Strumenti diagnostici a supporto del monitoraggio

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1 Strumenti diagnostici a supporto del monitoraggio Monitoraggio e uso sostenibile dei prodotti fitosanitari: le attività del servizio fitosanitario M. Calvi e A. Taddei Servizio Fitosanitario Regionale 29 Maggio 2014, Milano Laboratorio Fitopatologico SFR c/o, Quality Certification Scheme ISO 9001:2008

2 Strumenti diagnostici a supporto del monitoraggio Il monitoraggio delle malattie da quarantena ed emergenti è tra i compiti primari del SFR La corretta identificazione della malattia e dell agente patogeno o parassita è il primo step di un monitoraggio efficace Le analisi eseguite in laboratorio consentono in alcuni casi il rilevamento precoce di una malattia (assenza di sintomi, fase iniziali della malattia, sintomi ascrivibili a diversi agenti patogeni etc)

3 IL LABORATORIO del SFR Regione Lombardia Laboratorio Fitopatologico, è laboratorio ufficiale del SFR Sede in a Vertemate con Minoprio, CO Inizio dell attività nell anno 2003

4 Principali campi di azione del LABORATORIO FITOPATOLOGICO Attività istituzionali Consulenze a privati ed aziende Collaborazione al monitoraggio Progetti di ricerca Prove di campo

5 ATTIVITA ISTITUZIONALI Diagnosi di organismi nocivi da quarantena (decreti di lotta obbligatoria, misure d emergenza, monitoraggi ufficiali) e non Supporto ai controlli degli I.F. nei vivai iscritti a RUP/RUF Supporto attività controlli in import (punti di ingresso comunitari) Certificazione sanitaria per esportazione

6 CLIENTI PUBBLICI E PRIVATI Enti pubblici Corpo Forestale dello Stato Comunità Montane Parchi regionali Uffici del verde e Uffici tecnici comunali E.N.S.E Associazioni onlus Enti e categorie privati Professionisti del verde Vivaisti floricoltori Orticoltori, frutticoltori, viticoltori Privati cittadini

7 ORGANIGRAMMA E RESPONSABILI Dal 2008 è azienda con Sistema di Qualità certificato ISO 9001:2008

8 SEZIONI DIAGNOSTICHE DEL LABORATORIO Virus, viroidi e fitoplasmi Funghi Insetti e Acari Batteri Nematodi

9 REQUISITI DELLE ANALISI UFFICIALI DEL SFR Specificità, sensibilità, accuratezza e rapidità di risposta Le analisi ufficiali di patogeni da quarantena possono essere eseguite solo da laboratori ufficiali In casi particolari possono essere affidate a laboratori esterni autorizzati su incarico del SFR, secondo protocolli definiti dal laboratorio ufficiale del SFR

10 PUNTI CRITICI DEL PROCESSO DIAGNOSTICO -Campionamento -Accettazione e lavorazione -Protocollo analitico -Materiale di riferimento -Attrezzature e strumenti di indagine -Personale qualificato Tenuti sotto controllo dal Sistema di Qualità

11 IL CAMPIONAMENTO Epoca fenologica e/o stagionale - influenza l espressione dei sintomi (periodi di latenza) - determina la possibilità di rinvenimentodel patogeno Tipo e dimensione del campione - localizzazione del patogeno nella pianta/lotto/partita - metodo di analisi (possibilità di campioni pool) Disinfezione di arnesi da taglio Comportamento asintomatico Corretta conservazione fino all analisi

12 IL PROTOCOLLO DIAGNOSTICO I seguenti fattori influenzano la scelta del protocollo: 1. Specifiche caratteristiche dell organismo patogeno (biologia, presenza nel substrato/ospite vegetale ) 2. Tipo di campione (substrato/ospite vegetale) 3. Epoca di prelievo del campione 4. Lo scopo dell analisi (diagnosi o detection) Tecniche e motodi di indagine fitopatologica: 1. Tecnica o metodologia (morfologica, sierologia, molecolare.) 2. Metodo (DAS-ELISA, IFA, PCR, RT-PCR.)

