I β Glucani rafforzano la risposta immunitaria innata e sono farmacologicamente classificati come modificatori della risposta biologica
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- Simona Lillo
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1 Jarek Baran, Daniel J. Allendorf, Feng Hong e Gordon Ross D. ¾Tumor immunobiology Program University of Louisville, USA ¾Dep. of Clinical Immunology, Polish American Institute of Pediatrics Universityy Medical College g Cracow, Poland FOLIA HISTOCHEMICA ET CYTOBIOLOGICA Vol.45, N 2, 2007 pp
2 I beta (1 3) D glucani, identificati quasi 40 anni fa, sono polisaccaridi a catena lunga, contenenti glucosio. Sono i maggiori componenti strutturali della parete cellulare dei ifunghi, lieviti iti ed alcuni ibtt batteri I β Glucani rafforzano la risposta immunitaria innata e sono farmacologicamente classificati come modificatori della risposta biologica
3 Innumerosi numerosi modelli animali i β Glucani hanno dimostratoavere avere notevoli attività anti infettive ed anti tumorali L effetto immuno farmacologico più importante è la capacità di attivare i neutrofili, macrofagi e cellule NK. Glucani ad elevato PM o particelle di glucani corpuscolate, attivano direttamente i linfociti, stimolando la loro capacità fagocitica e citotossica: produzionep di ROS produzione di mediatori dell infiammazione (citochine) A livello molecolare, l interazione con la M2 integrina CR3 è responsabile della risposta dei leucociti (umani e murini) al legame (ad alta affinità) coi β Glucani Recentemente è stato scoperto, oltre all integrina CR3, un altro recettore specifico dei β Glucani : la DECTIN 1 1, espressa sui macrofagi, neutrofili, NK, cellule B e sottopopolazioni dei T, capace di attivare queste cellule.
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5 Marcata disregolazione del bilancio delle risposte Th1 e Th2, in corso di cancro, caratterizzarata da: PREDOMINANZA della risposta di tipo Th2 PROGRESSIVA PERDITA della risposta di tipo Th1
6 Cellula tumorale e resistenza al tumore Sappiamo che le cellule Th1 stimolano la risposta dei linfociti citotossici, mentre le cellule Th2 la sopprimono (a favore di quella umorale) Il bilancio citochinico tra i Th1/Th2 è cruciale per una resistenza allo sviluppo di tumori. Una immunoterapia che agisca abolendo la predominanza Th2 e promuovendo un incremento della risposta Th1, migliora la resistenza dell organismo al cancro
7 Ilmodelloanimale utilizzatoè il TOPO (Balb/c mice). Sono state impiantate nel tessuto adiposo sottocutaneo mammario, cellule di tumore della mammella, Ptas 64 cells: una linea cellulare tumorale che esprime un antigene virale di membrana (MMTV) rilevabile con Ab monoclonali 11C1. Il protocollo terapeutico sperimentale prevede la somministrazione di mabs anti tumore (11C1 mab) seguiti da β Glucani dati oralmente. Successivamente saranno dosate le citochine intracellulari prodotte dai linfociti del sangue periferico dei Balb/c mice con tumore, a cui sono stati somministrati o meno Ab 11C1 (antitumore) coadiuvati da β Glucani
