Kit e prodotti per lo studio dell apoptosi

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1 Guida alla scelta UNA VASTA SCELTA DISPONIBILE IN COMMERCIO Kit e prodotti per lo studio dell apoptosi Per rilevare l apoptosi in diverse fasi del processo e distinguerla dalla necrosi è disponibile un ampia gamma di saggi basati su tecniche di analisi morfologica, immunoenzimatiche e molecolari, tra cui rientrano anche la PCR multiplex e l uso di array. E vastissima la scelta di anticorpi, di peptidi e agenti per l induzione o l inibizione dell apoptosi, marcati con coloranti fluorescenti, chemiluminescenti o per determinazione colorimetrica. DI SILVIA GUENZI La maggior parte delle cellule eucariotiche ha la capacità di auto-distruggersi mediante l attivazione di un programma di suicidio che prende il nome di morte cellulare programmata (Programmed Cell Death, PCD) o apoptosi. Questo termine fu coniato da Kerr che nel 1972 pubblicò il primo lavoro su questo fenomeno proprio per distinguerlo dalla necrosi, in cui le cellule si gonfiano e si lisano rilasciando il materiale citoplasmatico nell ambiente circostante, tra cui enzimi lisosomiali che provocano infiammazione. Diversamente dalla necrosi, l apoptosi è un processo strettamente controllato che richiede l attiva partecipazione della cellula destinata a morire e non dà luogo a fenomeni infiammatori, poiché non si ha versamento di contenuto citosolico all estrerno (Tab. 1). Coinvolta in diversi fenomeni quali l embriogenesi, la selezione timica e la risposta immunitaria, la PCD svolge un ruolo di regolazione in quanto permette l eliminazione delle cellule prodotte in numero eccessivo, che sono sfuggite ai meccanismi di controllo del processo di sviluppo cellulare o che hanno subìto un danno genetico. In condizioni patologiche si può avere una deregolazione dell apoptosi e si distinguono due casi: patologie associate a un aumento della sopravvivenza cellulare (diminuzione dell apoptosi) come avviene nei tumori, oppure patologie caratterizzate da un eccesso di morte cellulare programmata, come per le malattie virali o neurodegenerative (AIDS, malattia di Alzheimer, morbo di Parkinson ecc.). In commercio è disponibile un ampia scelta di prodotti per lo studio dell apoptosi sia in cellule in coltura e in situ. Questi prodotti permettono di rilevare tutte le fasi di tale complesso processo: da eventi precoci, come il cambiamento del potenziale di membrana mitocondriale, fino a eventi tardivi come la frammentazione del DNA cromosomale. Cambiamenti morfologici in cellule apoptotiche L apoptosi segue una precisa sequenza di eventi biochimici che produce ben definiti cambiamenti morfologici della cellula e ciò permette di individuare la cellula apoptotica all interno di una popolazione di cellule non apoptotiche. La cellula apoptotica perde rapidamente volume condensandosi, si stacca dalle cellule vicine perdendo l asimmetria dei fosfolipidi che caratterizza la membrana plasmatica, la quale espone componenti normalmente nascoste o poco espresse. Queste sono riconosciute dalle cellule vicine, che operano la fagocitosi della cellula morente. L organizzazione interna è mantenuta, almeno nelle fasi precoci del processo, mentre a livello nucleare si osserva la disgregazione del nucleolo, la condensazione e il taglio internucleosomale della cromatina in frammenti di paia di basi o multipli di questi (riconosciuto come DNA ladder ) Granuli compatti di cromatina degradata si spostano verso la periferia del nucleo, formando spesso una caratteristica figura a mezzaluna. Frammenti discreti di materiale nucleare raggiungono in seguito la membrana plasmatica, dove vengono circondati da evaginazioni della membrana che conferiscono alla cellula un aspetto a bolle (blebbing). Queste blebs si staccano dal corpo cellulare trascinando con sé parte del citoplasma e del materiale nucleare, dando origine ai cosiddetti corpi apoptotici che vengono fagocitati dalle cellule vicine (Fig. 1), senza dar luogo a fenomeni infiammatori. LE FASI DEL PROOCESSO APOPTOTICO In base agli studi sul nematode Caenorabditis elegans in cui per primo sono stati identificati i meccanismi molecolari dell apoptosi - risultati poi ampiamente conservati lungo la scala evolutiva dal verme fino all uomo - si è stabilito di suddividere il processo apoptotico in 4 fasi: 1) induzione, 2) esecuzione, 3) riconoscimento e fagocitosi del corpo cellulare, 4) degradazione dello stesso da parte della cellula fagocitica. Nella fase di induzione la cellula riceve il segnale di attivazione al programma di morte e si indirizza in tale direzione. Segue una fase di esecuzione che può essere suddivisa a sua volta in due fasi: una fase di amplificazione - che implica l attivazione di molteplici proteasi aspartato specifiche contenenti cisteina dette caspasi - e una fase di demolizione, che consiste nella distruzione mediata dalle caspasi della struttura cellulare. Fig. 1 - Le caratteristiche morfologiche cellulari che caratterizzano l apoptosi sono la condensazione e la frammentazione della cromatina, la vescicolazione della membrana e la formazione dei corpi apoptotici (Prodotti Gianni - Bender MedSystems). Fig. 2 Il processo di formazione dell apoptosoma (Sigma Aldrich). INDUZIONE DELL APOPTOSI Pathway intrinseco ed estrinseco L apoptosi può essere indotta da una varietà di stimoli, tra cui radiazioni UV o gamma, danno ossidativo, farmaci chemioterapici, privazione di fattori di crescita e molecole rilasciate da cellule T citotossiche, come le citochine TNF-α e TGF-β. L apoptosi è regolata da due pathway specifici - intrinseco ed estrinseco la cui attivazione dipende dal tipo di stimolo che induce il fenomeno. Il pathway intrinseco parte dai mitocondri come conseguenza di radiazioni, danni redox e farmaci che danneggiano direttamente il DNA. Le fasi di questo pathway comprendono il cambiamento di permeabilità della membrana mitocondriale è dovuto alla sua depolarizzazione e il conseguente rilascio di citocromo c nel citosol attraverso il cosiddetto PTPC (Permeability Transition Pore Complex). Il processo culmina con la formazione di un grosso complesso proteico l apoptosoma composto da procaspasi 9, apaf-1 e citocromo c, e con l attivazione delle caspasi (proteinasi cisteinil aspartato-specifiche) che hanno un ruolo chiave nella regolazione e nell esecuzione dell apoptosi (Fig. 2). Il pathway estrinseco è attivato dall interazione di specifici ligandi con i propri recettori di membrana detti death receptors perché contengono nella parte intracellulare dei death domain (DD). Il legame del ligando con il recettore stimola l oligomerizzazione di questi tramite i 8 - Biotecnologie Febbraio 2006

2 Kit e prodotti per lo studio dell apoptosi Apoptosi morte delle singole cellule indotta da stimoli fisiologici nello stadio precoce di apoptosi vi è fagocitosi da parte dei macrofagi o delle cellule adiacenti nessuna risposta infiammatoria blebbing della membrana integra formazione di corpuscoli apoptotici aggregazione della cromatina contrazione della cellula e degli organelli gli organelli rimangono intatti processo altamente regolato ATP-dipendente frammentazione del DNA in frammenti di DNA di lunghezza distinta frammentazione prelitica del DNA Tab.1 - Caratteristiche che distinguono l apoptosi dalla necrosi loro DD: a questo punto i recettori legano proteine citosoliche ad attività adattatrice contenenti anch esse un death domain che, mediante i propri death effector domains (DED), attivano la cascata delle caspasi che porta all esecuzione dell apoptosi. Il due pathway intrinseco ed estrinseco (Fig. 3) in genere si sovrappongono, condividendo parecchie molecole sia regolatorie sia effettrici. Pathway estrinseco: death receptors e ligandi I death receptors sono membri della famiglia dei recettori TNF, tra cui Fas, TNFR di tipo 1, TRAIL-R1 (DR-4). Interazione di Fas con Fas-L Fas, precedentemente indicato anche come APO-1 e ora classificato come CD95, è una proteina di superficie appartenente alla superfamiglia dei recettori del TNF- NGF. Quando lega il suo specifico