13 IL PROTOCOLLO DIAGNOSTICO Protocolli ufficiali ministeriali, pubblicati in gazzetta - Ralstonia solanacearum, Commission directive 2006/63/CE, 14 July 2006 (Official Journal of the European Union, 27/07/2006) - Erwinia amylovora, D.M. 10 settembre 1999, n. 356 (G.U. 243, 15/10/1999) - Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Direttiva 93/85/CEE del Consiglio 04/10/1993, modificata dalla Direttiva 2006/56/CE della Commissione del 12/06/ Virus della vite da materiali di moltiplicazione vegetativa, D.M. 13/12/2011 (GU 50, 29/02/2012) MA NON SEMPRE DISPONIBILI! - Eterogeneità dei protocolli - Livelli diversi di sensibilità/affidabilità dell analisi - Difficoltà di comparazione dei risultati

14 IL PROTOCOLLO DIAGNOSTICO Protocolli di analisi validati e accreditati da organismi internazionali preposti (ISTA, EPPO, CSL etc.) ISTA http: ISHI http: EPPO European and Mediterranean Plant Protection Organitation, Parigi: Diagnostic protocol for regulated pest CSL Central Science laboratory DIAGPRO Diagnostic protocols UK: e nazionali Progetto ARON- ARNADIA Atti Progetto POM A32, 2001 Validazione e trasferimento alla pratica agricola di norme tecniche per l accertamento dello stato sanitario di specie ortofrutticole per patogeni pregiudizievoli alla qualità delle produzioni vivaistiche

15 VERIFICA DELLA CAPACITA DIAGNOSTICA Ring test nazionali e internazionali (CRA di Roma) Proficiency test ciechi (FAPAS, FERA di York, GB) Validazione interna e verifica di affidabilità del saggio grazie a - Controlli positivi costituiti da materiale di riferimento acquistato da Banche di microrganismi e colture cellulari certificate riconosciute internazionalmente (DSMZ, NCPPB) o forniti insieme a kit diagnostici (DAS-ELISA Bioreba)

16 PERSONALE TECNICO Discipline agrarie, fitopatologiche, biotecnologiche Costante aggiornamento e formazione Valutazione delle competenze attraverso proficiency test

17 METODI DIAGNOSTICI Virus, viroidi e fitoplasmi Funghi Insetti e Acari Batteri Nematodi

18 FUNGHI Osservazione al m.o. della morfologia delle strutture riproduttive Isolamento su terreni di coltura PCR con marcatori molecolari specifici PCR con marcatori molecolari universali su gene ribosomale ITS, LSU (large ribosomal subunity), SSU (small ribosomal subunity), ß tubulina, elongation factor tef1- alfa, sequenziamento dell amplificato e confronto in GenBank

19 Phytophthora ramorum 2000/29/CE All. I e II, EPPO A2 Foto:Tantardini Foto:Tantardini Foto:Tantardini

20 Phytophthora ramorum 2000/29/CE All. I e II, EPPO A2 Sporangi Foto:Tantardini Clamidospore Osservazione microscopica P. ramorum presenta ife altamente ramificate, contorte, dendritiche; le clamidospore sono prodotte agli apici ifali e sono dapprima ialine poi bruno-rossastre. Gli sporangi sono semi papillati e si presentano in cluster.

21 Phytophthora ramorum 2000/29/CE All. I e II, EPPO A2 Colonia di P.ramorum Tecniche di isolamento P. ramorum viene isolata utilizzando uno speciale terreno selettivo per oomiceti, PARP-agar (Storer et al., 2001.). Le colonie vengono lasciate crescere le colonie al buio per 7 giorni a C. La caratterizzazione morfologica avviene attraverso il confronto con colonie del ceppo di riferimento fatte crescere in Corn Meal agar o Agar V-8.

