Meccanismi di attivazione

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1 Meccanismi di attivazione Perché si abbia la trasformazione da proto-oncogene ad oncogene è sufficiente una mutazione in una della due copie geniche a singola dose genica. c-onc mutazione amplificazione traslocazione Cambio strutturale/funzionale Over-espressione o acquisizione di Over-espressione nuove funzioni

2 può essere quantitativa e/o qualitativa Quasi sempre sono mutazioni somatiche (quelle germinali sono per lo più letali) Le modalità di attivazione sono: amplificazione, citogeneticamente evidenziabile come double minute o HSR (Homogenously Staining Regions), es. Myc mutazioni puntiformi, es. Ras traslocazioni cromosomiche che creano geni chimerici, es. cromosoma Philadelphia trasposizione in un dominio di cromatina attiva, es. linfoma di Burkittv

3 Fattori di crescita Recettori di fattori di crescita Membrana citoplasmatica Proteine trasduttrici del segnale Nucleo Fattori trascrizionali Proteine del ciclo cellulare Ciclo di divisione cellulare

4 Proto-oncogèni attivati in tumori Fattori di crescita Catena b del PDGF: sis, Osteosarcomi Fattore di crescita fibroblasti: int2, carc. Vescica, Mammella Membrana citoplasmatica Recettori per fattori di crescita Recettore per EGF: erbb1, carc. Polmone ErbB2, carc. Mammella, Ovaio, Stomaco, Polmone Nucleo Recettore per GDNF: ret, carc. Papillifero Tiroide, Men2A, MEN2B, carc. Midollare Tiroideo Familiare Recettore per CSF-1: fms, Leucemie Ciclo di divisione cellulare

5 Proto- oncogèni attivati in tumori Proteine trasduttrici segnale GTP binding monomeriche: ras, diversi carc. (Colon, Vescica,Tiroide,Pancreas.) Membrana citoplasmatica GTP binding eterotrimeriche: αs, Adenomi Ipofisari Fattori trascrizionali c-myc, N-myc, L-myc, Linfomi, Neuroblastoma, carc. Polmone Nucleo Proteine del ciclo cellulare Cicline D, bcl-1, Adenoma Paratiroideo, Linfomi, carc. Fegato, Mammella, Ciclo di divisione cellulare

6 Category GFs PROTO- Oncogene Mode of Activation Associated Human Tumor PDGF-β chain SIS Overexpression Astrocytoma Fibroblast growth factors Osteosarcoma HST-1 Overexpression Stomach cancer INT-2 Amplification Bladder cancer Breast cancer Melanoma TGFα TGFα Overexpression Astrocytomas Hepatocellular carcinomas HGF HGF Overexpression Thyroid cancer

7 Mutazioni di geni che codificano per fattori di crescita possono rendere questi geni oncogenetici, portano ad una situazione in cui una cellula tumorale produce un fattore di crescita a cui anche risponde, mediante meccanismo autocrinoparacrino. I membri della famiglia del fattore di crescita piastrinico (PDGF) svolgono un ruolo importante durante lo sviluppo embrionale e al mantenimento del tessuto connettivo negli adulti. PDGF una proteina di 30 kda, consiste di due catene polipeptidiche, alfa e beta. Ogni catena del dimero di PDGF interagisce con una subunità del recettore. Andrae J et al. Genes Dev. 2008;22: I PDGF sono spesso prodotte dalle cellule tumorali e possono essere implicato in : Attivazione autocrina: gliomi, sarcomi e leucemie. Attivazione paracrina: tumori epiteliali, dove può essere coinvolti nella transizione epitelio-mesenchimale (EMT) crescita del tumore, l'angiogenesi, invasione e metastasi.