8 Topi con tumori mammari sottoposti a terapia (i.v.) con anticorpi anti tumore combinati o meno con una sospensione di Particelle Intere di Glucani (WGP) [somministrata per via orale (WGP, 400 μ g ogni 24 ore)] In corso di cancro si verifica una disregolazione delle risposte Th2/Th1, caratterizzata da DOMINANZA della risposta Th2 e un PROGRESSIVA PERDITA di quella Th2. Th2 Th1
9 Si ipotizza che dopo il trattamento con Ab + WGP vi sia un: incremento della risposta Th1 (IFNγ) decremento di quella Th2 (IL 4) Th2 Th1
10 Inoculate 05x10 0,5x10 6 Ptas 64 cells
11 Tumore palpabile Inoculate 0,5x106 Ptas 64 cells (nel siero già sono presenti Ab 11C1) T Terapia : (sulla loro membrana è presente l Ag MMTV, rilevabilie con mab 11C1) Ogni Ogni 3 giorni somministrati (i.v.) 200 µg di mab 11C1 Tutti i giorni somministrati (i.v.) 400 µg di WGP (particelle di glucani) [4 mg/ml] Ogni Ogni 3 giorni misurato DIAMETRO del tumore
12 WGP: Whole Glucan Particle (particelle intere di glucani) purificati da lieviti attraverso una serie di estrazioni alcaline ed acide. Per rimuovere la contaminazione di LPS, sono stati risospesi in 200 mm NaOH per 20 a TA e lavati con acqua LPS free ed in fine risospesi in PBS LPS free a dare una concentrazione finale di 4 mg/ml. Preparazione del campione di Macrofagi Peritoneali: A gruppi di topi Balb/c e topi C57B1/6 wild type, sono stati dati 3 ml di WGP (4mg/ml) o PBS (come controllo). Dopo 5 giorni è stato prelevato l essudato peritoneale ricco di macrofagi, dei due gruppi di topi. L essudato Lessudato (da topi trattati sia con WGP che con PBS) è stato pellettato e le cellule risospese in ice cold RPMI 1640 con 5% FBS, e mantenuti in ghiaccio fino all analisi.
13 ANALISI CITOFLUORIMETRICA delle citochine intracellulari nel Sangue Periferico: Un giorno dopo la fine della terapia (23 giorno) i topi vengono anestetizzati e sacrificati, prelevandone il sangue periferico che viene raccolto in tubi con Citrato di Sodio come anticoagulante. Per bloccare la secrezione di citochine, il sangue è trattato con Monensina [1 mg/ml] (GolgiStop, BD Pharmingen). I CD4+ sono identificati attraverso marcatura con Anticorpi coniugati: anti CD3 con Cy Chrome e anti CD4 con FITC. Dopo la lisi dei globuli rossi ed un lavaggio con PBS, i leucociti sono fissati e permeabilizzati con Cytofix/Cytoperm y Solution (BD Pharmingen). Dopo la permeabilizzazione le cellule saranno lavate 2 volte con Perm/Wash Solution (BD Pharmingen) e sarà eseguita la marcatura delle citochine intracellulari con mab PE coniugati contro mouse IL 4 e IFN g.
14 ANALISI CITOFLUORIMETRICA delle citochine intracellulari nei Macrofagi peritoneali: Per analizzare i MACROFAGI PERITONEALI,, le cellule presenti nell essudato saranno inizialmente marcate con mab FITC coniugati F4/80. In seguito saranno fissate e permeabilizzate (come prima) ed eseguita la marcatura delle citochine intracellulari con mab anti IL 12 PE coniugati. Per dimostrare la specificità della marcatura con l anticorpo PE anti citochina, è eseguita una pre incubazione (prima che le cellule siano fissate e permeabilizzate) con un eccesso di mab anti citochina non marcati. Dopoche le cellule saranno lavate 2 volte con Perm/Wash Solution (BD Pharmingen), i campioni saranno analizzati utilizzando FACScan flow cytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Palo Alto, CA) e CellQuest v3.1 software.
