Utilizzo di sistemi LC/MS e LC/MS-MS nell'ambito del TDM dei farmaci anti-infettivi
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1 Utilizzo di sistemi LC/MS e LC/MS-MS nell'ambito del TDM dei farmaci anti-infettivi Lorena Baietto (MSc, PhD) Laboratorio di Farmacologia Clinica e Farmacogenetica Università degli Studi di Torino Facoltà di Medicina e Chirurgia, Dipartimento di Scienze Mediche Ospedale Amedeo di Savoia (Torino)
2 ARGOMENTI TRATTATI: Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico Metodi che abbiamo validato in laboratorio per il dosaggio dei farmaci antinfettivi nella pratica clinica Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel dosaggio di alcuni farmaci: - HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma Spots - UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma - UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in plasma e liquor
3 ARGOMENTI TRATTATI: Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico Metodi che abbiamo validato in laboratorio per il dosaggio dei farmaci antinfettivi nella pratica clinica Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel dosaggio di alcuni farmaci: - HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma Spots - UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma - UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in plasma e liquor
4 IL THERAPEUTIC DRUG MONITORING DEFINIZIONE: Il monitoraggio terapeutico dei farmaci è un processo che consiste nell'utilizzare le concentrazioni dei farmaci nei liquidi biologici, i principi della farmacocinetica e i criteri della farmacodinamica per ottimizzare la terapia farmacologica del singolo individuo ridurre i rischi di effetti collaterali, o tossici, ed aumentare, quindi, i benefici dati dal farmaco al paziente. MIGLIORARE L EFFICACIA E RIDURRE LA COMPARSA DI RESISTENZA
5 TDM e TERAPIA ANTINFETTIVA: Correlare l efficacia e la tossicità di un farmaco con le concentrazioni plasmatiche Studiare le interazioni con altri farmaci co-somministrati Valutare l efficacia e la tossicità in pazienti con alterazioni fisiopatologiche ( epatopatia, insufficienza renale, gravidanza, ecc.) Valutare l efficacia e tossicità in popolazioni speciali (anziani, neonati)
6 ARGOMENTI TRATTATI: Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico Metodi validati in laboratorio per il dosaggio dei farmaci antinfettivi nella pratica clinica Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel dosaggio di alcuni farmaci: - HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma Spots - UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma - UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in plasma e liquor
7 Instrument Pump model Autosampler model Detector Software Column Binary pump model Micromass ZQ mass HPLC (Waters) 717 Empower Pro software Atlantis dc-18 3µ column (150mm 2.1mm id) 1525 detector
8 valori di accuratezza e precisione < 15%
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10 Procedura di estrazione 50 µl di IS Campioni vortexati per 10 sec Campioni sonicati (cycle 0.75; amplitude 80%) Iniezione in HPLC-MS Surnatante asciugato a 60 C e ricostituito Surnatante trasferito in provette di vetro Campioni centrifugati (7000 x g, 10 min a 4 C
11 Instrument Pump model Autosampler model Detector Software Column Binary pump model Micromass ZQ mass HPLC (Waters) 717 Empower Pro software Atlantis dc-18 3µ column (150mm 2.1mm id) 1525 detector