8 PDGF è liberato dalle piastrine durante il processo di coagulazione del sangue e stimola la proliferazione dei fibroblasti. L'espressione costitutiva del prodotto del gene c-sis che codifica per la catena β del PDGF, sembra causare la trasformazione neoplastica con meccanismo autocrino, con proliferazione aberrante. L espressione costitutiva del prodotto del gene sis non è sufficiente a causare la trasformazione neoplastica in fibroblasti che hanno perso il recettore per PDGF

9 PDGF stimola direttamente: (1) proliferazione, (2) EMT, (3) migrazione delle cellule tumorali. (7) Aadapted from Hanahan and Weinberg (2000) 1 (5) (6) (4) Recluta fibroblasti secernenti differenti fattori che stimolano indirettamente: (5) la proliferazione, (6) la migrazione delle cellule tumorali (7) l angiogenesi

10 PDGFR signal transduction and links to the cytoskeleton. The intracellular domains of PDGFR-α and PDGFR-β and some of their direct interactors are illustrated. NHERF= Na + /H + Exchanger Regulatory Factors MERM=merlin and ezrin/radixin/ moezin family of cytoskeletal linkers, Andrae J et al. Genes Dev. 2008;22: FAK=focal adhesion kinase.

11 Glioblastoma: tumore maligno delle cellule gliali. In some gliomas: deletion mutant of the PDGFR-α which is continuously active. 5% - 25% Chronic myelomonocytic leukemia is also caused due to fusion of PDGFR-β gene with the TEL gene in approximately 30% of the cases. Exon 12 mutations of PDGFR-α are responsible for Inflammatory fibroid polyps which represent polypous proliferations with inflammatory infiltration.

12 Principles of pharmacological inhibition of PDGF signalling Inibitori delle kinasi Agiscono legandosi al/o vicino al sito dell ATP nel dominio catalatico: Imatinib (STI571, o Gleevec) inibisce PDGFR-α e PDGFR-β in: leucemia (bcl abl +) e tumori gastrointestinali con mutazioni di c-kit, PDGFR-α in sindromi mieloproliferative con riarrangiamanti del gene PDGFRB, in dermatofibrosarcoma protuberante (con translocazione attivante del gene PDGF-B (Carroll et al. 1997). PDGF possono essere bloccati legando PDGFs con alta affinità con: La possibilità di silenziare farmacologicamente il promoter di PDGF-α è in corso di sperimentazione PDGFR possono essere bloccati con anticorpi o ligandi dominanti negativi 1 anticorpi neutralizzanti 2 acidi nucleici Andrae J et al. Genes Dev. 2008;22: domini extracellulari ricombinanti dimerici solubili di PDGFR

13 Oltre a c-sis, ad esempio, un gruppo di oncogeni che codificano per proteine omologhe al fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) hst-1 codifica una proteina identica a FGF-2. Il protooncogene assume caratteristiche oncogeniche per iperespressione nei tumori gastrici umani. int-2 codifica una proteina identica al fattore di crescita fibroblastico di tipo basico b-fgf identificata con la sigla p27 int-2, o FGF-3. Si ritrova attivato nel carcinoma mammario umano assieme ad altri oncogeni (neu, erb-2 e myc) per amplificazione o superespressione da promotore o da amplificatore forte. Risulta amplificato anche nel carcinoma della vescica e nel melanoma..

14 FGF1 overespressione: in modo paracrino promuove angiogenesi e in modo autocrino promuove la proliferazione cellulare in cancri ovarici. E associato con bassa sopravvivenza FGF2 aumenta nel plasma in associazione a molti cancri; un loop autocrino (FGF2 FGFR1-III) è stato trovato nel carcinoma del polmone non a piccole cellule FGF6 e FGF2 sono up-regolati nei tumori alla prostata FGF7, FGF1 e FGF2 hanno alta espressione nei tumori del seno FGF19 è over-espresso in un sottogruppo di tumori al fegato, colon e polmone

15 Recettori 1 TM Recettori della morte Tirosina-chinasi Serina-Treonina-chinasi Con attività chinasica intrinseca Recettori per gli antigeni Recettori per citochine Senza attività chinasica entrinseca Recettori per citochine