15 MISURAZIONI DEL DIAMETRO DEL TUMORE Ogni 3 giorni dall inizio della terapia, il diametro del tumore è stato misurato con un compasso, paragonando diversi gruppi: 1 gruppo: somm. 200 ug di 11C1 mab ogni 3 gg 2 gruppo: somm. 200 ug di mab ogni 3 gg ug di WGP giornalmente 3 gruppo: somm 400 ug di WGP giornalmente con iniezione intragastrica 4 gruppo: somm. soltanto PBS come controllo 4 gr 3 gr 1 gr 2 gr 4 gr 1 gr 3 gr 2 gr
16 DIMINUISCE LA PRODUZIONE DI CITOCHINE Th2 (come l IL 4) La proporzione di linfociti producenti IL 4 è stata misurata attraverso citometria a flusso. mab 11C1 mab 11C1 + WGP Leucociti da sangue periferico di topi con tumore mammario sviluppatosi dopo impianto di cellule Ptas/64, trattati con mab 11C1 da soli o combinati con somministrazione giornaliera di WGP. Si osserva una spiccata diminuzione della sintesi di citochine Th2 (l IL 4) nei topi con la terapia adiuvante con WGP E stata anche fatta l analisi del sangue di topi con tumore a cui sono stati somministrati WGP da soli, ed il risultato è sovrapponibile a quello che si osserva con topi con somministrazione di mab 11C1 senza WGP (dato non mostrato).
17 AUMENTA LA PRODUZIONE DI CITOCHINE Th1 (come l IFN g) La proporzione di linfociti producenti IFN g è stata misurata attraverso citometria a flusso. mab 11C1 mab 11C1 + WGP Leucociti da sangue periferico di topi con tumore mammario sviluppatosi dopo impianto di cellule Ptas/64, trattati con mab 11C1 da soli o combinati con somministrazione giornaliera di WGp. Si osserva un incremento della sintesi di citochine Th1 (l IFN g) nei topi con la terapia adiuvante con WGP
18 I MACROFAGI PERITONEALI PRODUCONO IL 12 IN VIVO La proporzione di macrofagi producenti IL 12 12stata misurata attraverso citometria a flusso. PBS WGP Macrofagi ottenuti dall essudato peritoneale di topi Balb/c e di topi wt C57B1/6, trattati con iniezione intragastrica di PBS o di WGP. Si osserva un incremento della sintesi di citochine Th1 (l IFN g) nei topi dopo l iniezione di WGP Risultato simili si sono avuti sia con topi topi Balb/c e che topi wt C57B1/6.
19 L efficacia terapeutica degli anticorpi anti tumore tumore è significativamente maggiore combinata con la somministrazione simultanea del β glucano. In questo studio hanno dimostrato che l immunoterapia del carcinoma mammario in topi, coadiuvata dai Glucani, riequilibra le risposta Th1/Th2 convertendo la risposta immunitaria non protettiva Th2 in quella protettiva Th1. Ciò è stato confermato dii dai risultati iche: la percentuale di cellule T CD4 + che producono citochine Th1, come ad esempio IFN γ, è notevolmente aumentata la l percentuale di cellule l T CD4 + che producono citochine Th2, come ad esempio IL 4, ha avuto un notevole calo dopo trattamento con WGP
20 I benefici dell utilizzo dei β glucani come agenti immunoterapici per trattamento del cancro, è praticata in Giappone sin dai primi anni 80 del XX secolo Il consumo di un fungo commestibile (Lentinus edodes) trovato in Giappone, combinato al trattamento terapico di pazienti con cancro gastrico e colorettale, in fase avanzata o ricorrente, ha portato ad un aumento della durata di vita. La somministrazione dei glucani spesso utilizzata in clinica è scomoda per la potenzialità di sviluppare fenomeni di intolleranza a causa delle proprietà allergeniche. Il WGP è libero da questi inconvenienti. In conclusione i dati forniscono ulteriori prove dell efficacia del β glucano, nell immunoterapia dei tumori. Oltre al legame con il CR3 dei granulociti, che innesca l'uccisione delle cellule tumorali ic3bopsonizzate, il β glucano attiva la risposta Th1 favorendo attività CITOTOSSICA. Anche se in molti tumori solidi i Linfociti Citotossici (CTL) non sono in grado di far regredire il tumore perché non hanno la capacità di raggiungere le cellule tumorali in quantità sufficienti per ucciderle, incrementare la componente dei CTL è necessario per instaurare una resistenza al tumore. Si realizzerebbe così un pool difensivo di granulociti e CTL, contemporaneamente attivi, quali mezzi per rendere più efficace l eliminazione dei tumori.
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