ligando, Fas-L, è in grado di indurre l oligomerizzazione del recettore Fas, che provoca il reclutamento della proteina citosolica adattatrice Fas associata con death domain (FADD), A sua volta FADD si lega a una caspasi, indicata col numero 8 (precedentemente nota come FLICE/MACH) che dalla condizione di pro-caspasi passa allo stato attivato. L attivazione della caspasi 8 porta all attivazione a cascata di altre caspasi, portando alla fine all idrolisi dei loro substrati citosolici e nucleari, e quindi all esecuzione dell apoptosi. Significato fisiologico Morfologia Processi biochimici Fig. 3 - I principali pathway cellulari di induzione e inibizione dell apoptosi mediata dal death receptor Fas (Sigma Aldrich). Legame di TNF-alfa a TNF-RI Il legame tra TNF-α e il death receptor TNF-RI porta al crosslinking di tre recettori. Segue il coinvolgimento di diverse proteine intracellulari, l attivazione della p53 e l induzione dell apoptosi. Interazione di TRADD con TNFR-1 TRADD (TNF receptor associated death domain) è una molecola segnale che interagisce direttamente con il dominio citoplasmatico del TNFR di tipo 1. L over espressione di TRADD è sufficiente a indurre due risposte: l apoptosi e l attivazione del fattore NFkB. Legame di TRAIL con i suoi recettori I pathway di apoptosi mediati da TRAIL implicano l attivazione del fattore di trascrizione NFkB e di diverse caspasi. Sono stati scoperti differenti recettori di TRAIL che attivano i pathway TRAIL, tra cui DR3, DR4 e DR5. Altre vie di induzione dell apoptosi Un altra importante causa di apoptosi è la riduzione di disponibilità di molecole di ATP. È stato infatti dimostrato che esiste un rapporto tra la forma difosfata e quella trifosfata dei nucleotidi adeninici (1:5) al di sotto della quale la cellula va incontro a morte. Se il calo di ATP è massiccio e improvviso, la cellula muore per necrosi, se invece è più moderato, per apoptosi. All inizio del processo apoptotico si verifica un aumento dell ADP cellulare ma senza una diminuzione apprezzabile del livello di ATP. Mano a mano che aumenta il tempo di Necrosi morte di gruppi di cellule indotta da eventi patologici fagocitosi da parte dei macrofagi risposta infiammatoria perdita dell integrità della membrana lisi completa nessuna aggregazione della cromatina crescita della cellula e degli organelli lisi processo non regolato nessuna energia richiesta digestione casuale del DNA frammentazione postlitica del DNA esposizione agli agenti tossici induttori di apoptosi, il livello di ADP continua ad aumentare e quello di ATP inizia a diminuire. Così, la progressione dall apoptosi fino alla necrosi secondaria porta ad un aumento del rapporto ADP/ATP. Anche la deregolazione di importanti messaggeri intracellulari, quali il Ca 2+ e di enzimi regolatori quali la proteinchinasi C (PKC) può indurre apoptosi in un ampia varietà di tipi cellulari. Un aumento dei flussi intracitoplasmatici di Ca 2+ avviene molto precocemente, quando la cellula è ancora vitale, e può derivare sia dall influsso di tale ione dal mezzo extracellulare, sia dal suo rilascio dai siti di sequestro intracellulari. Sono stati identificati molteplici sostanze che agiscono da induttori dell apoptosi che sono utilizzati per indurre sperimentalmente il processo di morte cellulare in modo tale da poterlo poi studiare. Tra questi rientrano: Staurosporina, Actinomicina D, Cisplatino, Colchicina, Cicloesimide, Ciclosporina A, perossido di idrogeno ecc. LA FASE DI ESECUZIONE La cascata delle caspasi La fase di esecuzione sembra essere comune a tutte o quasi le vie d innesco ed è costituita da una serie di reazioni enzimatiche a cascata che portano alla morte cellulare. Come abbiamo visto, gli enzimi coinvolti sono le caspasi: a differenza del C. elegans in cui è presente una sola caspasi (CED- 3), nell uomo ne sono state identificate diverse (14 nei mammiferi), appartenenti a tre sottofamiglie, una delle quali - quella che comprende caspasi 3, 6, 7, 8, 9, e 10 - è coinvolta nell apoptosi. L attribuzione di un numero a ogni caspasi è un evento abbastanza recente; poiché alcune aziende e certi ricercatori continuano a chiamare le caspasi con le precedenti denominazioni, nella tabella 2 abbiamo messo a confronto la vecchia e la nuova nomenclatura. Le caspasi che si suddividono in attivatrici ed esecutrici - sono presenti in forma inattiva nel citoplasma; l attivazione consiste nel taglio di queste in due subunità, in risposta a stimoli di natura apoptotica. Ognuna di esse è attivata dalla precedente e attiva la seguente, fino ad arrivare al taglio dei substrati finali che includono proteine coinvolte nella riparazione e duplicazione del DNA, nello splicing dell RNA, nella divisione cellulare, nella frammentazione del DNA ecc. Caspasi attivatrici Nella cascata delle caspasi meglio caratterizzata, le caspasi iniziatrici o attivatrici sono le caspasi-2, -8, -9, -10 e -12. La caspasi 8 è la caspasi iniziale attivata in risposta all interazione tra FADD/TRADD e i recettori dotati di death domain, come Fas e TNF-R1, ed è la caspasi più a monte nella cascata delle caspasi. La caspasi 8 attivata attiva anche Bid che a sua volta attiva due membri della famiglia pro-apoptotica Bcl-2: Bax e Bak (Fig. 3). Questi promuovono la permeabilità mitocondriale in seguito alla quale si verifica il rilascio di fattori apoptogenici dallo spazio intermembrana al citosol. Uno di tali fattori è il citocromo c, che induce l attivatozione di caspasi che portano definitivamente all apoptosi producendo un danno nucleare (frammentazione del DNA). La caspasi-9 (conosciuta anche come ICE- LAP6 o Mch-6) agisce come una caspasi iniziatrice che taglia le caspasi effettrici rendendole attive e poi taglia diverse proteine cellulari conducendo all esecuzione dell apoptosi. Icome anticipato, il citocromo c rilasciato dai mitocondri promuove l attivazione della caspasi-9 tramite la formazione di un complesso con l Apaf-1 in presenza di datp, che a sua volta induce a cascata l attivazione della caspasi-3 (Fig. 2). Caspasi effettrici Le caspasi effettrici, caspasi 3, 6 e 7 sono a valle delle caspasi attivatrici e agiscono tagliando diversi target. La caspasi 3, cruciale nella fase di esecuzione dell apoptosi, è attivata in risposta ai seguenti stimoli: privazione di siero, attivazione di Fas, trattamento con radiazioni o agenti farmacologici. Inibizione dell apoptosi L apoptosi è un processo regolato sia positivamente sia negativamente. Infatti, oltre ai numerosi fattori coinvolti nell induzione dell apoptosi, ne sono stati identificati molti altri che invece prevengono la morte cellulare. Inibitori endogeni Gli inibitori endogeni dell apoptosi includono fattori che inibiscono le caspasi direttamente oppure ne impediscono l attivazione, bloccando il processo a vari livelli. Tra i ligandi anti-apoptotici rientrano fattori di crescita e citochine, molti dei quali inducono le proteine della famiglia Bcl-2 che proteggono l integrità dei mitocondri, prevenendo il rilascio del citocromo c e l attivazione della caspasi 9. La protein kinasi Akt, poi, è un importante fattore anti-apoptotico che agisce sia inibendo Bad, membro pro-apoptotico della famiglia Bcl- 2, sia bloccando direttamente la caspasi 9. Oltre a essere un iduttore dell apoptosi, il TNF-α ha anche un effetto anti-apoptotico: attiva infatti il fattore NFkB che induce l'espressione di IAP (proteine inibitrici dell'apoptosi) che inibiscono le caspasi 3, 7 e 9 (che sono a loro volta regolati negativamente dal taglio mediato dalle caspasi). Inoltre, l'attivazione della caspasi 8 può essere inibita da FLIP (proteina inibitoriadi FLICE) Anticorpi e proteine di fusione È possibile inibire l apoptosi utilizzando un ampia gamma di anticorpi mono e policlonali. A titolo di esempio citiamo alcuni cloni di anticorpi anti-apo-1/fas che sono in grado di inibire l apoptosi al 60-90%. Allo stesso scopo è possibile utilizzare anche la proteina di fusione APO-1/Fas:Fc-IgG che inibisce la morte cellulare indotta da Fas mediata dal Fas Ligand solubile. RILEVAZIONE DELL APOPTOSI Ci sono una serie di pathway identificati nell apoptosi, l attivazione dei quali porta a un effetto finale sui mitocondri e sul nucleo. Il processo si svolge in tempi molto rapidi (nei mammiferi dura 2-4 ore) e colpisce solamente alcune cellule all interno di un tessuto, rendendone così difficoltosa l identificazione. Come abbiamo visto, nell apoptosi sono state identificate numerose molecole ad azione attivatrice, effettrice e regolatoria che agiscono in cascata; di conseguenza è stata sviluppata una gamma di saggi preposti alla rivelazione e quantificazione di tali molecole ed eventi. In genere, viene raccomandato ai laboratori di utilizzare due diversi tipi di saggi: uno per rilevare gli eventi apoptotici precoci caratteristici della fase di induzione o innesco, e un secondo saggio per individuare 9 - Biotecnologie Febbraio 2006

