roditori e primati (3). Meccanismi d'azione della proteina p53 normale e mutata La proteina p53 è stata scoperta alla fine degli anni '70 come fosfoproteina nucleare di 53 kd legata all'antigene trasformante del virus SV40 (antigene T) (4). Essa gioca un ruolo importante nel controllo del ciclo cellulare, nella sintesi e nella riparazione del DNA, nella differenziazione cellulare e nella morte cellulare programmata (5-7). E' noto da tempo che uno degli effetti principali derivanti dall'accumulo di p53 "wild type", in conseguenza a danni del DNA o ad un blocco della sintesi di di DNA o RNA (8), è quello di bloccare le cellule nella fase G1 del ciclo. I due principali punti di controllo lungo la progressione del ciclo sono G1 /S e G2/M e sono regolati da una famiglia di proteine cinasi correlate fra loro, conosciute ligand ASSAY VOL. 1 NUMERO 4 ANNO 1996

2 h come cinasi ciclino-dipendenti (Cdk). Nelle cellule normali le Cdk sono presenti prevalentemente sotto forma di compiessi quaternari. Tali complessi sono formati da una Cdk, una ciclina, un antigene nucleare collegato alla proliferazione cellulare e non ancora ben caratterizzato, e dalla proteina p21 (anche conosciuta come WAF 1, Cip 1, Sdi 1, p20 CAP, PIC 1) (9). Quest'ultima è un regolatore negativo del complesso e inibisce l'attività dell'eterodimero ciclina-cdk. La sovraespressione di p21 è quindi in grado di inibire la proliferazione delle cellule di mammifero (10). E' stato messo in evidenza che l'espressione della proteina p21 è indotta dalla p53 (11, 12) che tramite questo meccanismo regolerebbe il ciclo cellulare. A sua volta, l'inibitore universale delle cinasi ciclino dipendenti p21 blocca la proliferazione cellulare impedendo la fosforilazione dell'rb da parte delle cinasi e quindi il rilascio del fattore trascrizionale E2F (vedi Fig. 1 ). Le forme mutanti della proteina possono agire come oncogeni dominanti, mentre la p53 "wild type" possiede le caratteristiche di un gene oncosoppressore recessivo. Il contesto cellulare, l'interazione con le proteine cellulari e oncovirali e i cambiamenti nella conformazione fisica della p53 possono modulare tutte queste attività. A questo proposito, si è visto che la p53 "wild type" esposta a chelanti dei metalli assume una conformazione mutata e questo processo è reversibile. Probabilmente il legame con ioni metallici come lo zinco è necessario per stabilizzare la y ----,-----_+.. Apoptosi Arusto ingi FIGURA 1 In seguito al danneggiamento del DNA, la p53 può provocare sia l'apoptosi che l'arresto in fase Gl e la riparazione del DNA.CDK, cinasi ciclino-dipendente; P, fosfato. Da Kouzarides, (1995), modificato p53 '--- --" LI ---,-...JI L...J Attivazione Sito di legame con il DNA Oligomerizzazione Errato silo di legame con il DNA FIGURA 2 Sono rappresentati i domini della proteina p53 necessari all'attivazione trascrizionale, al legame con il DNA sepcifico per la sequenza, all'oligomerizzazione ed al legame non corretto con il DNA a singola elica. Il dominio di attivazione può interagiere con numerose proteine che lo regolano (MDM2, EIB, TBP, Drosophila TAF40, Drosophila TAF 60) Da Kouzarides 1995 (12) mod~tlcato. struttura terziaria. Anche l'ossidazione e la riduzione possono avere un ruolo nel regolare le funzioni della proteina: l'ossidazione fa sì che la p53 assuma una conformazione mutata non più in grado di legarsi al DNA, mentre la riduzione riporta la proteina alla conformazione "wild type" (13). Come si vedrà meglio in seguito, la proteina p53 contiene tre domini separati : il primo, all'n terminale, necessario per l'azione transattivante della proteina, il secondo per il legame sequenza-specifico con il DNA e il terzo, al C terminale, per l'oligomerizzazione della p53, fase necessaria al suo funzionamento. Il primo dominio è in grado di legare diverse proteine che ne regolano l'attivit, quali MDM2 e la proteina virale E1 B che ne reprimono l'attività, o le proteine dtaf60 e dtaf40 che invece fungono da co-attivatori. Recentemente è stato evidenziato che la regione C-terminale è in grado di legare tratti di DNA non bene appaiati e a singola elica (14,15). Ci implicherebbe un possibile ruolo di p53 nei processi di riparazione del DNA, forse come passo necessario per il successivo assembleggio delle proteine di riparo (vedi Fig. 2). E' noto che non tutte le funzioni di p53 sono attive contemporaneamente, ma è sicuro che una sola proteina ha effetti diversi. Questa pleiotropia puo' in parte essere dovuta al fatto che la p53 induce la trascrizione di parecchi geni diversi contenenti una specifica sequenza di DNA nella regione regolatoria. Tra i diversi geni che contengono questa sequenza si possono citare l'oncogene mdm-2 ("murine double minute") (16), il gene della creatina cinasi e il gene GADD45 ("growth arrest DNA damage inducibile gene"). Si è inoltre già accennato all'attivazione, da parte della p53, del gene WAF1 (17). La p53 puo', viceversa, avere effetti opposti sui geni con la sequenza promoter TATA, comune alla grande maggioranza dei geni trascritti. Questa repressione della trascrizione e' attribuita alla capacita' della proteina p53 di legarsi a qualche fattore essenziale del complesso trascrizione-iniziazione (18). La proteina p53 normale inibisce, attraverso questo o altri meccanismi non ancora identificati, l'espressione di molti geni che sono fondamentali al controllo della crescita cellulare, compresi altri geni soppressori e protooncogeni codificanti per fattori di trascrizione nucleari. Essa sembra inoltre di essere in grado di autoregolare il suo stesso promoter, in maniera diversa e con risultati diversi a seconda della linea cellulare considerata (19). Gli effetti della proteina p53 sulla trascrizione genica puo' essere influenzata da alcune modifiche del gene stesso o da alterazioni post-trascrizionali come la fosforilazione o l'interazione con altre proteine, siano queste cellulari o virali (20). Ad esempio, il fattore di trascrizione Mdm-2 si lega alla p53 e inibisce la sua attivita' trascrizionaie; l'amplificazione dell'oncogene mdm-2 sul cromosoma 12q12-13 e la conseguente sovrabbondanza di prodotto genico inattiva la funziona oncosoppressoria della p53': Tale processo è stato osservato all'incirca nel 30% dei sarcom i (21). La p53 forma anche un complesso e modula l'attività trascrizionale della proteina oncosoppressoria di tipo I del tumore di Wilm, coinvolta nella genesi del tumore omonimo (22). Il legame ad una sequenza specifica del DNA e l'attivita' trascrizionale propri della proteina p53 normale posso-