22 Phytophthora ramorum 2000/29/CE All. I e II, EPPO A2 Biosaggio Inoculazione del fungo su foglie di specie sensibile (Rhododendron sp.), incubazione in camera umida in attesa della manifestazione di aree necrotiche (controllo negativo costituito da foglie inoculate con acqua)

23 BATTERI Isolamento su terreni generici e selettivi (agar+ sostanze nutritive + antibiotici) Confronto con colonie di riferimento Saggi sierologici (ELISA e IFA) Saggi molecolari (PCR) R. solanacearum su SMSA C. michiganensis m. su SCM X. arboricola pruni su YDC

24 Erwinia amylovora Prelievo da campione sintomatico Cruciale l individuazione dei cancri corticali, in corrispondenza dei quali rimuovere la corteccia e prelevare il legno imbrunito sottostante (punto di passaggio tra sano e malato)

25 Erwinia amylovora Isolamento su terreno semi-selettivo Estratto batterico piastrato su agar nutritivo con saccarosio (NSA): formazione di colonie biancastre, levaniformi, lucide, di aspetto mucoso, 3-5 mm Colonie di E.amylovora su NSA dopo 4 giorni a 23 C

26 Erwinia amylovora Saggio di conferma molecolare o sierologico - PCR PCR diretta secondo su protocollo sospensione EPPO della PM7/20 colonia - Test sierologico I.F.A. (Immuno Fluorescent Assay), osservazione al microscopio ottico a fluorescenza dei batteri dopo colorazione con anticorpi specifici

27 Erwinia amylovora Prove di patogenicità Reazione di ipersensibilità su piantine di Nicotiana tabacum Produzione di essudati su tasselli di perine immature varietà Conference e/o Williams; Emissione di essudati lattiginosi dopo 3-5 giorni a 27 C

28 FITOPLASMI Visibili al microscopio ottico ed elettronico Non coltivabili in vitro facilmente Identificabili solo mediante analisi di laboratorio Saggi biomolecolari (PCR e real-time PCR) Digestione con enzimi di restrizione (Restriction Fragment Lenght Polymorphism, RFLP)

29 Giallumi della vite Flavescenza dorata FD 16Sr(V)-C/D Candidatus phytoplasma vitis Legno Nero LN 16Sr(XII)-A Stolbur Giallume dell astro AY 16Sr(I)-B Aster Yellow

30 Giallumi della vite Estrazione del DNA Prelievo del floema da foglie sintomatiche; Omogeneizzazione del tessuto vegetale in tampone CTAB 3%; Estrazione degli acidi nucleici (Kit di estrazione o protocollo chimico)

31 Giallumi della vite Polymerase Chain Reaction (PCR) tecnica che consente di sintetizzare ripetutamente (= amplificare) per via enzimatica uno specifico segmento di DNA situato tra due regioni di sequenza nucleotidica nota (primer), producendone un numero elevatissimo di copie (crescita esponenziale) Reagenti specifici

32 Giallumi della vite Elettroforesi in gel Caricamento dei campioni amplificati su gel di agarosio Il gel viene sottoposto a campo elettrico (polo positivo e polo negativo) Il DNA amplificato migra all interno del gel verso il polo positivo, con velocità inversamente proporzionale alla lunghezza del frammento

33 Giallumi della vite Visualizzazione al transilluminatore Visualizzazione delle bande di DNA amplificato attraverso irradiazione con raggi UV (sostanze chimiche intercalanti del DNA emettono fluorescenza se eccitate con raggi UV) La presenza di una banda fluorescente della lunghezza corretta significa che il frammento genico «target» (nel nostro caso, una sequenza del patogeno) è stato amplificato

34 Giallumi della vite PCR con primer gruppo-specifici distinti per FD e LN Taglio enzimatico (enzimi BfaI e MseI) per distinguere il tipo di fitoplasma (FD, LN, AY, EY): profili specifici e identificativi dei diversi fitoplasmi in termini di numero di bande e loro posizione sul gel

35 Giallumi della vite Real-time PCR I risultati sono visualizzati in tempo reale Veloce: utilizza un solo ciclo di PCR Sensibile: rileva la presenza anche di 1 sola molecola di DNA target

36 Giallumi della vite LN in vinca viti positive a LN

37 VIRUS e VIROIDI Visibili al microscopio elettronico Non coltivabili in vitro Identificabili solo mediante analisi di laboratorio Molecolare PCR e RT-PCR Sierologico E.L.I.S.A. (NON per viroidi)

38 VIRUS Saggio sierologico E.L.I.S.A. (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Sfrutta la proprietà di anticorpi specifici di legare un particolare antigene (capside proteico virale) Il viraggio di colore è dato dalla reazione di una soluzione substrato con l enzima fosfatasi alcalina, coniugato all anticorpo.