3 COINVOLGIMENTO DELL APOPTOSI IN PROCESSI FISIOLOGICI E PATOLOGICI Nell uomo, l apoptosi è coinvolta nei seguenti processi: sviluppo embrionale; sviluppo del sistema nervoso centrale; atrofia tissutale endocrino-dipendente; turn-over cellulare; selezione timica; uccisione del bersaglio nelle reazioni di citotossicità; blocco delle risposte immunitarie. Anche in numerosi processi patologici, quali ad esempio, infezioni virali (AIDS), tumori e malattie autoimmuni, una deregolazione dell apoptosi può essere alla base della patogenesi della malattia. - maggiore durata della colonna - migliori risultati Nuova nomenclatura Vecchia nomenclatura Caspasi 1 Caspasi 2 Caspasi 3 ICE ICH-1 CPP32, Yama, Apopaina Caspasi 4 Caspasi 5 Caspasi 6 Caspasi 7 Caspasi 8 Caspasi 9 Caspasi 10 un evento successivo che avviene invece nella fase di esecuzione. I saggi possono essere distinti in diversi gruppi a seconda dell evento che si sceglie di rilevare: cambiamenti iniziali della TX, ICH-2, ICErel-II TY, ICErel-III Mch2 Mch, ICE-LAP3, CMH-1 MACH, FLICE, Mch5 ICE-LAP6, Mch6 Mch4 Da: Porter, Ng, and Jänicke (1997) Death substrates come alive. Bioessays 19: YVAD Tab. 2 Nomenclatuira delle caspasi Fig. 5 Il catione lipofilico MitoLight si mostra in maniera differente nelle cellule normali e in quelle apoptotiche. Nelle cellule sane il colorante si accumula nel mitocondrio mostrando una fluorescenza rossa, mentre nelle cellule in apoptosi, con il potenziale di membrana alterato il colorante resta nel citoplasma mostrando una fluorescenza verde (Prodotti Gianni). Fig. 6 - L attività della citocromo C ossidasi è misurata in presenza e assenza di detergente. Il rapporto tra le due attività fornisce una misura dell integrità della membrana mitocondriale esterna (Sigma- Aldrich). Fig. 4 Le varie fasi del processo apoptotico possono essere rilevate con appositi kit commerciali (Eppendorf MBL). membrana mitocondriale, alterazioni della membrana citoplasmatica, attivazione delle caspasi, frammentazione del DNA o analisi mediante citofluorimetria di flusso. Le fasi in cui è possibile rielvazione dell apoptosi con i principali saggi disponibili a tale scopo per singola fase sono indicati in figura 4. ANALISI DELLE FASI INIZIALI Alterazioni a livello mitocondriale Come abbiamo visto, la pedita di potenziale della membrana interna mitocondriale è uno dei primi eventi intracellulari che avvengono dopo l induzione di apoptosi e coincide con l aumento della permeabilità mitocondriale, portando infine al rilascio di citocromo c. In commercio sono disponibili kit e prodotti di diverso tipo, utili per lo studio dell apoptosi mediata dai mitocondri. Misura della depolarizzazione della membrana mitocondriale Per valutare la depolarizzazione della membrana mitocondriale e quindi la percentuale di cellule apoptotiche in microscopia a fluorescenza o in citofluorimetria si possono usare coloranti ionici che si accumulano in modo potenziale-dipendente nei mitocondri attivi, mentre non sono trattenuti nei mitocondri con membrane depolarizzate. Per la misura del potenziale mitocondriale trans membranario è ad esempio disponibile in commercio un kit che contiene un colorante cationico fluorescente che nelle cellule normali si accumula nel mitocondrio, mostrando una fluorescenza rossa, mentre nelle cellule in apoptosi in cui questo potenziale crolla, il colorante rimane nel citosol, mostrando fluorescenza verde. E quindi facile distinguere tra cellule apoptotiche e non, utilizzando un microscopio a fluorescenza o un citofluorimetro (Fig. 5). In commercio è disponibile anche un kit per l isolamento dei mitocondri e l esecuzione del test del gradiente elettrochimico (Dy) della membrana interna di questi. L integrità della membrana interna mitocondriale può essere verificata valutando la presenza di Dy, mediante uptake del colorante fluorescente carbocianina JC-1 nei mitocondri. L integrità della membrana esterna invece può essere misurata valutando la presenza di citocromo c ossidasi nello spazio intermembrana. La citocromo c ossidasi si trova sulla membrana mitocondriale interna che divide la matrice del mitocondrio dallo spazio intermembrana. Il saggio colorimetrico misura la diminuzione dell assorbanza del ferrocitocroma c causata dalla sua ossidazione a ferricitocroma c ad opera della citocromo c ossidasi (Fig. 6). Misura del citocromo c nel citosol Sul mercato si possono acquistare anche kit che permettono l isolamento di frazioni mitocondriali arricchite dal citosol di cellule e tessuti animali, senza bisogno di ultracentrifugazione né di utilizzare reagenti chimici tossici. Il rilascio di citocromo c nel citosol può quindi essere misurato con anticorpi specifici sia con tecniche di immunoprecipitazione sia mediante western blotting. Alterazioni della membrana extracellulare Cambiamento di potenziale e di permeabilità della membrana cellulare Mano a mano che il processo apoptotico progredisce, la permeabilità della membrana cellulare aumenta progressivamente. Quello che si verifica è un cambiamento conformazionale della membrana plasmatica e precisamente della sua composizione asimmetrica in fosfolipidi. Il mantenimento di tale asimmetria è un processo energia-dipendente che coinvolge enzimi chiamati flippasi, la cui attività nelle cellule apoptotiche è però bloccata da un altro enzima detto floppasi che con un meccanismo flip-flop fa passare le molecole di fosfatidilserina (PS) dallo strato interno della membrana a quello esterno. L esternalizzazione della PS che avviene nelle prime fasi dell apoptosi - consente la parallela internalizzazione di un colorante commerciale: questo uptake è unidirezionale e porta all accumulo del colorante allinterno della cellula (Fig. 7a). Mano a mano che il processo apoptotico prosegue e la cellula si riduce di volume il colorante diventa più concentrato e quindi più visibile. L incorporazione del colorante continua fino alla fase di blebbing. Uno di questi coloranti commerciali può essere visualizzato con la luce visibile, usando un classico microscopio invertito, e può anche essere quantificato con una fotocamera digitale oppure con un colorimetro per micropiastre (Fig. 7b). Il saggio permette di evidenziare solo le cellule apoptotiche e non quelle necrotiche perché queste ultime non sono in grado di trattenere internamente il colorante. In alternativa, si può acquistare un kit che rivela l apoptosi in base ai cambiamenti di permeabilità della membrana cellulare, usando un colorante fluorescente verde degli acidi nucleici (YO-PRO-1) e ioduro di propidio (fluorescenza rossa). YO-PRO- 1 può penetrare nelle cellule mentre lo ioduro di propidio non può, fornendo un indicatore sensibile di apoptosi sia in esperimenti di citofluorimetria di flusso sia di microscopia in fluorescenza. Saggi con Annessina V L Annessina V è una proteina con elevata affinità per la fosfatidilserina (PS). Poiché l esposizione della PS sulla membrana esterna è stata associata all inizio della fase di esecuzione dell apoptosi, ben prima che sia possibile vedere la frammentazione del DNA, il saggio con Annessina V è conside Biotecnologie Febbraio 2006