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14 ARGOMENTI TRATTATI: Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico Metodi che abbiamo validato in laboratorio per il dosaggio dei farmaci antinfettivi nella pratica clinica Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel dosaggio di alcuni farmaci: - HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma Spots - UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma - UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in plasma e liquor
15 HPLC-MS nel dosaggio plasmatico dei farmaci antifungini
16 Antifungini triazoli Prevenzione e terapia delle infezioni fungine invasive Farmacocinetica non lineare Alta variabilità tra i pazienti Hope WW et al. Curr Opin Infect Dis. 2008;21:
17 Plasma concentrations Toxicity cut-off in therapy Itraconazole: C trough > 17.1 mg/l Voriconazole: C trough > 5.5 mg/l Posaconazole: not defined Time C trough TOXICITY INEFFICACY narrow therapeutic window Efficacy cut-off in prophylaxis Itraconazole: C trough > 0.5 mg/l Voriconazole: C trough > 0.5 mg/l Posaconazole: C trough > 0.5 mg/l Efficacy cut-off in therapy Itraconazole: C trough > 1 mg/l Voriconazole: C trough > 2 mg/l Posaconazole: C trough > 1 mg/l Andes D et al. Antimicrob Agents Chemother 2009;53(1):24-34; Lestner JM et al. Clin Infect Dis. 2009;49:
18 Instrument Pump model Autosampler model Detector Software Column Binary pump model Micromass ZQ mass HPLC (Waters) 717 Empower Pro software Atlantis dc-18 3µ column (150mm 2.1mm id) 1525 detector Procedura di estrazione: 50 µl di IS 200 µl di acetonitrile 200 µl di campione Vortex per 10 sec Cetrifug. per 10 min a rpm Diluire SN 1:1 con acqua Iniezione in HPLC-MS
19 Parametri valutati secondo le linee guida FDA 1 Accuratezza Precisione Selettività Sensibilità ACCURATEZZA e PRECISIONE Valori di accuratezza e precisione < 15% Drugs ITC PSC VRC Nominal value Accuracy Precision (R.S.D.%) (mg/l) (%) Intra-day Inter-day FDA. Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation; 2001.
20 SELETTIVITA e SENSIBILITA LOQ Blank plasma Assenza di picchi interferenti in plasma bianco Buon limite di quantificazione (LOQ) che permette di quantificare anche le basse concentrazioni in modo preciso e accurato.
21 HPLC system Detector Extraction procedure Dry Step LLOQ (mg/l) Time of analysis (min) References HPLC UV SPE Yes Gordien et al HPLC MS-MS Protein precipitation No nr Chahbouni et al HPLC MS-MS Protein precipitation No Verdier et al HPLC MS Protein precipitation No Baietto et al UPLC MS-MS Protein precipitation No Decosterd et al UPLC UV Protein precipitation Yes Wissen et al HPLC MS-MS SPE Yes Beste et al Facile e rapida procedura di estrazione (turn around time = 1 day) Piccolo volume di plasma necessario Utilizzo della Quinoxaline come IS Curva di calibrazione adatta alle concentrazione attese nella pratica clinica Ad oggi abbiamo analizzato circa 700 campioni provenienti dal Regina Margherita e Molinette Gordien JB et al. J Pharm Biomed Anal 2009;50(5):932-8; Chahbouni A at al. Ther Drug Monit 2010;32(4):453-7; Verdier MC et al. Clin Chem Lab Med 2010;48(10): ; Baietto L et al. Antimicrob Agents Chemother 2010;54(8): ; Decosterd LA et al. Antimicrob Agents Chemother 2010;54(12): ; Wissen at al. Beste KY et al. Clin Chim Acta 2012;413(1-2):240-5.
22 MS vs UV MS permette di avere migliore sensibilità e specificità rispetto a UV. Procedura di estrazione su MS è più rapida e non richiede asciugatura (curva, qc e 2 campioni estratti in 30 min con metodo HPLC-MS). Metodo su MS richiede minor volume di plasma (200 µl vs 300 µl). Corsa su MS più rapida (15 min vs 18 min). Possibilità di fare più iniezioni dello stesso campione (5 vs 1).