3 no anche essere inibiti in presenza di oncoproteine prodotte da certi virus a DNA, inclusi quelli codificati dal papillomavirus umano (notoriamente associato allo sviluppo di tumori). Sono inoltre stati osservati modelli di morte cellulare programmata sia dipendenti che indipendenti dalla p53 (23). Siccome la p53 è un fattore essenziale dell'apoptosi indotta dai farmaci chemioterapici in grado di danneggiare il DNA, o dalle radiazioni ionizzanti, l'inattivazione della p53 stessa potrebbe incrementare sia il pool di cellule proliferanti che la probabilità della loro trasformazione neoplastica, inibendo la morte cellulare programmata. In più, è noto che le cellule neoplastiche contenenti una mutazione alla p53 possiedono una maggiore resistenza alla morte causata dall'esposizione alle radiazioni o agli agenti chemioterapici antitumorali, nonché un'incrementata frequenza di mutazioni, soprattutto nei geni coinvolti nel fenomeno della progressione neoplastica (24). Queste osservazioni sul coinvolgimento della p53 in cosi ' numerose funzioni sottolineano la complessità e la ridondanza intrinseci nei processi fisiologici essenziali delle cellule umane. STRUTTURA DEL COMPLESSO CORE-P53 - DNA Determinazione della struttura La digestione proteolitica della proteina p53 umana ha dimostrato che il segmento compreso tra i residui 102 e 292 costituisce un dominio strutturale compatto e indipendente, essenziale ai fine del legame della proteina con il DNA. Questo "core" manca del dominio di oligomerizzazione collocato vicino alla porzione carbossi-terminale ed esiste in soluzione sotto forma di monomero. E' stata inoltre verificata la presenza di un atomo di zinco necessario per l'attivita' di legame della proteina al DNA (25). Sono stati recentemente pubblicati i risultati di studi ottenuti attraverso l'analisi di cristalli del complesso core DNA (26). Piu' precisamente, tali cristalli contengono un frammento della p53 umana (corrispondente al tratto compreso fra i residui ), e un tratto di DNA a doppia elica di 21 bp contenente due sequenze pentameriche di consenso. I cristalli sono stati fatti crescere in anaerobiosi e hanno permesso di determinare la struttura del complesso con una risoluzione di 2,2 À. L'esatta struttura di questi cristalli è descritta di seguito. Essi presentano un tratto di DNA a doppia elica e tre molecole del core della p53, il tutto assemblato in una unita' asimmetrica. Uno dei core si lega ad un sito di consenso del DNA e prende contatti con le basi e con il fosfato. Un altro core si lega 11 bp piu' avanti, in una regione dotata di scarsa omologia con la sequenza di consenso (questo sito e' posto nel punto di interfaccia fra due eliche di DNA, dovuto alla simmetria cristallografica). I due core si legano allo stesso lato della doppia elica e interagiscono soltanto debolmente tra di loro formando un dimero testa-coda. Ovviamente, il complesso non-consenso ha pochi contatti con le basi, in paragone all'altro. Un terzo core non si lega al DNA, ma determina un'interazione proteina-proteina in grado di stabilizzare la struttura del cristallo. I tre core hanno strutture simili e appare chiaro che la loro interazione col DNA non determina significativi cambiamenti strutturali. Gli atomi Ca del core del complesso consenso possono essere sovrapposti ai rispettivi Ca del core che non lega il DNA con una deviazione non superiore a 0,75 À. La struttura del core contiene un sandwich di due piani ~ antiparalleli, formati rispettivamente da 4 e 5 catene ~, e un motivo ansa-piano-elica (Fig. 3). AI termine del sandwich ~ ci sono due larghe anse tenute insieme, almeno in parte, da un atomo di zinco legato (con legami di coordinazione) a tre cisteine e una istidina (vedi anche 27). Sebbene il sandwich ~ comprenda la maggior parte della struttura del core, esso non e' direttamente coinvolto nel legame col DNA. A questo scopo, viene utilizzato invece il motivo ansa-piano-elica e una delle due larghe anse. In particolare, l'elica e l'ansa del motivo strutturale si pongono nel solco maggiore del DNA e prendono contatto con i bordi delle basi, mentre l'altra ansa contiene un residuo di arginina che si inserisce nel solco minore. E' da notare che la parte della struttura coinvolta nel legame col DNA rappresenta la regione piu' conservata del dominio del core e contiene la maggioranza dei siti di mutazione osservati nei tumori. In generale, le mutazioni sono piu' frequenti nelle regioni del core piu' strettamente a contatto col DNA; la frequenza delle mutazioni si riduce drasticamente se ci spostiamo dalla zona prossima al DNA verso l'altro capo del sandwich ~. Interazioni p53-dna I siti di legame della p53 sul DNA consistono in quattro copie della sequenza di consenso pentamerica PuPu PuC(Nf), dove Pu indica una qualsiasi base purinica (28, 29). I pentameri sono orientati in direzioni alternate, con alcuni siti contenenti fino a 13 bp tra coppie di pentameri (~~ X~~; ciascuna freccia rappresenta una sequenza di consenso pentamerica e la X uno spazio di lunghezza variabile). La struttura del cristallo rivela che il core lega principalmente un singolo pentamero di co nsenso, ma anche alcu An.. LI N (94) FIGURA 3 Rappresentazione del core della p53. Diagramma topologico degli elementi della struttura secondaria da Cito Y. et al., 1994 (26) modificato.