4 Kit e prodotti per lo studio dell apoptosi Caspasi 2 Caspasi 3 Caspasi 4 Caspasi 5 Caspasi 6 Caspasi 7 Caspasi 8 Caspasi VDVAD DEVD Sequenza consensus riconosciuta nel substrato YVAD/LEVD WEHD VEID DEVD IETD Fig. 7 Internalizzazione del colorante APOPercentage nelle cellule apoptotiche (Tebu-bio). a) Nelle cellule apoptotiche l attività delle flippasi, gli enzimi che mantengono l asimmetria dei fosfolipidi di membrana è bloccata da un altro enzima detto floppasi che fa passare le molecole di fosfatidilserina (PS) dallo strato interno a quello esterno della membrana, consentendo l internalizzazione del colorante all interno della cellula. b) L incorporazione del colorante commerciali può essere visualizzata con un microscopio invertito e può anche essere quantificato con una fotocamera digitale. Caspasi 9 LEHD Tab. 3 A ogni caspasi il suo substrato specifico rato un metodo di rilevazione più precoce di altri metodi basati sul DNA. La traslocazione di PS sulla superficie cellulare esterna, che si verifica con qualsiasi stimolo iniziale di apoptosi, non avviene unicamente nell apoptosi ma anche durante la necrosi. La differenza tra queste due forme di morte cellulare consiste nel fatto che nelle fasi iniziali di apoptosi la membrana cellulare rimane intatta mentre nel momento in cui si verifica la necrosi la membrana cellulare perde la sua integrità. Se si procede alla colorazione simultanea della PS di superficie con annessina V marcata con molecole fluorescenti e di cellule necrotiche con ioduro di propidio, il saggio consente di distinguere l apoptosi dalla necrosi in citofluorimetria o microscopia in fluorescenza. Le cellule necrotiche sono facilmente colorate sia con annessina V sia con ioduro di propidio (che invece è escluso dalle cellule normali e da quelle apoptotiche), mentre le cellule apoptotiche sono colorate solo con annessina V (Fig. 8). La marcatura delle cellule con annessina è rapida (circa 10 minuti) e non è richiesta fissazione. Il saggio è in genere molto sensibile, permettendo di rilevare anche una sola cellula marcata. Oltre ai kit completi, è possibile acquistare la singola proteina non coniugata o coniugata PE, APC, FITC, Alexa 568, Cy3, Cy5, EGFP o biotina. Tra i kit immunoenzimatici disponibili c è ad esempio un saggio ELISA sandwich che consente la rilevazione quantitativa di annessina V da supernatanti riconosciuta da un anticorpo primario (anticorpo monoclonale anti-annessina V) adeso ai pozzetti della micropiastra e da anticorpo secondario anti-annessina V biotinilato. L aggiunta di streptavidina-hrp consente la rivelazione di un prodotto colorato e di determinare la concentrazione di annessina V presente nel campione. Infine, alcune case producono kit per l isolamento di cellule apoptotiche da cellule in coltura o preparazioni tessutali sfruttando il legame di annessina V coniugata a biotina con biglie magnetiche legate a streptavidina: le cellule apoptotiche legate alle biglie aderiscono al magnete, mentre le cellule non apoptotiche rimangono in sospensione. Rilascio di proteine della matrice nucleare In seguito al segnale di apoptosi, le proteine della matrice nucleare (NMP) sono rilasciate nel mezzo circostante. Anche se la matrice nucleare è insolubile, in seguito a morte cellulare vengono rilasciate NMP solubili che possono essere rilevate nel supernatante di coltura, ad esempio con un saggio ELISA. Questo saggio è particolarmente vantaggioso perché permette di quantificare come cambia il livello di NMP direttamente nei supernatanti e non nei lisati cellulari, evitando il conteggio delle cellule e riducendo le manipolazioni. Rapporto ADP/ATP L apoptosi è un processo che richiede energia e l ATP è necessario per una serie di eventi iniziali. Il rapporto ADP/ATP nella cellula è quindi un predittore precoce di Fig. 8 - Uso dell annessina V per la rivelazione dell estrnalizzazione di PS che si verifica nelle fasi iniziali dell apoptosi. (Roche Diagnostics Applied Scince). Analisi al microscopio a fluorescenza di cellule apoptotiche SKW6.4 colorate con Annexin-V- FLUOS (verde)(foto in alto) e colorate sia con Annexin-V-FLUOS (verde) sia con ioduro di propidio (giallo-arancio)(foto in basso). apoptosi. Tra i kit disponibili in commercio per la misura del rapporto ADP/ATP ve ne sono alcuni che permettono di differenziare tra apoptosi, necrosi e proliferazione cellulare con un solo saggio. C è ad esempio un kit basato sulla bioluminescenza che permette la misura sequenziale di ATP e ADP in ogni pozzetto con la definizione del rapporto ADP/ATP, consentendo di distinguere tra apoptosi e necrosi. Il saggio, facilmente automatizzabile, si svolge in piastre di coltura da 96 pozzetti che dall incubatore sono poi trasferite al luminometro per la lettura. Il kit offre elevata sensibilità e velocità: i risultati sono disponibili in meno di 20 minuti, con un limite di rilevazione di 100 cellule/ pozzetto. I dati che si ottengono correlano con i saggi convenzionali di apoptosi come il TUNEL, i saggi con ioduro di propidio, annessina V e caspasi. Diversamente da altri saggi come quello dell Annessina V che non sono adatti per cellule aderenti, questo permette di analizzare cellule sia aderenti sia in sospensione con lo stesso metodo. RIVELAZIONE DELLA FASE DI ESECUZIONE Rivelazione e quantificazione dell attività delle caspasi La rivelazione dell attività delle caspasi è riconosciuta comeun metodo standard per la misura dell apoptosi. In commercio sono disponibili diversi kit colorimetrici, fluorescenti e bioluminescenti per la rivelazione della caspasi. Si può scegliere all interno di un ampia scelta di substrati, ma anche di inibitori specifici delle caspasi. Sono inoltre disponibili centinaia di anticorpi mono e policlonali per ridurre, bloccare o rivelare l apoptosi. Kit che utilizzano substrati fluorescenti e chemiluminescenti Il metodo più usato per la misura delle caspasi attive è la rivelazione colorimetrica o fluorometrica del taglio dei substrati caspasi-specifici. Le caspasi attive riconoscono brevi sequenze di 4-5 aminoacidi in una molecola substrato. Per la caspasi-3 e -7, ad esempio, il substrato contiene la sequenza consensus Asp-Glu-Val-Asp (DEVD); per la caspasi -1 il substrato più utilizzato è un peptide che contiene la sequenza conservata YVAD, mentre i substrati contenenti il tetrapeptide IETD sono quelli tagliati con maggiore efficienza dalla caspasi-8 (Tab. 3). Sono disponibili kit sia colorimetrici sia fluorometrici in formato di singolo tubo o di micropiastra - in cui i substrati sono legati a molecole il cui taglio ad opera delle caspasi dà un prodotto colorato o induce emissione di fluorescenza. Più di una casa produttrice propone ad esempio dei kit che rivelano il taglio del legame del peptide substrato con il colorante p-nitroanilide (pna) oppure con il 7-amino-4-metilcumarin (AMC) in lisati cellulari. Nei saggi Fig. 9 Misura dell attività delle caspasi in cellule apoptotiche usando kit colorimetrici che rivelano il taglio dei peptidi substrato-pna o peptidi-afc in lisati cellulari (Eppendorf- MBL). colorimetrici il pna può essere quantificato usando uno spettrofotometro o un lettore di piastre microtitolo a 405 nm. Nel saggio fluorometrico, il peptide substrato- AMC è tagliato dalle caspasi e il colorante AMC libero emette fluorescenza verde che può essere quantificata con un fluorimetro o un lettore di piastre microtitolo in fluorescenza (Fig. 9). Tali kit sono disponibili in entrambi i formati per le caspasi-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9 e -10. A titolo di esempio citiamo alcuni kit disponibili per quantificare l attività della caspasi-3 e -7 in modo veloce e sensibile mediante una singola reazione (formato omogeneo) che avviene direttamente in piastre da 96 o 384 pozzetti. A tale scopo si può scegliere un kit che contiene sia un substrato colorimetrico (DEVD-pNA) sia uno fluorescente (DEVD-AMC). Oppure un kit che include un substrato DEVD marcato con rodamina 110 (DEVD-R110) e un buffer bifunzionale ottimizzato per la lisi cellulare e l attività delle caspasi Biotecnologie Febbraio 2006