16 Recettori per citochine

17 MALATTIE MIELOPROLIFERATIVE CRONICHE Pluripotent hematopoietic stem cell Tissue Blood Bone Marrow Lymphoid progenitor Myeloid progenitor Megakaryocyte B cell T cell Neutrophil Eosinophil Basophil Monocyte Platelets Plasma cell Effector T cell Mast cell Macrophage Erythroblast Red blood cells

18 Gruppo di patologie derivanti da disordini di cellule staminali clonali, con ematopoiesi non controllata Stem Cell Myeloid progenitor Proliferation defects Differentiation defects Chronic Myeloproliferative Disorders Acute Leukemias Possono trasformarsi l una nell altra

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20 LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA ESPANSIONE PREVALENTE DELLA GRANULOPOIESI, G-CSF-INDIPENDENTE POLICITEMIA VERA ESPANSIONE PREVALENTE DELL ERITROPOIESI, ERITROPOIETINA-INDIPENDENTE TROMBOCITEMIA ESSENZIALE ESPANSIONE PREVALENTE DELLA PIASTRINOPOIESI MIELOFIBROSI con COM MMSE (metaplasia mileoide) ESPANSIONE EXTRAMIDOLLARE DI TUTTA L EMOPOIESI, CON FIBROSI DEL MIDOLLO

21 JAK2-V617F è costitutivamente attivata JH2 è responsabile dell inibizione dell'attività catalitica di JAK2. La mutazione di JAK2 nell esone 12 -JAK2V617F- causa l attivazione costitutiva di JAK2 E la mutazione più diffusa nelle neoplasie mieloproliferative BCR/ABL-negative con una frequenza mutazionale: 96% nella policitemia vera, 55% nella trombocitemia essenziale 65% in mielofibrosi primaria.

22 JAK2V617F signalling pathways in myeloproliferative neoplasms Quando JAK2V617F è espresso in cellule ematopoietiche, diverse vie di segnalamento importanti per la proliferazione e la sopravvivenza sono attivate STAT3 è costitutivamente attivato nella policetimia vera (PV) STAT5 è attivato nei megacariociti e nei progenitori CD34+ nei pazienti con mielofibrosi primaria.

23 L eritropietina (Epo) ed il suo recettore (Epo-R) sono cruciali per la formazione degli erotrociti In loro assenza, i progenitori eritroidi committed subiscono l apoptosi allo stadio di CFU-E e proeritroblasti Le conseguenze di questa cascata di eventi è la sopravvivenza, proliferazione e differenzazione dei progenitori eritroidi Aumento della massa eritrocitaria

24 Nel nucleo, JAK2 fosforila istone H3 (in H3Y41). La fosforilazione H3Y41 riduce l'affinità di H3 ad Heterochromatin Protein 1 (HP1α). La via JAK2-H3Y41-HP1α lega l'attività della JAK2 alla fosforilazione degli istoni, all'architettura della cromatina in regioni promotore specifico, l'espressione genica aberranti, l'instabilità del genoma ed oncogenesi. T HP1 sono proteine fondamentali per l impacchettamento della eterocromatina nei centromeri e nei telomeri Fra i geni regolati da JAK2-STAT5, LIM domain only 2 (LMO2 ) è coinvolto nella normale emopoiesi.

25 LMO2 è overespresso in casi spontanei di T-ALL (T-acute lymphoblastic leukaemia) - Codifica per una LIM-only protein (LMO2), attiva su vari fattori di trascrizione - è un oncogene abbastanza T-specifico (anche se non è indispensabile per lo sviluppo dei T, ma lo è per gli stadi precoci dell ematopoiesi) Come l iperespressione di LMO2 facilita la trasformazione tumorale? Il LIM domain Un dominio ricco di zinc finger dedicato a interazioni proteiche Attraverso queste interazioni vengono assemblati complessi trascrizionali.