23 Certificato relativo all Interlaboratory Quality Control Program for TDM of antifungal drugs.
24 HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in plasma spottato su supporto Dried Plasma Spots
25 Dried blood spots (DBS) o dried plasma spots (DPS)? Nuovo metodo di raccolta dei campioni Campioni di sangue e di plasma possono essere conservati e inviati a temperatura ambiente (solo per farmaci stabili a R.T.) DPS migliori di DBS (studi clinici si riferiscono a livelli plasmatici; per DPS non è necessario correggere la concentrazione plasmatica per l ematocrito). DPS DBS
26 PROCEDURA DI ESTRAZIONE ul di plasma sono spottati su DSSD 2. Filtri vengono asciugati a r.t. per 30 min 3. Filtri vengono arrotolati e trasferiti in una provetta 4. Aggiunta di soluzione estraente e IS 5. Effettuato il tumbling per 15 min at 40 rpm 6. Fase organica è evaporata a 50 C 7. Campioni ricostituiti e iniettati in HPLC-MS
27 Percentage remaining (%) Stabilità a temperatura ambiente dei triazoli su DPS ITC PSC VRC Time (day) dopo 2 settimane degradazione <17%. Baietto L et al. J. Antimicrob. Chemother. 2012;67:
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29 Correlazione tra metodo DPS e metodo non-dps r 2 =0.994 r 2 =0.991 Alta correlazione tra i due metodi di estrazione. r 2 =0.959 Linear regression statistically significant (P<0.0001)
30 UPLC-MS-MS e dosaggio plasmatico della colistina
31 COLISTINA Antibiotico lipopeptidico usato come ultima chance di difesa contro Psudomonas e Acinetobacter in pazienti critici Formata da 30 polimixine, le principali sono la colistina A e la colistina B Formulazione orale COLISTINA SULFATO Formulazione endovena COLISTIMETATO (pro-farmaco) Idrolisi tempo, matrice e temperatura dipendente Idrolisi in vivo COLISTINA
32 UPLC-MS-MS Alta selettività dell analisi (molti farmaci concomitanti) Alta sensibilità (volume di plasma piccolo e basse concentrazioni plasmatiche attese, precipitazione e iniezione diretta) Tempi di analisi in UPLC più rapidi Riduzione consumo di solvente
33 Procedura di estrazione Colistina totale IS (polimixina) 200 µl di plasma Acido solforico 0.5 M Aspettare 30 min NaOH 1M Soluzione precipitante Vortex Centrifug a rpm x 10 min a 4 C Surnatante trasferito in vials e diluito 1:1 con acqua Iniezione in UPLC Colistimetato Colistina libera Soluzione precipitante + IS (polimixina) 200 µl di plasma Vortex Centrifug a rpm x 10 min a 4 C Surnatante trasferito in vials e diluito 1:1 con acqua Iniezione in UPLC Instrument Pump model Autosampler model Detector Software Column ACQUITY Binary Solvent ACQUITY Sample UPLC (Waters) TQ Detector MassLynx Acquity UPLC HSS C18 1.8µm (2.1x150mm) Manager Manager
34 Colistimetato no idro Colistina A Colistimetato no idro Colistina B Mix CMS NO idro 1 Mix Mix 3.40 F2:MRM of 1 channel,es Mix CMS NO idro >101.2Mix Mix 4.600e F1:MRM of 1 channel,es > e % Colistina A % min min Colistimetato idro Colistina A totale Colistimetato idro Colistina B totale CMS idro 24h 1 Smooth(Mn,2x2) autosampler stability stabilita' 24 h idro Colistina A F2:MRM of 1 channel,es > e CMS idro 24h 1 Smooth(Mn,2x2) autosampler stability stabilita' 24 h idro Colistina B * F1:MRM of 1 channel,es > e+003 [10 µg/ml] % % min min
35 Concentrazione plasmatica Colisitina (ng/ml) Concentrazioni plasmatiche colistina 20,000 18,000 16,000 14,000 Colistina Totale Colistina libera Colistimetato 12,000 10,000 8,000 6,000 4,000 2, Timing (hour)
36 HPLC system Detector Extraction procedure Dry Step Time of analysis (min) References HPLC FL (derivatizzazione) SPE No 18 Li et al (in rat plasma) HPLC MS-MS Protein precipitation No 10 Jansson et al HPLC MS-MS SPE Yes 3.8 Gobin et al UPLC MS-MS Protein precipitation No 6 Baietto Li J et al. AAC 2002;46(10): ; Jansson B et al. J.Pharm.Biomed.Analys. 2009(49): ; Gobin P et al. AAC 2010;54(5):
37 Effetto matrice Alterazione dell efficienza della ionizzazione dovuto alla presenza di sostanze coeluenti che può compromettere l affidabilità dei risultati. Matrici biologiche sono miscele molto complesse Interferenza più frequente nel caso si utilizzi spettrometro a singolo quadrupolo piuttosto che a triplo quadrupolo. Rimedi: ottimizzare processo estrazione ottimizzare separazione cromatografica
38 Tempi di ritenzione diversi Recupero >90% Effetto matrice <15%
39 UPLC-MS-MS e dosaggio della daptomicina in plasma e liquor
40 Daptomicina Antibiotico lipopeptidico usato nelle infezioni a carico di cute e tessuti molli e nelle endocarditi del cuore destro sostenuti da MRSA. Valida opzione terapeutica nel trattamento delle infezioni a carico del Sistema Nervoso Centrale come le meningiti sostenute da MRSA.