5 Pubblicità Redazionale Pubblicità Redazionale LE SOLUZIONI ATCC PER L APOPTOSI ATCC, distribuita in esclusiva per l Italia da LGC Promochem, presenta la sua gamma di soluzioni per lo studio dell apoptosi, sia per cellule in coltura sia per esperimenti in situ. ATCC propone una scelta tra 22 prodotti che comprendono: Kits e reagenti (Caspase, TUNEL, Annessina V, DNA Ladder, PARP) Anticorpi (H2AX, PARP, G3PD Set di cloni di DNA umani e murini L ampia scelta di prodotti è in grado di coprire tutte le fasi del processo apoptotico, del quale sono in grado di rilevare: Cambiamenti di potenziale della membrana mitocondriale; Attivazione della caspasi; Legame dell annessina V; Frammentazione del DNA cromosomale (TUNEL). I prodotti ATCC per l apoptosi forniscono una chiara risposta on/off nel rilevare I principali avvenimenti apoptotici, coinvolgono l utilizzo di metodiche comuni per i laboratori di biologia cellulare: microscopia, lettura in micropiastre, citometria di flusso, gel elettroforesi di DNA. ATCC offre reagenti per la rilevazione fluorescente delle caspasi, come substrati ed inibitori, e una gamma di anticorpi tra cui quelli anti-istoni fosforilati e anti-parp. Propone anche kit per la rilevazione dell apoptosi TdT in situ, in micropiastra e per citometria di flusso. Inoltre ATCC offre cloni di geni per l apoptosi, tra cui un set di DNA clonati umani (contenenti 116 geni interi) e murini (contenenti 30 geni interi). La gamma dei prodotti comprende anche sistemi modello di linee cellulari, ibridomi e linee cellulari inducibili per l apoptosi, nate dalla decennale esperienza di ATCC in colture cellulari. Fig. 1 - Caspase Substrate Assay Kits. Cresyl violet (CV) associato a due peptidi identici. Il reagente di diffonde nella cellula viva, ed emette fluorescenza solo quando due peptidi vengono tagliati dall azione della caspasi. SIGMA-ALDRICH ha sviluppato una vasta gamma di prodotti innovativi e di tecnologie avanzate volti allo studio dell apoptosi. Il kit Annexin V-Cy3 Apoptosis Detection permette l identificazione dell annessina V legata alle cellule apoptotiche, mediante microscopia a fluorescenza. Caratteristiche e Vantaggi: Definisce l apoptosi in maniera più precoce rispetto ai saggi basati sulla frammentazione del DNA (tunel assay). Distingue le cellule apoptotiche da quelle vitali o necrotiche. Rapido: la colorazione richiede solo 10 minuti. Non è necessaria fissazione né alcun trattamento delle cellule. Il kit usa come fluorocromo il Cy3.18 (più luminoso del FITC) coniugato all annessina V e il composto non fluorescente 6-carbossifluoresceina-di-acetato (6-CFDA). Il 6-CFDA entra nelle cellule ed è idrolizzato dalle esterasi presenti nelle cellule vitali in un composto verde fluorescente, la 6-carbossifluoresceina. La diversa combinazione dei fluorocromi consente di distinguere tra cellule apoptotiche precoci (positive all annessina V e al 6-CFDA), cellule necrotiche (positive all annessina V e negative al 6-CFDA) e cellule vitali (negative all annessina V e al 6-CFDA). Doppio staining di cellule controllo e apoptotiche con il kit Annexin V-Cy3 Apoptosis Detection: Figura A: Cellule controllo colorate con CDFA Figura B: cellule apoptotiche colorate con CDFA Figura C: Cellule controllo colorate con annessinav-cy3.18 Figura D: Cellule apoptotiche colorate con annessinav-cy3.18 Offriamo numerosi kit e prodotti per lo studio dei vari step dell apoptosi cellulare: Identificazione di cellule apoptotiche, Induttori e inibitori dell apoptosi, Proteine adattatrici e relativi anticorpi, Proteine appartenenti alla famiglia bcl-2, Frammentazione del DNA, Proteine mitocondriali e relativi anticorpi, Inibitori del trasporto mitocondriale, Soppressori di apoptosi e relativi anticorpi, Anticorpi verso altre proteine correlate all apoptosi, Caspasi (kit, enzimi, anticorpi, inibitori e substrati), Catepsine e Granzymes, Recettori di morte e relativi anticorpi, Ligandi dei recettori di morte, PARP, Kit di proliferazione e vitalità cellulare. Fig. 2 - TdT TUNEL Assay with DAB staining. Cellule positive alla colorazione DAB hanno nucleo marrone, ad indicare la rottura del DNA (A). Mentre cellule con nucleo blu presentano DNA intatto (B). Per maggiori informazioni visitate il sito alla pagina: Questo buffer lisa le cellule in modo rapido ed efficace e nello stesso tempo crea condizioni ottimali per l attività delle caspasi. Il substrato e il buffer sono miscelati per formare una soluzione che viene aggiunta direttamente ai campioni, permettendo di effettuare l intero saggio con un unica reazione (reagente omogeneo). Dopo il taglio enzimatico del peptide substrato da parte della caspasi-3/7, la rodamina 110 sviluppa fluorescenza quando viene eccitata ad una lunghezza d onda di 499 nm e la quantità di Fig Sensibilità del saggio omogeneo per la rivelazione in fluorescenza dell attività delle caspasi-3/-7 (Promega). a) Curve dose risposta (in funzione del numero di cellule) dopo un ora di trattamento con il reagente omogeneo Apo- ONE. fluorescenza prodotta è proporzionale alla quantità di caspasi-3/7 presente nel campione. I campioni di partenza possono essere frazioni enzimatiche, estratti cellulari o cellule in coltura. Il saggio è sensibile (bastano poche centinaia di cellule per pozzetto di micropiastra dopo una sola ora di reazione) e la sensibilità inoltre aumenta all aumentare del tempo di incubazione (Fig. 10). Recentemente è stato lanciato un analogo kit per saggi omogenei luminescenti in cui il substrato delle caspasi 3/7 è DEVD-aminoluciferina che viene tagliato rilasciando aminoluciferina che serve come substrato alla luciferasi. Questo misura il segnale luminescente che è proporzionale all attività delle caspasi attivate. Il reagente è aggiunto direttamente alle cellule che sono lisate mediante agitazione. Dopo appena 1 ora viene prodotto un segnale luminescente di tipo glow che è stabile per parecchie ore e può essere misurato con un luminometro. È un assay molto flessibile che può essere usato in una varietà di formati con cellule in coltura o preparazioni enzimatiche (in cuvetta o in piastra da 6 fino a 1536 pozzetti). Il vantaggio della luminescenza è che evita i problemi di autofluorescenza associata alle cellule, ai terreni e ai reagenti. Un altro kit per la rivelazione dei substrati delle caspasi contiene un reagente permeabile alle cellule e non citotossico costituito da due peptidi caspasi-specifici accoppiati al cresil viola (CV). Quando i peptidi sono tagliati via dall azione delle caspasi, il CV emette fluorescenza in modo direttamente Fig. 11 Uso di un anticorpo monoclonale specifico per la caspasi-3 tagliata e cioè attivata (Celbio). a)microfotografia confocale ottenuta usando un anticorpo diretto contro il frammento più grande derivante dall attivazione della caspasi 3 (fluorescenza verde) e ioduro di propidio (fluorescenza rossa). b)allungando i tempi di incubazione aumenta parallelamente la sensibilità del saggio. b)western blot in cui è stato usato un anticorpo specifico per la caspasi-3 tagliata su tre diveersi tipi cellulari (Jurkat, 3T3 e C6) non trattati (corsia di sinistra per ogni tipo cellulare) e trattati con un induttore dell apoptosi (corsia di destra per ogni tipo cellulare). Si vede chiaramente che viene riconosciuta solo la forma tagliata della caspasi- 3 e non quella inattiva (procaspasi) presente nei campioni non indotti Biotecnologie Febbraio 2006