26 Minton Nature Reviews Immunology 9, 149 (2009) The link between inflammation and cancer Aumentata attività di STAT3 in cellule progenitrici ematopoietiche promuove la generazione di cellule mieloidi immature (IMC), aumenta il numero di cellule dendritiche immature e cellule dendritiche plasmacitoidi (pdc), e quindi l'accumulo di T regolatori (Treg), nel microambiente tumorale. Apoptosi Effetti CD8+dipendente INF Fattori associati al tumore quali: vascular endothelial growth factor (VEGF), IL-10 e IL-6 sono regolatori di STAT3. IFN di tipo I STAT3 inibisce l espressione di MHCII, CD80, CD86 e IL-12, impedendo la loro maturazione e compromettere la loro capacità di stimolare gli effetti antitumorali delle cellule T CD8+ e NK. Yu et al. Nature Reviews Immunology 7,

27 Foxp subfamily members contain a zinc finger domain, a leucine zipper motif and a forkhead domain and their DNA binding capacities and transcriptional activities are regulated by homoand heterodimerization via a zinc finger and a leucine zipper motif. Yu et al. Nature Reviews Immunology 7, (January 2007) Cellular transformation by activated Stat3 occurs through the transcriptional regulation of specific genes. Many Stat3 target genes are those encoding the antiapoptotic proteins Bcl-xl, Mcl-1, and Bcl-2, the proliferation-associated proteins Cyclin D1 and Myc, and the proangiogenic factor VEGF. In addition, STAT3 cooperates with c-jun to repress expression of FAS, presumably interfering with cancer cell apoptosis. Still other genes must be regulated indirectly by STAT3, many of which may contribute to oncogenesis or tumor progression.

28 Negative regulation of Jak/Stat pathway a. cytoplasmic phosphatases: SHP-1 contains two SH2 domains and bind to phosphorylated JAKs or phosphorylated receptors to facilitate dephosphorylation of these activated signaling molecules. a. SOCS (suppressor of cytokine signalling) c. nuclear phosphatases d. PIAS The protein inhibitor of activated STAT (PIAS) protein family e. naturally occurring short-form of Stat as dominant negative mutant Levy DE & Darnell JE Jr Nat. Rev. MCB (2002) 3:

29 STAT3 SONO COSTUTIVAMENTE ATTIVATI IN MOLTI CANCRI. I modi di attivazione includono sovra-espressione o disregolazione della chinasi o inibizione dei regolatori negativi. = Jak Subunità oncogenica di Gαo (AngIIR,trombinR) collegata a Jak, porta ad iperattivazione di Stat3 e la trasformazione delle NIH3T3. Sovraespressione EGFR e del suo ligando TGF-α stimola l'attività chinasica del recettore e quella che collegata Jak a Src, attivando Stat3 nei carcinomi a cellule squamose. Sovraespressione e TEL-JAK proteina chimerica constitutivamente attiva. STATs 1, 3, 5 Acute myeloid leukemia (AML) Perdita di espressione PIAS3 permette attivazione di STAT3 in linfoma anaplastico a grandi cellule disregolazione del recettore IL-6 e del suo ligando attiva Stat 3 nel mieloma multiplo. Oncogeni Src e Abl provocano iperfosforilazione di Stat3 fosforilazione in sarcomi, leucemia mieloide cronica e altri tumori maligni. Silenziamento di SOCS1 x metilazione genica e JAK1,2 costitutivamente attive porta alla fosforilazione di STAT3 persistente in epatocarcinomi.

30 La anormale espressione o mutazioni genetiche a carico delle SOCS sono implicati in varie malattie: infettive e autoimmuni. Ma anche nei tumori, controllare la loro espressione e funzione sarà utile per sviluppare nuove terapie per queste malattie.

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32 leucemia tumours with constitutive STAT3 activation arising from autocrine IL-6 stimulation 63 IL-2-mediated human T cell blast proliferation, PV

33 Recettori 1 TM Recettori della morte Tirosina-chinasi Serina-Treonina-chinasi Con attività chinasica intrinseca Recettori per gli antigeni Recettori per citochine Recettori per gli Senza antigeni attività chinasica entrinseca

34 Processing and extracellular retention of the PDGFs. (Top panel) Through alternative splicing, PDGF-A may be translated into a protein with or without a retention motif (green). Andrae J et al. Genes Dev. 2008;22: by Cold Spring Harbor Laboratory Press