39 VIRUS Saggio sierologico E.L.I.S.A. Il viraggio di colore è dato dalla reazione di una soluzione substrato con l enzima fosfatasi alcalina, coniugato all anticorpo. Misurazione dei valori di assorbanza in lettore ELISA (fotometro)

40 VIRUS e VIROIDI Saggio molecolare RT-PCR (Reverse transcriptase PCR) Necessario fase preliminare di retro-trascrizione del RNA a DNA con enzimi specifici RNA DNA PCR PSTVd su solanacee ornamentali

41 NEMATODI Competenza nuovo per il laboratorio SFR di Minoprio (trasferimento dal laboratorio di Pavia) Analisi morfometrica mediante osservazione stereomicroscopica di nematodi fitoparassiti estratti da diverse matrici (suolo, materiale vegetale) Collaborazione con specialisti ed esperti nazionali Prevista l implementazione di saggi biomolecolari di conferma interna

42 NEMATODI Estrazione dalla matrice (suolo, materiale vegetale) Estrazione di Aphelenchoides besseyi da riso

43 NEMATODI Analisi morfometrica Misurazione di caratteri morfologici allo stereomicroscopio, con l ausilio di software ad hoc Misura di cisti e cono vulvare di Heterodera glycines

44 NEMATODI Analisi morfometrica Misurazione di caratteri morfologici allo stereomicroscopio, con l ausilio di software ad hoc Misurazione dello stiletto in campioni larvali Saggio di conferma molecolare PCR Amplificazione genica di DNA estratto da un singolo nematode o da pool di larve, successivamente sottoposto a taglio con enzimi di restrizione

45 INSETTI Analisi visiva allo stereomicroscopio per il riconoscimento di caratteri morfologici Allevamento di stadi larvali PCR con marcatori molecolari specifici PCR con marcatori molecolari universali su geni mitocondriali cytochrome oxidase (COI, COII), Internal transcribed Spacer (ITS1, ITS2) e ribosomali (28S subunit) e sequenziamento 45

46 Anoplophora chinensis Figure 3 - Electrophoresis gel of amplified DNA fragments (primer ChinensisF/ChinensisR) from larval frass samples; A. bungii frass (92, 93), A. chinensis frass (1059, 1060, 1061), water (W). Molecular weight marker: Promega BenchTop 100bp DNA Ladder. Amplificazione genica -PCR con primer universali e specifici su campioni larvali -PCR con primer specifici su campioni di rosura -Sequenziamento e confronto in banche dati (GenBank)

47 Anoplophora chinensis 100% identity with A. chinensis

48 Anoplophora chinensis Conferma della specificità del saggio Valutazione dell effettiva specificità dei primer su campioni di riferimento identificati con certezza come altri cerambicidi W Figure 1 Electrophoresis gel of amplified DNA fragments (primer ChinensisF/ChinensisR) from adult and larval specimen of Cerambycidae, DNA diluited 1:100 (first row) and not diluited (second row); A. chinensis adults (56A, 56B, 56C, 56D), A. glabripennis (2A, 5A), Monochamus sp., (69), Mesosa nebulosa (71), Aromia moschata (84), Prionus coriarius (85), Xylotrechus stebbingi (86), Psachotea hilaris (87), Aromia bungii (95), Lepidoptera larva (31), A. chinensis larvae (4A, 4B, 4C, 19A), water (W). Molecular weight marker : Promega BenchTop 100bp DNA Ladder.

49 Tecnologia L.A.M.P. Loop Mediated Isothermal Amplification Amplificazione di acidi nucleici a temperatura costante Tempi rapidi di risposta Estrema specificità del saggio Potenziale uso di campo per screening Testato in Laboratorio SFR per: - Erwinia amylovora - Phytophthora ramorum - Guignardia citricarpa - Chalara fraxinea

50 Laboratorio fitopatologico SFR c/o v.le Raimondi 54 Vertemate con Minoprio CO Dr. Andrea Taddei Laboratorio Fitopatologico SFR Regione Lombardia c/o Dr.ssa Marica Calvi Laboratorio Fitopatologico SFR Regione Lombardia c/o Marica_Calvi- Laboratorio Fitopatologico SFR c/o, Quality Certification Scheme ISO 9001:2008