6 Kit e prodotti per lo studio dell apoptosi TEBU-BIO Tebu-bio è un fornitore globale di reagenti e servizi per la ricerca bio-medica e faramaceutica. I punti di forza Servizio tecnico e forza vendite presente su tutto il territorio europeo Laboratori certificati GMO Pubblicità Redazionale Su richiesta fornitura di confezionamenti su misura e progetti personalizzati per soddisfare tutte le esigenze Offerta di interfaccia informatica per la gestione diretta degli ordini da parte dei clienti e garanzia di consegne rapide in tutta Europa anche di materiale Bio-Azhard Certificati ISO : ogni step delle procedure è costantemente monitorato. Collaborazioni scientifiche con alcune delle principali biotech company e università americane ed europee. Tebu-bio: più che reagenti Oltre a disegnare progetti di ricerca sulle specifiche esigenze del committente, i laboratori Tebu-bio offrono ai clienti la possibilità di alleggerirsi di carichi di lavoro routinari o non più sostenibili, o anche più semplicemente possono contribuire all esecuzione di uno o più step nell ambito di un progetto già avviato. Le competenze offerte coprono una grande varietà di servizi nell ambito della biologia cellulare e molecolare: dalle culture cellulari, alla produzione di proteine ricombinanti biologicamente attive, fino alle applicazioni in ambiente Drug-Discovery. Nel rispetto della massima confidenzialià garantiamo ai nostri clienti la massima trasparenza ed interattività nella stesura dei progetti commissionati. Attivi in ogni campo della ricerca bio-medica Il costante impegno nell espansione dell offerta di prodotti e servizi permette a Tebu-bio di reagire prontamente all evoluzione dei bisogni della comunità scientifica. I ricercatori possono contare sui laboratori dell azienda come un valido strumento per avere successo nei loro progetti di ricerca. PIQORTM CELL DEATH MICROARRAYS- MILTENYI La morte cellulare programmata è un evento di cruciale importanza nel processo fisiologico di rimozione delle cellule non più necessarie durante lo sviluppo, per mantenere l omeostasi dei tessuti e per garantire la funzionalità dei meccanismi di difesa dall ospite. Chiarire quali siano i meccanismi biochimici e molecolari alla base del processo di morte cellulare programmata e dello stress, un comune precursore dell apoptosi, è uno dei principali obiettivi sul quale si sta focalizzando gran parte dell attuale ricerca in campo biologico. Miltenyibiotec ha sviluppato il PIQORTM Cell Death microarray, costituito da geni che codificano per proteine aventi un ruolo chiave nel processo apoptotico e nello stress, quali le caspasi, i membri della famiglia dei recettori per il TNF, i membri della famiglia di BCL2 e le proteine Heat Shock. I PIQORTM Cell Death Microarrays sono disponibili sia per la specie umana che per quella murina. Il numero totale di geni presenti sul PIQORTM Cell Death Microarray è di 500 per l uomo e 509 per il topo. Ogni PIQORTM Microarray contiene inoltre sei geni costitutivi e sei controlli (DNA di sperma d aringa e quattro RNA artificiali di controllo) per una quantificazione corretta di geni differenzialmente espressi. I cdna rappresentativi delle sequenze geniche sono presenti sul vetrino in quadruplicato (vedi figura) al fine di garantire una significatività statistica elevata e ridurre il numero di repliche sperimentali. Le caratteristiche del PIQORTM Cell Death Microarray consentono di ottenere dati di espressione di elevata qualità grazie ad una tecnica di spotting ad alta fedeltà e ad un sistema brevettato di immobilizzazione dei cdna sul vetrino. Le dimensioni che caratterizzano i frammenti di cdna sono di pb. Tali dimensioni sono sufficienti per garantire elevata specificità di legame e al tempo stesso evitare fenomeni di cross-ibridazione. La dimensione omogenea dei frammenti di cd- NA, infine, garantisce la stessa cinetica di ibridazione per tutti i frammenti. macs@miltenyibiotec.it Fig Cytometric Bead Assay (CBA) per la rapida misura semi-quantitativa di caspasi 3 attiva in lisati cellulari, mediante citofluorimetria di flusso (BD Biosciences). Fig. 13 Rilevazione del DNA ladder in cellula apoptotiche usando il MEBCYTO Apoptosis Ladder Detection Kit (Eppendorf MBL). In cellule HL60 in cui l apoptosi è stata indotta da Actinomicina D, il DNA ladder diventa chiaramente visibile dopo 2 ore di trattamento. Fig Il principio del metodo TUNEL in cui le estremità 3 -OH generate dalla frammentazione del DNA sono nick end labelled con dutp-fitc ad opera della Terminal deossinucleotidil Trasferasi (TdT) (Eppendorf - MBL). proporzionale alla quantità di caspasi attivate presente. Questi kit possono essere usati con la fluorimetria in formato multiwell, la microscopia in fluorescenza e la citometria di flusso. Il colorante Hoechst è incluso nei kit per la marcatura dei nuclei cellulari. Saggi con inibitori fluorescenti delle caspasi I kit per la rivelazione in fluorescenza degli inibitori delle caspasi contengono peptidi che sono permeabili e non citotossici: si legano alle caspasi attivate e sono marcati con FITC o carbossifluoresceina (FAM) oppure con sulforodamina (SR), permettendo la colorazione in situ delle caspasi attive. In entrambe le tipologie di kit è di solito incluso il colorante Hoechst per marcare i nuclei cellulari. Questi kit sono compatibili con la fluorimetria in formato multiwell, la microscopia in fluorescenza e la citofluorimetria di flusso. Il segnale fluorescente è una misura diretta del numero di caspasi attive presenti nella cellula. I formati FAM e SR possono essere utilizzati in combinazione come marker in situ per seguire l attivazione di più di una caspasi. Si hanno cioè inibitori delle caspasi coniugati a FITC/FAM che emettono fluorescenza verde (FAM/FITC-peptide- FMK) oppure a solforodamina (SR-peptide-FMK) che emettono fluorescenza rossa. In commercio è ad esempio disponibile un coniugato FITC oppure SR di VAD-FMK, che è un inibitore delle caspasi-1 e 3: la membrana cellulare è permeabile a questo composto che viene quindi assorbito direttamente senza bisogno di una preventiva permeabilizzazione delle cellule. Una volta all interno della cellula, il VAD-FMK lega in modo irreversibile tuttele caspasi attivate. Dopo 20 minuti di incubazione le cellule sono lavate e poi analizzate direttamente con il citofluorimetro a flusso. Per l osservazione al microscopio a fluorescenza le cellule devono invece essere fissate in formalina (Fig. 13). Il marker è impiegato per la rilevazione diretta in vivo dell attività delle caspasi e può essere combinato con altri marker (ad esempio anticorpi), permettendo una doppia colorazione. Altri inibitori fluorescenti disponibili, solo per citarne alcuni, sono: Ac-YVAD-FMK e Z-YVAD (specifici per caspasi-1 e 4), e Z- VDVAD-FMK (specifico per la caspasi- 2) Anticorpi e kit per western blotting Il taglio delle caspasi che si verifica durante l apoptosi può essere facilmente dimostrato mediante tecniche di western blotting. Per questo diverse aziende hanno sviluppato e caratterizzato anticorpi polie monoclonali specifici per varie caspasi. A titolo di esempio citiamo un anticorpo monoclonale specifico per la caspasi 9 umana da impiegare in tecniche di Western Blot: questo anticorpo dosa sia la caspasi inattiva di 45 kda, sia le forme attive risultanti dal clivaggio, impiegando cellule lisate provenienti dalle linee cellulari umane sottoposte ad apoptosi. Per la rivelazione della caspasi-3 attivata, è disponibile un anticorpo diretto contro uno dei frammenti derivanti dal taglio di tale caspasi che si verifica quando questa viene attivata. La figura 11 mostra sia mediante analisi confocale delle cellule sia mediante esperimenti di western blot che l anticorpo è estremamente specifico e non riconosce né la caspasi-3 inattiva full lenght né altre caspasi. Per lo screening dell espressione proteica sono disponibili anche kit contenenti molteplici anticorpi per esperimenti di western blotting che consentono la rivelazione delle 13 - Biotecnologie Febbraio 2006