4 ne paia di basi poste al di fuori di tale sequenza partecipano al legame. Questa osservazione suggerisce l'ipotesi che sia necessaria, ai fine del legame, anche parte di un pentamero adiacente [PuPuPuC(AIT)-(T/A)GPyPyPy] (Py = base pirimidinica). Mutazioni piu' frequenti Tra i residui aminoacidici piu' frequentemente soggetti a mutazioni, ne spiccano in particolare sei. Questi "hotspots" sono Arg 248 (9,6% delle mutazioni di p53), Arg 273 (8,8%), Arg 175 (6,1%), Gly 245 (6,0%), Arg 249 (5,6%) e Arg 282 (4%) (Fig. 4). L'Arg 248 prende contatto con il solco minore della doppia elica del DNA, mentre l'arg 273 (presente all'interno del motivo ansa-piano-elica) interagisce con il fosfato della struttura portante del DNA. I rimanenti quattro "hotspots" sembrano giocare un ruolo critico nella stabilizzazione della superficie di contatto della p53 con il DNA. Le tre arginine e le loro catene laterali partecipano ai legami attrattivi deboli (forze di Van der Waals, legami elettrostatici e idrogeno) con altre catene laterali e con i gruppi carbonilici. La Gly 245 è l'unico residuo non argininico e stabilizza in maniera determinante l'ansa L3. Meccanismo di inattivazione della p53 tramite le mutazioni La struttura cristallina del complesso core p53-dna, unitamente allo studio biochimico dei mutanti, fornisce buoni elementi per comprendere in qual misura le mutazioni danneggino la capacita' della p53 di legarsi al DNA in seguito al riconoscimento di una sequenza di consenso. Come si è visto, una classe di mutazioni coinvolge residui aminoacidici che prendono direttamente contatto col DNA; l'incapacita' di tali mutanti di realizzare un legame corretto è quindi da attribuirsi alla mancanza di un appropriato sito di riconoscimento della sequenza di consenso. Un'altra classe di mutazioni coinvolge invece residui che sembrano essere importanti per la stabilizzazione del dominio del core, con conseguenti difetti strutturali della proteina risultante. Sebbene l'esatta natura di tali difetti non sia ancora chiara, gli studi biochimici condotti su alcuni di questi mutanti suggeriscono l'ipotesi che essi presentino una struttura secondaria e terziaria alterata (30). E' stato suggerito che le molecole di p53 mutate abbiano una loro ben definita conformazione, comune a tutte quante, spesso definita come "conformazione mutante" e distinta dalla p53 "wild-type" (31). Questa ipotesi e' basata sul fatto che alcuni anticorpi monoclonali, in particolare PAb240, sono in grado di legarsi a molti dei mutanti, ma non alla proteina "wild-type" (32,33). Gli studi cristallografici permettono di rielaborare tale idea, e inducono a pensare che questa "conformazione mutante" rappresenti piu' propriamente uno stato denaturato della p53, piuttosto che una conformazione della proteina alternativo e a se' stante. Modello del complesso tetramerico p53-dna ne COOH-terminale della catena aminoacidica (residui ) (25). Essa in grado di legare i siti di DNA che contengono, come si e' visto, quattro copie della sequenza pentamerica di consenso. Si suppone quindi che la p53 leghi il DNA sotto forma di tetramero con una stechiometria di una molecola di p53 per pentamero di consenso. Nella struttura cristallina esaminata, il core si lega effettivamente con l'apparente stechiometria di una molecola per sequenza di consenso, ma, forse a causa della mancanza del dominio di oligomerizzazione, esso forma un dimero testa-coda. L'interfaccia del dimero presenta interazioni fra i residui Ser 96, Ser 99 e Thr 170 del complesso-consenso, e Thr 140, Glu 198, Gly 199 e Glu 224 del complesso-non consenso. I frammenti di DNA utilizzati nella cocristallizzazione contengono un pentamero di consenso addizionale che potrebbe permettere un dimero simmetrico, ma non si e' osservato alcun legame a questa sequenza. Cio' probabilmente e' dovuto alle forze responsabili della coesione interna del cristallo, in quanto, nel cristallo stesso, il core che non si lega al DNA esclude il legame di un altro core a questo pentamero. E' stato messo a punto un modello del complesso tetramero-dna basato sul complesso core-dna e sulla presenza di un sito contenente quattro pentameri di consenso. Tale modello suggerisce che il legame tetramerico sia possibile in quanto non esistono ingombri sterici eccessivi tra i singoli monomeri. STRUTTURA DEL DOMINIO DI OLiGOMERIZ ZAZIONE DELLA p53 E' noto che la p53 esiste sotto forma di proteina oligomerica. La polimerizzazione avviene grazie ad alcune sequenze che, nella conformazione tridimensionale della proteina, sono disposte in maniera tale fiancheggiare la regione centrale del core, quella in grado di legare il DNA. Sia la proteina completa che la porzione C-terminale esistono in soluzione sotto forma di tetrameri (34, 35). La proteina umana della p53 e quella murina possono entrambe formare eterotetrameri stabili, cosa questa che indica chiaramente come la regione deputata all'oligomerizzazione sia funzionalmente conservata (36). Clore et al. (1994,1995) (37, 38), utilizzando la spettroscopia a risonanza magnetica eteronucleare multidimensionale, sono riusciti a risolvere la struttura del peptide di 42 aminoacidi (residui ) che contiene il dominio di tetramerizzazione della p53 umana. Per determinare la FIGURA 4 La distribuzione delle mutazioni nella proteina p53 umana. Sono evidenziate le regioni evolutivamente conservate nella sequenza aminoacidica della proteina. Le linee verticali rappresentanole frequenze di mutazioni in corrispondenza di ciascun aminoacido da ello et al., 1994 (26). La p53 forma un tetramero attraverso l'utilizzo di un dominio deputato all 'oligomerizzazione, situato nella porzioligand ASSAY VOL. 1 NUMERO 4 ANN O 1996

5 struttura di questa regione sono state esaminate sia esclusivamente proteine marcate con 15 N13C che proteine in egual misura marcate e no. In tal maniera era possibile determinare la posizione dei residui all'interno delle singole subunita' e la posizione relativa delle diverse subunita' nella struttura tetramerica. I dati rivelano che la struttura del tetramero è altamente simmetrica. Il monomero contiene un'ansa (residui ), un piano ~ (residui ), una seconda ansa (residui ) e infine una a elica ( ). Ciascuna subunita' interagisce con quella che gli è prossima in maniera tale che le eliche e i piani ~ sono antiparalleli. Due dimeri cosi' formati interagiscono ancora tra di loro formando un fascio di quattro eliche. Il tetramero finale è percio' un dimero di dimeri; le interazioni tra le singole eliche sono stabilizzate da parecchi legami salini (vedi anche 39). Sebbene la maggioranza delle mutazioni riscontrate nei tumori siano localizzate nel dominio di legame del DNA, ne sono state identificate alcune nel sito di oligomerizzazione (40, 41). Alcune sono mutazioni di blocco o determinano lo scivolamento della cornice di lettura; quattro di esse sono invece mutazioni puntiformi. Esse sono: Leu 330 His; Gly 334 Val; Arg 335 Cys; Glu 349 Asp. Sebbene non sia stato dimostrato che questi mutanti abbiano perso la loro attivita' "oncosoppressoria", è abbastanza facile che tali cambiamenti nella struttura primaria destabilizzino il tetramero, impedendo del tutto o almeno in parte l'oligomerizzazione. A questo