41 Daptomycin TDM Efficacy cut-off: Cmax > 60 mg/l Cmax Toxicity cut-off: Cmin > 24.3 mg/l Cmin Pea et al The Annals of Pharmacotherapy. July/August, Volume 45,e37; Bhavnani SM, Rubino CM, Ambrose PG, Drusano GL Clin Infect Dis ;50: )
42 Daptomicina Antibiotico lipopeptidico usato nelle infezioni a carico di cute e tessuti molli e nelle endocarditi del cuore destro sostenuti da MRSA. Valida opzione terapeutica nel trattamento delle infezioni a carico del Sistema Nervoso Centrale come le meningiti sostenute da MRSA. valutare la farmacocinetica liquorale della daptomicina in pazienti portatori di Derivazione Ventricolare Esterna (DVE) con sospetto di SIRS-Sepsi o Shock settico di qualsiasi origine, richiedente una terapia empirica per cui la somministrazione di Daptomicina è indicata
43 Response Residual Analisi daptomicina in plasma QC H 1 plasma Smooth(Mn,5x5) qc qc % Compound name: Daptomicina Coefficient of Determination: R^2 = Calibration curve: e-005 * x^ * x Response type: Internal Std ( Ref 2 ), Height * ( IS Conc. / IS Height ) 0 Curve type: 2nd Order, Origin: Force, Weighting: 1/x, Axis trans: None % Daptomicina QC H 1 plasma Smooth(Mn,6x6) qc qc QX (IS) F1:MRM of 4 channels,es > e+005 min F2:MRM of 2 channels,es > e+005 Sample Name Std. Conc RT IS Area %Dev ng/ml QC H QC M QC L QC H QC M QC L QC H QC M QC L QC H QC M QC L QC H QC M QC L QC H QC M QC L ng/ml min r 2 = ng/ml
44 Cromatogrammi relativi a LOQ e bianco estratti da liquor Daptomicina [0.078 µg/ml]
45 Vantaggi metodo sviluppato Rapida procedura di estrazione Ampio range di calibrazione per plasma e liquor Buona accuratezza e precisione del metodo Buona sensibilita del metodo
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47 Conclusioni Rilevatore massa e massa-massa sono adatti sia alle analisi di routine, sia alla ricerca perchè permettono di avere risultati accurati, precisi e altamente selettivi. L alta sensibilità e specificità permettono di utilizzare metodi di estrazione rapidi (es. precipitazione proteica) riducendo i tempi necessari alla preparazione del campione.
48 Ringraziamenti Prof. Di Perri Dr. Antonio D Avolio Dr. Andrea Calcagno Prof. Francesco Giuseppe De Rosa Prof. Stefano Bonora Dott.ssa Jessica Cusato Dott. Marco Simiele Dott.ssa Alessandra Ariaudo Dott. Amedeo De Nicolò Dott.ssa Cristina Marra Agnese Sofia De Nigris Mauro Sciandra
DSSD per Therapeutic Drug Monitoring e Farmacogenetica.
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