7 Fig. 15 Rivelazione del taglio di PARP usando un anticorpo monoclonale specifico (Celbio). a) Analisi in ImmunoFluorescenza di cellule HeLa non trattate (sinistra) e in cui è stata indotta l apoptosi con Staurosporina (destra). b)il taglio di PARP è rilevato mediante Western blotting. Fig. 16 La procedura dei Panorama Gene Array per lo studio dell espressione differenziale di parecchi geni implicati nell apoptosi. In questo sistema, la marcatura dei cdna è di tipo radioattivo (Sigma Aldrich). caspasi e, contemporaneamente, di molte altre proteine implicate nell apoptosi. Phospho ELISA Kit Per la rivelazione delle caspasi, ma anche più in generale delle proteine coinvolte nell apoptosi, oltre ai tradizionali Western Blot sono disponibili diversi kit ELISA, tra cui citiamo i cosiddetti PhosphoELISA. Questi ultimi sono caratterizzati da elevatissima sensibilità (10 volte maggiore di quella dei western blot, secondo il produttore) ed altissima riproducibilità nel tempo. I kit contengono tutti i reagenti necessari per lo sviluppo completo delle metodiche con i relativi controlli. Non sono più necessari né gel né immunoprecipitazioni e il risultato è pronto in mezza giornata. Single Bead Assay per citofluorimetria Sul mercato è disponibile un kit per la rilevazione di caspasi attive in citofluorimetria di flusso. Il kit è un single bead assay per la rapida misura semi-quantitativa di caspasi 3 in lisati cellulari. Il kit combina i principi dell ELISA sandwich con la capacità di usare lisati cellulari in un saggio citofluorometrico basato sulle particelle ( beads ). In questo saggio i lisati cellulari sono incubati con particelle rivestite di anticorpi che catturano le molecole di caspasi 3 in forma sia attiva sia inattiva. La superfice di cattura delle beads è analoga a quella di un pozzetto rivestito con uno specifico Anticorpi specifici per la forma attiva della caspasi 3 marcati con una molecola fluorescente sono aggiunti alla miscela di beads e le reazioni che ne risultano sono misurate in base all intensità di fluorescenza con un citofluorimetro (Fig. 12). Analisi della condensazione della cromatina Mediante coloranti specifici Nelle cellule che vanno incontro ad apoptosi si verifica un aumento della condensazione della cromatina. Dal punto di vista morfologico, il nucleo delle cellule apoptotiche diventa più piccolo di quello delle cellule normali e diventa iperfluorescente Fig I PIQORTM Cell Death Microarrays sono disponibili sia per la specie umana (500 geni presenti sull array per l uomo) sia per quella murina (509 geni per il topo). Le caratteristiche del PIQORTM Cell Death Microarray consentono di ottenere dati di espressione di elevata qualità grazie ad una tecnica di spotting ad alta fedeltà e a un sistema brevettato di immobilizzazione dei cdna sul vetrino. Le dimensioni che caratterizzano i frammenti di cdna sono di bp, dimensioni sufficienti per garantire elevata specificità di legame e al tempo stesso evitare fenomeni di cross-ibridazione (Miltenyi Biotech). quando viene marcato con determinati coloranti nucleari. Hoechst è un colorante degli acidi nucleici, facilmente permeabile nelle cellule, che colora molto fortemente la cromatina condensata delle cellule apoptotiche e poco quella meno condensata delle cellule normali. Mediante la colorazione con Hoechst, è possibile calcolare l indice apoptotico cioè la percentuale di cellule con morfologia particolare sul totale delle cellule. Se assieme al colorante Hoechst si usa anche lo ioduro di propridio a cui le cellule sono impermeabili e che quindi permette solo la colorazione delle cellule necrotiche, è possibile anche distinguere tra apoptosi e necrosi. In commercio è ad esempio disponibile un kit per un saggio a due colori in citofluorimetria di flusso che usa il colorante Hoechst (fluorescenze blu) e ioduro di propidio (fluorescenza rossa). Kit e anticorpi per la rivelazione di DNA a singolo strand Per la rivelazione degli stadi sia precoci sia tardivi di apoptosi si può usare un anticorpo monoclonale specifico per il DNA a singolo strand (ssdna) che rappresenta una valida alternativa al TUNEL su paraffinato. Consente di rilevare gli eventi apoptotici che avvengono prima della rottura del DNA o senza attivazione di specifiche caspasi. Si tratta di un sistema sensibile e specifico per apoptosi che non rivela le cellule in necrosi. Tra le tecniche di rilevazione rientrano citofluorimetria, microscopia a fluorescenza, immunocitochimica e immunoistochimica (anche su paraffinato). Il legame dell anticorpo anti-ss riflette la diminuita stabilità del DNA alla denaturazione dovuta alla condensazione della cromatina e alla proteolisi delle proteine legate al DNA che si verifica durante l apoptosi. La procedura di uno dei kit commerciali è basata su un saggio ELISA che prevede l adesione delle cellule fissate ai pozzetti di micropiastre da 96 e l esposizione di queste a formamide e ad alte temperature in grado di indurre denaturazione del DNA in situ, solamente nei nuclei apoptotici a cui segue il riconoscimento con un anticorpo primario anti-ss e la rivelazione un anticorpo secondario marcato con perossidasi. Analisi della frammentazione del DNA Un parametro importante per la valutazione della modalità di morte cellulare è la degradazione del DNA. La frammentazione del DNA è stata per lungo tempo utilizzata per distinguere tra apoptosi e necrosi. Comparsa del DNA ladder E noto da lungo tempo che c è corrispondenza fra l apparire di morfologie apoptotiche e la frammentazione del DNA visualizzabile come ladder di DNA. Nelle fasi tardive dell apoptosi, infatti, endonucleasi attivate dalle caspasi tagliano il DNA cromatinico al sito linker tra nucleosomi, producendo frammenti di DNA della dimensione di un nucleosoma (180 coppie di basi e multipli). Per visualizzarlo è sufficiente estrarre il DNA genomico e sottoporlo a elettroforesi su gel di agarosio: l entità del fenomeno è proporzionale alla quantità di cellule apoptotiche. Per quantificare il DNA frammentato, la tecnica originaria prevede di marcare il DNA con timidina triziata prima di indurre l apoptosi; successivamente si procede alla separazione elettroforetica di molecole molto piccole che originano il ladder di DNA e quelle di DNA genomico di dimensioni maggiori e per differenza si desume quanta frammentazione è avvenuta. Ora sono però molto più utilizzati coloranti fluorescenti, come il bromuro di etidio o il SIBR Green. In commercio è presente un kit sensibile che permette di isolare selettivamente il ladder di DNA senza interferenza del DNA genomico a partire da cellule e tessuti che contengono meno del 5% di cellule apoptotiche. Oppure si può scegliere un kit che consente di isolare frammenti di DNA in un singolo tubo, in modo molto rapido (meno di 90 minuti) e semplice, senza bisogno di passaggi di estrazione o su colonna (Fig. 13). Saggio TUNEL Anche se l apparizione del ladder di DNA è considerata un marcatore sicuro dell apoptosi, la frammentazione del DNA ha permesso di mettere a punto una tecnologia più fine basata sul principio che le terminazioni libere 3 -OH che si vengono a formare in seguito alla frammentazione del DNA possano servire come substrato per la terminal deossinucleotidil transferasi (TdT). Utilizzando come substrato dutp marcato è possibile distinguere in una popolazione le cellule apoptotiche. In questo tipo di saggi, le cellule devono essere preventivamente fissate per impedire il leakage e la perdita di frammenti di DNA a basso peso molecolare. Questo metodo che è detto TUNEL - acronimo di TdT mediato dutp nick end labelling - ha permesso la visualizzazione in situ della frammentazione del DNA a livello di singole cellule ed è considerato più sensibile delle tecniche morfologiche convenzionali. Oltre al metodo diretto in cui si usa dutp fluorescinato (Fig. 14), le estremità 3 -OH possono essere nick end labelled mediante TdT con dutp o altri dntp biotinilati e poi evidenziate usando FITC coniugata ad avidina per consentire la colorazione specifica (metodo indiretto). Invece di usare un fluorocromo per la rivelazione, si può usare l enzima HRP coniugato a streptavidina e un substrato colorimetrico. Oltre ai kit TdT per la rivelazione dell apoptosi in situ in colture di cellule e tessuti, ve ne sono anche in formato di micropiastra da 96 pozzetti: questi utimi consentono l analisi colorimetrica di un gran numero di campioni cellulari e la quantificazione dell apoptosi senza il conteggio diretto delle cellule. Esistono anche kit TUNEL specifici per la rivelazione di cellule apoptotiche in citofluorimetria di flusso. In commercio è ad esempio disponibile un kit completo di ioduro di propidio e controlli per la rivelazione dell apoptosi in citofluorimetria che sfrutta la marcatura dei frammenti di DNA con Br-dUTP, frammenti che sono rivelati usando anticorpi anti-brdutp coniugati