proposito, è particolarmente interessante la mutazione Leu His, che introdurrebbe un residuo idrofilico nel core idrofobico compreso fra il piano ~ e le eliche delle subunita' A e B; mentre la mutazione Arg Cys eliminerebbe l'interazione elettrostatica tra Arg 355 della subunita' A e Glu 349 della subunita' B. Il dominio di tetramerizzazione della p53 gioca un ruolo importante nell'economia di questa molecola. Esso, infatti, è in grado di facilitarne le interazioni con il DNA, in quanto l'aggregazione cooperativa dei monomeri di p53 accelera moltissimo l'efficienza del complesso risultante nell'azione di legame alla doppia elica dell'acido nucleico (42,43). REVISIONE DI UN MODELLO: p53 ED APOPTOSI I risultati dei recenti studi sulla struttura della p53 rafforzano l'ipotesi che il legame con il DNA e l'attivazione genica siano fasi essenziali dell'attivita' di questa proteina come oncosoppressore. Tuttavia sono ultimamente emersi alcuni dati che mettono in crisi il quadro generale proposto (44). Il gene normale della p53 sopprime la crescita tumorale in due modi: causando l'arresto delle cellule nella fase G1 del ciclo cellulare oppure inducendo la morte cellulare programmata (apoptosi), provocata da agenti che danneggiano il DNA (45). In quest'ultimo caso, p53 costituirebbe un attivatore in grado di promuovere la trascrizione dei geni mediatori dell'apoptosi. Caelles e collaboratori (46) hanno immortalizzato cellule della pituitaria con l'introduzione dell'antigene T del virus SV40 e hanno poi trasferito in queste cellule il gene di una p53 mutata, sensibile alla temperatura. In seguito ad irradiazione, le cellule diventavano apoptotiche solo se era stato espresso il prodotto del gene della p53, ad una temperatura adeguata. Il fatto piu' importante è che tale apoptosi p53-dipendente non era bloccata da massicce dosi di inibitori della trascrizione. E' ovviamente impossibile escludere la possibilita' che alcuni geni vengano preservati dall'azione degli inibitori; in questo senso, sarebbe interessante esaminare l'espressione p53-dipendente di Bax, un prodotto genico che si lega a Bcl-2 e che puo' indurre apoptosi (47). Comunque, l'interpretazione piu ' semplice di tali dati è che l'apoptosi indotta da p53 in questo sistema non era provocata dalla transattivazione di geni sequenza-specifica, bensi' costituiva il risultato di altre proprieta' della p53. E' possibile che - piu' in generale - alcuni degli effetti della p53 (per esempio, l'arresto in G 1) possano essere collegati ad un'attivazione sequenza-specifica, mentre altri (apoptosi, almeno in certe situazioni) dipendano da azioni diverse della p53. Studi piu' approfonditi potrebbero permetterci di comprendere quali attivita' possano essere svolte dalla p53, oltre all'azione gia' nota di trascrizione di alcuni geni bersaglio. I risultati di Caelles et al. impongono un riesame complessivo delle proprieta' biochimiche di questa proteina in situazioni dove l'attivazione di specifici geni non sussiste. UNO STUDIO DI EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE: ANALISI DELLO SPETTRO MUTAZIONALE DEL GENE p53 NEI CARCINOMI UMANI Introduzione L'identificazione di precise alterazioni molecolari responsabili della trasformazione neoplastica, del differenziamento anormale e del controllo della crescita cellulare, uno dei maggiori obbiettivi della ricerca sul cancro. L'epidemiologia molecolare si sviluppata nel tentativo di integrare gli studi epidemiologici tradizionali sui fattori di rischio per il cancro, con le nuove conoscenze riguardanti i meccanismi molecolari dei processi cellulari (48). L'analisi dello spettro mutazionale, cioè lo studio del tipo e della localizzazione delle alterazioni del DNA, in grado di descrivere diversi modelli di alterazioni del codice genetico, sia causati da mutageni esogeni, quali possono essere l'esposizione a radiazioni tipo UV o ionizzanti, oppure a sostanze cancerogene di varia natura, che da processi biologici endogeni, come la deaminazione spontanea della citosina e della 5-metil citosina, gli errori di duplicazione del DNA, la depurinazione e i danni ossidativi causati da radicali liberi. Le alterazioni dei geni correlati al cancro riscontrate nei tumori, non danno solo informazioni sulle relazioni esistenti tra agente cancerogeno e DNA e i processi di riparo del DNA, ma riflettono anche la selezione di quelle mutazioni che conferiscono alle cellule maligne o premaligne un vantaggio nella crescita. Studi sulla frequenza, sulla comparsa nel tempo e sullo spettro mutazionale delle anomalie del gene p53 e di altri geni correlati con la comparsa dei tumori, possono perci generare e testare molte ipotesi relative alla cancerogenesi. Le ipotesi che si pos- UGAN D ASSAY VOL. 1 NUMERO 4 ANNO 1996

6 TABELLA 1 Mutazioni di p53 nei tumori umani. Prev.mut. % = prevalenza delle mutazioni di p53 da ciascun organo o tessuto evidenziate con PCR Del-Ins altro = delezioni, inserzioni CpG % = percentuale di transizioni a dimero CpG. (da Hollstein M. et al. 1994) Tipo di Prev. G:C-> G:C-> G:C-> A:T-> A:T-> A:T-> Del-Ins CpG tumore (n) mut. % A:T% T:A% C:G% G:C% T:A% G:C% Altro % Tumori totali (2567) Il Polmone (897) Il 9 Colon (960) Il Esofago (279) Ovaio (386) Pancreas (170) IO 21 Cute (220) Stomaco (314) Testa e collo (524) Il Vescica (308) Sarcomi (339) Prostata (87) O Fegato (716) Cervello (456) Il Surrene (31) 23 Mammella (1536) Il Endometrio (224) lo 4 14 O Mesoteliomi (23) 22 Rene (102) 19 Tiroide (299) O Ematologici (1916) Carcinoidi (61) II Melanomi (70) 9 Paratiroidi (13) 8 Utero (350) lo O O IO IO 25 Neuroblastomi (212) Wilms (41) O Testicolo (40) O Ipofisi (27) O Feocromocitomi (47) O

7 sono verificare, per esempio, sono quelle riguardanti le interazioni tra DNA e agente cancerogeno, o quelle riguardanti le funzioni dei prodotti dei geni modificati, o i meccanismi della cancerogenesi in organi e tessuti specifici, ed infine informazioni generali riguardanti la biologia cellulare come la replicazione e la riparazione del DNA. In letteratura appare senpre più chiara l'implicazione della proteina p53, sia nelle normali funzioni cellulari che nella trasformazione neoplastica (5, 6, 49, 50). Le mutazioni di questo gene rappresentano le anormalit genetiche più comuni trovate nei carcinomi umani (51). Esse variano, a seconda del tipo di tumore, dallo O al 60% nei tumori principali, e superano 1'80% in alcuni sottotipi istologici (tabella 1). Il gene p53 presenta tutti i tipi di mutazioni : delezione, inserzione, sostituzione di una base, nel qual caso si può avere sia transizione (sostituzione di una pirimidina con un'altra pirimidina o di una purina con una purina) che transversione (sostituzione di una pirimidina con una purina o viceversa). Tre quarti delle sostituzioni avvengono a livello della coppia di basi G:C. Il gene p53 particolarmente adatto all'analisi dello spettro mutazionale per diverse ragioni: a) siccome le mutazioni di questo gene sono comuni in molti carcinomi umani, si formato una base dati sufficientemente vasto la cui analisi può portare a conclusioni statisticamente valide (52, 53); b) la sua modesta estensione (11 esoni, 393 amino acidi) permette lo studio di tutta la regione codificante ed