con FITC. Un altro kit commerciale consente poi la rivelazione dei frammenti di DNA marcati con Br-dUTP usando anticorpi anti-brdutp biotinilati e HRP coniugato a streptavidina: in questo modo è possibile la rivelazione colorimetrica di campioni di tessuto congelati o paraffinati. ELISA per rilevare nucleosomi liberi In commercio è disponibile anche un kit ELISA per la quantificazione delle cellule apoptotiche in vitro mediante la cattura per affinità di nucleosomi liberi, seguita da rilevazione con anticorpi anti-istone. In questo saggio i mono e oligonucleosomi sono catturati da proteine leganti il DNA che rivestono i pozzetti di una piastra ELISA. Anticorpi anti-istone coniugati a biotina si legano poi alla componente istonica dei nucleosomi catturati e sono rilevati dopo incubazione con streptavidina-hrp. L HRP catalizza la conversione di un substrato cromogeno incolore. La quantificazione del colore prodotto si ottiene con la costruzione di una curva standard usando standard liofilizzati con valori unitari nucleosomici ben definiti. Confrontando l assorbanza ottenuta da un campione contenente una quantità sconosciuta di nucleosomi con quella ottenuta dagli standard, si può assegnare un valore di unità nucleosomali al campione da misurare. Inoltre, al campione si può attribuire un indice apoptotico quando l assorbanza del campione trattato (apoptotico) è divisa per quella del campione non trattato (controllo). I risultati quantitativi ottenuti con questo saggio correlano con quelli ottenuti da altri indicatori di apoptosi: DNA ladder, TUNEL, morfologia cellulare. Rilevazione di PARP La presenza di rotture nel DNA è in grado di attivare la proteina poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) che sintetizza polimeri di ADP-ribosio: ha una bassa attività nelle cellule sane mentre è molto attiva nella riparazione del DNA. Durante l apoptosi, PARP è inattivata dalle caspasi che la tagliano in due subunità: ciò fa sì che possa procedere la frammentazione del DNA 14 - Biotecnologie Febbraio 2006

8 Kit e prodotti per lo studio dell apoptosi cromosomale. Utilizzando un anticorpo monoclonale che identifica i frammenti di PARP mediante immunoblotting e immunocitochimica è possibile individuare la presenza di cellule apoptotiche (Fig. 15). SAGGI BASATI SULLA RIVELAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI Studio dell apoptosi mediante Real Time PCR Pannelli di cdna Sono disponibili pannelli di cdna sintetizzati da cellule trattate con diversi agenti inducenti apoptosi. Questi campioni permettono di usare la PCR quantitativa (Q-PCR) real time e primer gene-specifici per controllare rapidamente l espressione genica di quel dato gene in diversi modelli cellulari. Inoltre, questi campioni di cdna permettono la conferma dell espressione differenziale durante l apoptosi riscontrata mediante ibridazione di array. L elevata sensibilità della PCR real time permette di rilevare anche trascritti mrna rari. Acquistare questo tipo di pannelli di cd- NA permette di avere accesso singoli tipo cellulari che stanno andando incontro ad apoptosi attraverso pathway differenti e consente il rapido screening dell attivazione di uno specifico gene in una gamma di condizioni che sarebbe difficile ripetere in laboratorio. Kit e set di primer per PCR multiplex L RT-MPCR che stà per Reverse-transcriptase multiplex PCR (MPCR) fornisce un metodo accurato per rilevare l espressione di molteplici geni amplificandoli tutti contemporaneamente nelle stesse condizioni. La capacità dell MPCR di quantificare molteplici specie di mrna da un singolo campione di RNA consente l analisi comparativa di diverse specie di mrna nei campioni. Un RT-MPCR kit è ottimale per analizzare quando, dove e a che livello i geni sono espressi, anche noto come gene expression profiling. Sono disponibili in commercio diversi set di kit per multiplex PCR che coprono parecchi geni coinvolti nel patway dell apoptosi, tra cui Bcl-2, Bcl-xL, caspasi (da 1 a 10), p53, Fas, FasL, ecc. Questi sono estremamente utili per studiare l apoptosi e per valutare potenziali induttori di apoptosi. Tra i kit MPCR ne citiamo ad esempio uno per lo studio dell apoptosi Bax/Bcl-2. Bcl- 2 fa parte di una grande famiglia genica codificante proteine che possono inibire l apoptosi.(come Bcl-2 e Bcl-XL) oppure promuoverla (bax, Bcl-XS, Bak). Bcl-2 inibisce l apoptosi impedendo il rilascio di AIF (Apoptosisi Inducing Factor) e citocromo c dai mitocondri. Se il livello di Bcl-2 è maggiore del livello di Bax l apoptosi sarà inibita. Il rapporto Bcl-2/Bax nella cellula può determinare se la cellula dà inizio all apoptosi oppure sopravvive. Alcune cellule cancerose ad esempio over esprimono Bcl-2 impedendo l apoptosi. Il kit che descriviamo contiene set di primer per la rilevazione di cdna di Bax e Bcl ottenuti dalla retrotrascrizione dei relativi mrna provenienti da tessuti o linee cellulari di ratto, topo e uomo. Questi set di primer sono ottimizzati per per la simultanea amplificazione, rilevazione e comparazione dei livelli di mrna di Bcl-2 e Bax. RNAse Protection Assay Grazie alla sua sensibilità e specificità, l RNAse protection Assay (RPA) era la procedura più comunemente utilizzata per determinare l abbondanza di uno specifico mrna in un campione di poli(a) RNA, anche se questa tecnica è stata ora in gran parte soppiantata dalla PCR multiplex che offre una maggiore efficienza. Per quanto riguarda l impiego dell RPA nello studio dell apoptosi, sono ad esempio disponibili kit di tipo multi-probe che permettono di valutare i livelli di oltre dieci mrna corrispondenti a proteine coinvolte nell apoptosi. Tradizionalmente si usava per la marcatura 32P-dUTP, ma ora sono disponibili anche sistemi che usano sonde non radioattive, soprattutto fluorescenti. Array per lo studio dell apoptosi La tecnologia dei DNA chip è il metodo più comunemente impiegato per determinare l abbondanza di un gene in un RNA totale o in un polia+ RNA. I DNA chip servono soprattutto come mezzo per identificare geni correlati ad uno specifico processo biologico, seguito dall uso dell MPCR per l ulteriore analisi dei geni individuati. Per lo studio dell apoptosi in topo, ratto e uomo, in commercio sono disponibili array che contengono DNA amplificato via PCR derivato da cloni di cdna corrispondenti ad alcune centinaia di geni correlati all apoptosi, alle caspasi, alla superfamiglia TNF, al pathway di Bcl-2/mitocondriale. La conoscenza del profilo di espressione di questi geni può essere molto utile per comprendere i complicati meccanismi apoptotici. I livelli relativi di espressione delle singole caspasi, ad esempio, possono influenzare la loro attività complessiva. I cdna rappresentativi delle sequenze geniche sono presenti sul vetrino in doppio o in quadruplicato al fine di garantire una significatività statistica elevata e ridurre il numero di repliche sperimentali. Ogni microarray contiene inoltre alcuni geni costitutivi e alcuni controlli per una quantificazione corretta di geni differenzialmente espressi.in figura 16 è mostrata la procedura di un tipo di array per lo studio dell apoptosi basati sulleincorporazione di dntp marcati radioattivamente e la rivelazione post ibridazione mediante Phosphor Imager. In alternativa, si possono scegliere array per lo studio dell apoptosi in cui per la marcatura dei cdna si usano coloranti fluorescenti (Fig. 17). BIBLIOGRAFIA a)kerr J.F.R., Wyllie A.H. & Currie A.R.- Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer 26, (1972) b)lowen A. BioEssays 25; , 2003 c)quattrone A. & Capaccioli S.-I geni della morte cellulare programmata. Le Scienze 326, (1995) RINGRAZIAMO LE AZIENDE CHE, FORNENDOCI IL LORO MATERIALE, HANNO RESO POSSIBILIE LA STE- SURA DI QUESTO ARTICOLO Celbio Eppendorf LGC Promochem Elisa Della Vedova Via Venezia Sesto S.Giovanni Mi Tel.02/ Fax.02/ Miltenyi Biotech Via Turrini Calderara di Reno Bo Tel.051/ Fax.051/ Prodotti Gianni Promega Roche Sigma Aldrich Via Gallarate Milano Mi Tel.02/ Fax.02/ Tebu Bio Via Pretorio Magenta Mi Tel.02/ Fax.02/ Biotecnologie Febbraio 2006