inoltre, essendo altamente conservata in tutti i vertebrati, possibile l'estrapolazione dei dati da modelli animali (3); c) le mutazioni puntiformi che alterano le funzioni della proteina p53, sono distribuite in un'ampia regione della molecola, specialmente nella regione idrofobica centrale (48) dove molte singole sostituzioni di basi, a livello del DNA, sono in grado di alterare la conformazione della proteina e la sua attività di transattivazione sequenza-specifica. Questo fatto importante in quanto permette di correlare le distinte proteine mutate con i relativi cambiamenti funzionali. Metodi di analisi delle mutazioni di p53 Nel base dati cui si accennato (52) sono state analizzate 2567 mutazioni riscontrate in carcinomi o in linee cellulari umane tratte da più di 300 articoli pubblicati o in stampa fino al 1 0 gennaio Sono state inserite nella base dati solo mutazioni la cui presenza è stata confermata tramite sequenziamento del DNA. I dati sono stati analizzati allo scopo di evidenziare: (a) questioni riguardanti la cancerogenesi correlata all'analisi mutazionale; (b) come l'analisi dello spettro mutazionale e gli esperimenti in vitro possano portare a informazioni complementari sulla carcinogenesi; (c) nuove ipotesi, generate dalle informazioni accumulate, da utilizzare specificatamente per i futuri studi sulle mutazioni di p53. I metodi di analisi delle mutazioni possono portare a conclusioni sbagliate riguardo la prevalenza e la natura delle mutazioni di p53; occorre poi esaminare alcuni dettagli concernenti le tecniche usate prima di esaminare i dati da esse prodotti. I tumori solidi sono molto eterogenei essendo generalmente costituiti da cellule tumorali, da cellule stromali non neoplastiche e da detriti di cellule necrotiche. Inoltre i tumori subiscono una evoluzione clonale. Tutto ciò fa sì che differenti zone dello stesso tumore possano variare per quanto riguarda sia il fenotipo che il genotipo; di conseguenza un falso negativo può essere causato anche solo da un errore di campionamento. L'analisi al microscopio del campione di tessuto quindi importante per assicurarsi che esso contenga una adeguata quantità delle figure istologiche desiderate e per evitare di analizzare frammenti di cellule in necrosi. L'unica tecnica atta ad identificare in modo preciso le mutazioni di p53 è quella di sequenziare il DNA, tuttavia per evidenziare un p53 mutato, sia a livello di gene che di proteina, possibile utilizzare anche solo tecniche immunologiche o test chimici (54, 55). Dato che sequenziare il DNA lungo e laborioso molti studi riguardanti le mutazioni di p53, correlate a tumori umani, sono state condotte utilizzando diverse tecniche di screening la cu i sensibilità e specificità rappresenta un fattore critico nell'introdurre errori nei dati riguardanti le mutazioni di p53. La proteina p53 normale solitamente situata nel nucleo ed ha una emivita estremamente breve, essa inoltre è presente in quantità talmente esigue da non poter essere rivelata tramite le normali tecniche immunoistochimiche (IHC). AI contrario la proteina p53 mutata sovente presenta un tempo di emivita maggiore oltre ad essere espressa in maggiore quantità, ed perciò evidenziabile tramite IHC (55). Per questo motivo molti ricercatori hanno utilizzato l'ihc come test di screening prima di effettuare l'analisi delle sequenze del DNA, mentre altri hanno utilizzato i dati ottenuti da questa tecnica come unico indizio della mutazione di p53, senza verificare la sequenza del DNA. Su 84 studi che riportavano entrambe le tecniche di IHC e di sequenziamento del DNA nello studio dello stesso tumore, l'ihc, per rivelare il p53 mutato, risultava positiva nel 44% dei casi studiati, mentre solo il 36% di essi risultava avere il gene mutato analizzando il DNA. Le discrepanze dei risultati ottenuti tramite IHC o sequenziamento del DNA in sono parte dovute a problemi di tipo tecnico ed in parte no. Le mutazioni che portano alla non espressione della proteina (mutazioni nonsenso) o ad alcune sue forme tronche, per esempio, non portano all'accumulo della p53, e pertanto questi tipi di anomalie non verranno rivelati tramite IHC. Inoltre si è visto che alcuni tumori come i melanomi e il carcinoma del testicolo sono frequentemente immunopositivi per la proteina p53 pur non presentando alcuna mutazione a livello di questo gene. La positività IHC alla p53 può essere dovuta all'accumulo della forma normale della proteina, tramite stabilizzazione mediante legame con una proteina virale o cellulare. Un'altra ipotesi è che la mutazione avvenga in realtà non su p53 ma su un gene in grado di interferire con i meccanismi di feedback negativi che solitamente regolano l'espressione di p53. Altri metodi utilizzati nello screening dei tumori per identificare le mutazioni coinvolte sono l'evidenziazione della alterata mobilità elettroforetica delle sequenze di DNA contenenti mutazioni puntiformi e le tecniche di PCR ("polymerase chain reaction"). Per quanto riguarda tecniche di mobilità elettroforetica come la SSCP ("single-stranded conformation polymorphism") esse hanno una specificità ed una sensibilità del

8 , 90% nel rivelare mutazioni successivamente confermate dalla sequenziazione del DNA. Tuttavia sequenziare il DNA è comunque necessario per confermare che il dato positivo così ottenuto rappresenti effettivamente una mutazione e non un artefatto tecnico o un polimorfismo ereditario come quelli riscomtrati nei codoni 72 e 213 (56, 57). Le tecniche basate sulla PCR sono soggette al rischio di risultati falsi positivi e negativi; è perciò necessario che ogni mutazione trovata tramite sequenziazione di prodotti della PCR sia confermata sequenziando un secondo prodotto, ottenuto con lo stesso procedimento, da un'altra PCR. Questa pratica non è stata seguita uniformemente da tutti i ricercatori, perciò alcuni valori della base dati possono essere dei falsi positivi. Estensione dell'analisi del gene p53 Nell'uomo il gene p53 si trova nel braccio corto del cromosoma 17, esso è formato da 11 esoni di cui gli esoni dal 2 all'11 codificano per una proteina di 393 aminoacidi. Già dai primi studi è stato messo in evidenza che la maggior parte delle mutazioni del p53 avvengono nella regione del gene evolutivamente più conservata che va dall'esone 5 all'esone 8 (54). Basandosi su questi dati preliminari molti ricercatori fin da subito hanno confinato le loro analisi su questi esoni, ed è anche per questo che il 95% delle mutazioni riportate sono state trovate negli esoni 5-8 e negli introni presenti tra di essi. Su 560 mutazioni trovate sequenziando l'intera regione codificante la p53, 1'87% delle mutazioni cadono negli esoni 5-8, 1'8% nell'esone 4 e il 4% nell'esone 10. La distribuzione delle mutazioni varia a seconda del tipo di tumore: le mutazioni al di fuori degli esoni 5-8 sono molto frequenti nel tumore alla mammella (28%) e nei carcinomi epatocellulari (24%), mentre sono meno frequenti nei tumori al cervello e in quelli delle cellule ematopoietiche (2%). L'analisi dei soli esoni 5-8 porta ad una sottostima delle mutazioni di p53, specialmente di quelle nonsenso, che arriva fino al 20% in alcuni tipi di tumore. Analizzare gli esoni 4 e 10 comunque consigliato se non si sono trovate mutazioni negli esoni 5-8. Le differenze tessuto specifiche del tipo di mutazioni e degli esoni che le portano evidenziano che una analisi dettagliata dello spettro mutazionale di p53 è in grado di rivelare modelli sottili di danno genetico. Poco si conosce sui due promoter e i 10 introni, tranne nelle zone più vicine agli esoni, di p53, anche perchè l'analisi di sequenza fatta su DNA ottenuto da RNAm amplificato con la PCR, ha perso gli introni per splicing. Le mutazioni nelle regioni regolatorie degli introni potrebbero essere le mutazioni prevalenti ma non evidenziate con screening condotto tramite IHC, se la proteina non si accumula. Considerazioni epidemiologiche Variazioni delle mutazioni di p53 dovute a differenze di popolazione possono creare errori di valutazione nell'ambito delle conclusioni. Per alcuni tipi di tumore sono state evidenziate differenze di frequenza tra gruppi diversi per etnia o nazionalità, forse dovute all'esposizione a specifici agenti carcerogeni o a caratteristiche specifiche di queste popolazioni. Allo scopo di trarre valide conclusioni, l'epidemiologia molecolare deve aderire ai principi epidemiologici standard delle analisi statistiche; vale a dire: (a) selezione di un appropriato gruppo di studio e di controllo; (b) lavorare su di un campione adeguatamente ampio onde minimizzare gli errori di tipo I (assegnare prematuramente una relazione tra un cancerogeno putativo e l'insorgenza di tumori); (c) scegliere il metodo statistico più adatto per rilevare differenze importanti evitando gli errori di tipo Il (erronea conclusione che non esistono differenze). Relazione tra i meccanismi di riparo del DNA e le mutazioni Tutti gli organismi sono costantemente esposti ad agenti mutageni esogeni ed endogeni; si sono quindi evoluti sofisticati sistemi di riparo del DNA allo scopo di mantenere l'integrità del genoma. La riparazione del DNA pu essere definita come una risposta cellulare atta a ripristinare la sequenza nucleotidica normale e la stereochimica del DNA dopo che esso ha subito un danno. La riparazione del DNA avviene più velocemente nei geni che vengono attivamente trascritti rispetto a quelli quiescenti e sembra essere un meccamismo correlato ad altre vie cellulari che controllano l'espressione dei geni (58). A conferma di ciò sono stati di recente descritti geni che codificano per enzimi in grado di riparare il DNA e in grado di attivare altri geni (59). I meccanismi di riparo non agiscono con la stessa velocit sulle due emieliche del DNA: sono più veloci sull'elica che viene trascritta (template) rispetto all'elica non trascritta (coding). Esperimenti condotti su batteri, lieviti, cellule di mammifero e su modelli di cancerogenesi di topo in vivo, hanno mostrato che mutazioni indotte da cancerogeni esogeni avvengono preferenzialmente sull'elica non trascritta del gene p53 (60, 58). L'ipotesi che, nell'uomo, deficienze nei meccanismi di riparo del DNA possano interferire con i modelli di mutazione, è stata verificata misurando la capacità di riparare i dimeri di pirimidina, su di una singola elica del gena p53, indotti da raggi UV su fibroblasti umani in coltura normali o di pazienti affetti da xeroderma pigmentoso del gruppo c (XP-C). Si è visto che sia nei fibroblasti normali che in quelli affetti da XP-C avviene una riparazione selettiva dei danni subiti a livello dell'elica che viene trascritta del p53, anche se errori di riparaziopne sono più frequenti nelle cellule affette da XP-C. Anche in questo caso, inoltre, specialmente nei fibroblasti XP-C positivi, le mutazioni sembrano verificarsi maggiormente nell'elica non trascritta del gene p53. Alcuni tipi di tumori sono stati associati, grazie a studi epidemiologici e di laboratorio, a determinate mutazione causate da specifici agenti cancerogeni. Per esempio i tumori ai polmoni sono correlati all'esposizione di questo organo al fumo di sigaretta. Nei tumori ai polmoni il 91 % dei casi di trasversione G:C-TA avvengono nell'elica non trascritta del DNA, il che supporterebbe l'ipotesi di un coinvolgimento dei meccanismi di riparo del DNA nel determinare la specificità delle mutazioni dei geni correlati ai diversi tipi di tumori. Mutazioni dovute a delezioni ed inserzioni L'analisi di brevi delezioni ed inserzioni che interessa- LlGAND ASSAY VOL. 1 NUMER04 ANNO 1996

9 no il gene p53 (61) ed altri geni associati a malattie genetiche, hanno portato alla conclusione che il tipo di sequenza del DNA è uno dei fattori determinanti nel verificarsi di questi eventi. Infatti molte piccole delezioni ed inserzioni si hanno in zone del DNA dove si susseguono brevi sequenze, anche solo di due-otto basi, ripetute più volte o intervallate da un'altra corta sequenza. Uno dei meccanismi chiamati in causa per spiegare questo fenomeno è il cosidetto "scivolamento di appaiamento" (slipped mispairing) cioè un allineamento sbagliato dell'elica durante la replicazione del DNA. Questo fenomeno porta a delezione, se i nucleotidi esclusi dall'appaiamento sono sull'elica stampo del DNA, e ad inserzione se sono sull'elica opposta. La base dati contiene 285 delezioni o inserzioni di o minori di 30 paia di basi, quasi tutte (265; 90%) si trovano su sequenze ripetute, dimostrando così che il disappaiamento è sicuramente coinvolto in questo tipo di fenomeni nei geni umani. Le frequenze delle inserzioni e delle delezioni aumentano con l'aumento delle sequenze ripetute nel DNA. La regione del gene p53 che con maggiore frequenza presenta delezioni e inserzioni sono i codoni , una zona ricca di sequenze G:C ripetute. Si conosce ben poco riguardo i fenomeni cellulari che possono influenzare i rischi di disappaiamento del DNA. Alcuni mutageni chimici molto voluminosi che si legano al DNA, deformandone la doppia elica, e che causano deiezioni ed inserzioni nei procarioti, si legano di preferenza a zone del DNA in cui una sequenza di una base o di due ripetuta più volte, e per lo più in zone ricche di G e C. Relazioni tra struttura e funzioni della proteina P53 Per quanto riguarda altri geni soppressori dei tumori, le mutazioni più frequenti portano alla mancata trascrizione della proteina. Nel caso di p53, invece, oltre a questo tipo di mutazioni ce ne sono altre che portano alla formazione di una proteina mutata la cui presenza sembra conferire un vantaggio selettivo per la cellula. Inoltre l'analisi di tutte le mutazioni di p53, rilevate nei tumori umani, evidenziano una loro distribuzione non casuale, suggerendo che specifiche proteine mutate potrebbero possedere differenti capacità di stimolare la crescita cellulare. La conformazione della proteina p53 normale (393 aa nell'uomo) e di alcune sue forme mutate è stata esaminata allo scopo di evidenziare le relazioni esistenti tra conformazione e funzione della proteina. La regione NH 2 -terminale della proteina presenta un dominio ricco di aminoacidi acidi, simile a quello di molti fattori trascrizionali (6) ; essa inoltre è in grado di legare una proteina cellulare, la Mdm2, che si sa inibire le funzioni della p53 (aa 20-40). Tra gli aminoacidi è situata la regione critica della proteina: essa determina la conformazione della p53, il legame specifico della proteina con le sequenze consenso situate sul DNA e l'attività trascrizionale sequenza-specifica essenziale per l'arresto della cellula in ciclo (62, 63). Questa regione inoltre lega l'antigene T del virus SV40. La regione COOH-terminale contiene le sequenze che determinano la localizzazione nucleare della proteina (aa mi ) e il dominio di oligomerizzazione in dimeri o tetrameri (aa ), necessario perchè la p53 si leghi al DNA ed esplichi le sue funzioni. Molte mutazioni che avvengono nella regione centrale idrofobica della proteina (aa ), determinano cambiamenti di conformazione che espongono degli epitopi riconosciuti da un anticorpo, il Pab240, in grado di riconoscere in modo specifico p53 alterate o denaturate. Utilizzando questo anticorpo per individuare proteine p53 alterate, per mutazione o perchè tronche o per modulazione artificiale della conformazione normale, si è potuta verificare l'importanza della conformazione nelle funzioni di p53. Si è così osservato che le mutazioni più gravi sono quelle che determinano, nella proteina, la perdita della capacità di legarsi a specifiche sequenze del DNA o la perdita dell'attività di transattivazione specifica. Le regioni deputate alla localizzazione nucleare ed alla transattivazione non specifica, presenti nelle zone amino e carbossi terminali, non sono invece determinanti e possono essere sostituite con zone analoghe di altre proteine, tramite la costruzione di proteine chimeriche, senza che la p53 perda le sue funzioni di soppressore della crescita cellulare. Distribuzione delle mutazioni e vantaggio selettivo della proteina P53 Secondo la teoria della selezione clonale, se in molte cellule tumorali la p53 è mutata vuoi dire che la sua mutazione avvantaggia la crescita e la proliferazione delle cellule. Tutte le mutazioni della p53 conferiscono alla cellula lo stesso vantaggio evolutivo, o alcune mutazioni risultano essere più vantaggiose di altre? In letteratura sono state individuate alcune regioni della p53 altamente conservate durante l'evoluzione; esse sono state denominate con numeri romani dall'i al V: I aa 13-19; Il aa , III aa , IV aa e V aa Tutte queste regioni, tranne la prima che non presenta alcuna mutazione, risultano essere molto soggette a mutazioni di tipo puntiforme, e si presume contengano sequenze aminoacidiche essenziali perchè la p53 possa esplicare le sue funzioni. Le mutazioni missense sono il tipo pi comune nella regione centrale conservata della proteina (79% delle mutazioni), mentre sono rare nelle regioni amino e carbossi terminali (23%) dove prevalgono le mutazioni nonmissense (mutazioni nonsenso, silenti, "frameshift", di splicing). La rarità delle mutazioni missense ai due terminali della proteina fa ritenere che l'integrità di un singolo residuo aminoacidico in queste regioni non sia essenziale per il mantenimento della struttura e della conformazione della proteina. La distribuzione di mutazioni dovute ad inserzioni e delezioni nella p53, come previsto, correlata principalmente alla presenza di sequenze ripetute a livello del DNA e non alle caratteristiche della proteina, ed infatti esse avvengono con la stessa frequenza nelle regioni conservate ed in quelle non conservate. All'interno dei domini altamente soggetti a mutazione alcuni aminoacidi sono più soggetti a mutazioni di altri e, nell'ambito di ciascun dominio, ci sono alcuni aminoacidi altamente conservati che raramente sono mutati. Per esempio nel dominio Il solo 3 dei 25 aminoacidi presenti hanno percentuali relativamente alte di mutazioni.

10 II ~ Oltre ai domini conservati precedentemente classificati, sono state identificate altre tre zone in cui le mutazioni missense sono abbastanza frequenti e che potrebbero avere un significato funzionale; una regione di 14 aminoacidi si trova tra i domini Il e III, mentre le altre due sono tra i domini III e IV. Altri due residui altamente conservati che spesso sono soggetti a mutazione sono la Tyr 205 e la Gly 266. il fatto che residui di tirosina siano spesso soggetti a mutazioni suggerisce che essi siano importanti per le funzioni di p53, forse pechè sono implicate nei processi di fosforilazione. In conclusione si può affermare che: a) la regione maggiormente conservata corrisponde alla zona della p53 responsabile del legame sequenze specifiche del DNA/proteina (aa ); b) i domini di transattivazione, localizzazione nucleare e di oligomerizzazione sono solo moderatamente conservati, svolgono funzioni generiche non specifiche della p53 e non vengono funzionalmente alterati in modo significativo da sostituzioni di singoli aminoacidi; c) basandosi sull'analisi dello spettro mutazionale si è visto che le mutazioni più favorevoli alla cellula awengono nei domini dall'ii al V e in altre 3 regioni addizionali che sono i codoni , e P53 e tumori umani La frequenza delle mutazioni del gene p53 nei tumori umani varia dal 20-50% ad un massimo dell'81 % riscontrato nelle cellule squamose della mucosa orale e nei tumori rettali. Questo fa pensare che tale gene possa avere un ruolo rilevante in questi fenomeni. Molti tumori umani si sviluppano attraverso diversi stadi ben definiti morfologicamente come per esempio l'adeno carcinoma del colon o la progressione della displasia nelle mucose orali e bronchiali. In alcuni tumori la mutazione del gene p53 è un evento precoce, in altri tardivo (dove per precoci si intendono gli stadi morfologici che precedono il superamento della membrana basale, e per tardivi gli stadi successivi a questo). Le alterazioni della p53 sono un evento precoce nei tumori del polmone, dell'esofago, della mammella (64, 65), della cervice e dello stomaco (66) mentre sono un evento tardivo nei tumori del cervello, della tiroide, del fegato (67) e delle ovaie. Inoltre i tumori del colon, del sangue, del fegato e di altri organi si possono sviluppare seguendo diverse modalità in alcune delle quali l'alterazione della p53 un evento precoce, mentre in altre tardivo. Il metodo tradizionale di descrizione del fenotipo e di predizione del comportamento clinico di un tumore è la determinazione del grado istologico delle cellule tumorali, fatta tramite la microscopia ottica. L'immunoistochimica, che identifica specifici antigeni cellulari, e altre tecniche di colorazione particolari, possono dare molte informazioni clinicamente utili ma non sono in grado di andare oltre una cruda descrizione dei comportamenti basilari dei tumori. Sicuramente conoscere la correlazione tra fenomeni fenotipici, come il grado istologico o lo stato proliferativo, e precisi eventi molecolari, come le alterazioni di p53 o di altri geni, potrebbe aumentare la nostra comprensione del comportamento tumorale. Una relazione tra mutazioni di p53 e grado istologico e stadio del tumore è stata evidenziata nel cancro dell'endometrio, della cervice, dell'ovaio, del fegato, della prostata e del sangue, indicando che in questi tumori le mutazioni di p53 possono rappresentare un evento tardivo che contribuisce alla progressione del tumore. Questa relazione non è presente nei tumori dei polmoni e della mammella nei quali tali mutazioni awengono nei primi stadi del tumore e nelle lesioni preneoplastiche. Studi delle neoplasie cerebrali sono dei buoni archetipi per stabilire il ruolo della p53 nella progressione tumorale. I gliomi di basso grado, indolenti e spesso curabili per resezione che si trasformano in glioblastomi di alto grado, agressivi e rapidamente letali, spesso acquisiscono mutazioni di p53. Tali mutazioni possono essere presenti anche nei gliomi di basso grado. Le mutazioni di p53 presenti nei due gliomi sono simili, a conferma dell'ipotesi che i tumori di alto grado si evolvono da precursori di basso grado. Poichè la p53 ha la capacità di regolare la stabilità del genoma ostacolando la prosecuzione del ciclo cellulare, nel caso che il DNA sia danneggiato, la perdita di questo gene dovrebbe essere accompagnata da aneuploidie e da aumento della proliferazione cellulare, due eventi spesso associati con la progressione tumorale ed una prognosi sfavorevole. In effetti studi preliminari hanno evidenziato una associazione statisticamente significativa tra aneuploidie e mutazioni di p53 in cancri all'ovaio, colorettali e gastrici. L Conclusioni L'analisi dello spettro mutazionale della p53 può contribuire a chiarire i diversi meccanismi della cancerogenesi integrando ipotesi cellulari e molecolari. Alcune indagini che possono essere svolte con queste metodiche sono: 1) l'analisi di quali sono i tempi e le sequenze dei cambiamenti genetici che contribuiscono alla trasformazione neoplastica, alla progressione tumorale e alla formazione di metastasi; 2) l'indagine su come l'interazione tra agente cancerogeno e organismo bersaglio interagiscono, onde individuare come le differenze individuali, nel metabolizzare l'agente carcerogeno e nei meccanismi di riparo del DNA, influenzano il rischio del singolo individuo di sviluppare un tumore; 3) l'analisi della possibilità che tipi di tumori istologicamente differenti possano contenere mutazioni caratteristiche che riflettono un modello di esposizione ad un'unico agente mutageno; 4) la verifica dell'ipotesi che l'amormalità della via del p53 sia critica per tutti i tumori; 5) la verifica dell'ipotesi che nei tumori con basse percentuali di mutazioni del gene p53, questo gene sia inattivato da eventi epigenetici, o se la sua funzione sia interrotta da cambiamenti awenuti su altri geni che partecipano alla via mediata da p53; L'epidemiologia molecolare richiede per una maggiore interazione tra ricercatori, clinici ed epidemiologi. Studi molecolari sul cancro o altre malattie, per esempio, dovrebbero includere alcuni dati sui soggetti analizzati quali sesso, età, gruppo etnico, origine geografica e, quando ligand ASSAY VOL. 1 NUMERO 4 ANNO 1996

11 ID , opportuno, condizioni mediche, possibili esposizioni ad agenti cancerogeni dovute all'ambiente di lavoro, se fumatori o no. L'analisi dello spettro mutazionale e l'epidemiologia molecolare possono essere applicati in modo innovativo per generare e indirizzare ipotesi di base e pratiche su cancerogeni chimici, fisici e biologici, sul comportamento cellulare e tissutale, sui meccanismi delle comunicazioni subcellulari, sul funzionamento delle proteine, sulla replicazione del DNA, sulla trascrizione, traduzione e sulla evoluzione. RINGRAZIAMENTI Questo articolo è stato supportato dalla AIRC nella persona della Dr.ssa L.Verdun di Cantogno. BIBLIOGRAFIA 1. Levine AJ, The tumor suppressor genes. Ann. Rev. Biochem., 62: (1993) Kouzarides T. Functions of prb and p53: what's the connection? Trends in celi biology, 5: (1995) Soussi T, Caron de Fromentel C e May P. Structural aspects of the p53 protein in relation to gene evolution. Oncogene, 5: (1990). Lane DP, Crawford LV. T antigen is bound to a host protein in SV 40 transformed cells. Nature, 278:261-3 (1979). Levine AJ, Momand J, Finlay CA. The p53 tumor suppressor gene. Nature, 351 : (1991 ). Vogelstein B, Kinzler KW. p53 function and dysfunction. Celi, 70: (1992). Lee J, Elenbaas B, Levine A, Griffith J. p53 and its 14 kda C-terminai domain recognize primary DNA damage in the form of insertion/deletion mismatches. Celi, 81(7): (1995). Chernova OB, Chernov MV, Agarwal ML, Taylor WR, Stark GR. The role of p53 in regulating genomic stability when DNA and RNA syntesis is inhibited. TIBS, 14: (1995). Zhang H, Hannon GJ, Beach D. p21-containing cyclin kinases exist in both active and inactive states. Genes Dev., 8(15): (1994). 10. Xiong Y, Hannon GJ, Zhang H, Casso D, Kobayashi R, Beach D. p21 is a uni versai inhibitor of cyelin kinases. Nature, 366: (1993). 11. Gu Y, Turck CW, Morgan DO. Inhibition of Cdk2 aetivity in vivo by an associated 20k regolatory subunit. Nature, 366: (1993). 12. Harper JW, Adami GR, Wei N, Keyomarsi K, Elledge SJ. The p21cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of G I cyclin-dependent kinases. Celi, 75: (1993). 13. Hainaut P, Milner J. A struetural role for metals ions in "wild type" conformation of the tumor suppressor protein p53. Cancer Res., 53(8): (1993). 14. Lee JM, Bernstein A. Apoptosis, cancer and the p53 tumor suppressor gene. Caneer Metast. Rew., 14: (1995). 15. Jayraman L, Prives C. Activation of p53 sequence-speeific DNA binding by short single strands of DNA requires the p5 3 C-terminus. Celi, 81(7): (1995). 16. Zauberman A, Flusberg D, Haubt Y, Barak Y, Oren M. A functional p53-responsive intronic promoter is contained within the human mclm-2 gene. Nucleie Acids Res., 23(14): (1995). 17. El-Delry WS, Tokino T, Velculescu V et al. WAFI, a potential mediator of p53 tumor suppression. Celi, 75 : (1993 ). 18. Seto E, Usheva A, Zambetti GP. Wild-type p53 binds the TATA binding protein and represses transcription. Proc Nati Acad Sci USA, 89: (1992). 19. Hudson JM, Frade R, Bar Eli M. Wild type p53 regulates its own transcription in a cell-type specific manner. DNA CeJJ Biol, 14(9): ( 1995). 20. Hupp TR, Meek DW, Midgley CA, Lane DP. Regulation of the specific DNA binding function of p53. Celi, 71 : (1992). 21. Leach FS, Tokino T, Meltzer P. p5 3 mutations and MDM2 amplification in human soft tissue sarcomas. Cancer Res 53 Suppl: ( 1993). 22. Maheswaran S, Park S, Bernard A. Physica1 and functional interaction between WTI and p53 protein. Proc Natl Acad Sci USA, 90: ( 1993). 23. Lane DP. A death in the life of p53. Nature, 362: ( 1993). 24. Lee JM, Bernstein A. p53 mutati ons increase resistance to ionizing radiation. Proc Nati Acad Sci USA, 90: (1993). 25. Pavletich NP, Chambers KA, Pabo CO. The DNA-binding domai n of p53 contains the four conserved regions and the major mutation hot spots. Genes Dev, 7: (1993). 26. Cho Y, Gorina S, Jeffrey PD, Pavletich NP. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-dna complex: understanding tllmorigenic mutations. Science, 265:346 (1994). 27. Rainwater R, Parks D, Anderson ME, Tegtmeyer P, Mann K. Role of the cysteine residues in regu1ation of p53 function. Moi Celi Biol, 15(7): (1995). 28. Funk WD, Pak DT, Karas RH, Wright WE, Shay JW. A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes. Moi Celi Biol, 12:2866 (1992). 29. Kern SE. Identification of p53 as a sequence-specific DNA-binding protein. Science, 25 2: 1708 (1991). 30. Rolley N, Butcher S, Milner J. Specific DNA binding by different c1asses of hllman p5 3 mutants. Oncogene, 11(4): (1995). LlGANDASSAY VO L. 1 NU MER04ANNO 1996

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