PROGETTO DI RICERCA Presentato da Dr. Adele Chimento partecipante al Bando Giovani ricercatori

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1 PROGETTO DI RICERCA Presentato da Dr. Adele Chimento partecipante al Bando Giovani ricercatori RUOLO DELL ESPRESSIONE DELL AROMATASI E DEGLI ESTROGENI NEL PROCESSO DI TUMOROGENESI TESTICOLARE Stato delle conoscenze e scopo della ricerca Il recettore androgenico, il recettore estrogenico α, il recettore estrogenico β ed il citocromo P450 aromatasi, enzima codificato dal gene CYP19 che catalizza la conversione degli androgeni in estrogeni, si presentano spesso colocalizzati nell apparato riproduttivo maschile con un pattern di espressione cellulo-specifica (1,2). Da ciò si deduce come sia importante per l omeostasi funzionale dell intero tratto genitale maschile un bilanciato rapporto tra azione androgenica e azione estrogenica. L attività aromatasica è regolata principalmente a livello dell espressione genica ed è presente lungo tutte le fasi maturative del gamete maschile nell uomo (3-6). Il gene CYP19 presenta diversi promoter utilizzati in modo tessuto-specifico (7). Il promoter II, quello più vicino al sito d inizio della trascrizione (8), è capace di regolare l espressione di tale enzima nel testicolo umano, fetale ed adulto (9). Lo stesso tipo di promoter è stato evidenziato anche nelle cellule del Leydig, del Sertoli e germinali nel ratto (10) al pari che nelle linee cellulari di Leydigioma di ratto (R2C e H540) (11,12). Specifiche sequenze appaiono soprattutto coinvolte nella regolazione dell espressione dell aromatasi: 1) una sequenza (AGGTCA) che contiene un emisito (NRE) collocato a 90 relativamente dall inizio della trascrizione che lega recettori nucleari orfani quali SF-1 e LRH-1. (13,14); 2) sequenze simili agli elementi responsivi all AMP ciclico (CRE like sequence) localizzate upstream rispetto alla prima (nel ratto in posizione 169 (TGCACGTCA), 335 (TGAACTCA) e 231 (TGAAATCA) (13) e leganti proteine della famiglia CREB/ATF (13, 15,16). Recentemente il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato che l SF-1 (steroidogenic factor 1) è localizzato principalmente nelle cellule del Sertoli, LRH-1 (liver homologue receptor -1) è presente nelle cellule germinali, mentre entrambi i fattori trascrizionali sono presenti nelle cellule del Leydig primarie di ratto dove regolano positivamente l espressione dell aromatasi (17). L interesse allo studio di tali fattori deriva soprattutto dalla loro capacità di essere coattivatori per le proteine regolate dal camp della famiglia CREB-ATF, dando così una chiave alla lettura delle basi molecolari delle sinergie esistenti tra queste proteine e LRH-1/SF-1 nel regolare l espressione dell aromatasi. Il ruolo attivatore dell SF-1/LRH-1 sull espressione dell aromatasi appare antagonizzato da un altra famiglia dei recettori orfani, la NROB di cui fanno parte DAX-1 (dosagesensitive sex reversal, adrenal hypoplasia congenita (AHC) critical region on the X chromosome, gene 1) (NROB1) e SHP (Short Heterodimeric Partner) (NROB2) (18,19). Tra i membri della famiglia CREB-ATF potenzialmente coinvolti nella regolazione dell espressione dell aromatasi nel testicolo particolarmente interessante è la proteina CREM. Tale proteina ha una struttura esonica omologa a CREB, ma è tessuto specifica e presenta l espressione più elevata nel testicolo (20,21). CREM presenta delle isoforme che eterodimerizzano con CREB di tipo attivatorio (CREM τ1, τ2) presenti solo nei testicoli adulti, e di tipo inibitorio (CREM α, β, γ) prevalentemente espressi nei testicoli immaturi (21-23). Particolarmente interessante è anche il prodotto tronco inibitorio del CREM definito ICER (inducible camp early responsive) che eterodimerizza con CREM e CREB, è sganciato dalla regolazione di PKA ed è un potente repressore della trascrizione camp-dipendente (24). Gli estrogeni, come risultato dell attività aromatasica, sono prodotti dai testicoli dal periodo fetale e per tutta l età adulta, ed agiscono grazie ai recettori degli estrogeni (ERs), modulando la trascrizione di geni specifici (25, 26). Sono stati individuati due isoforme degli ERs denominati

2 ERα ed ERβ che sono stati individuati entrambi nei testicoli in tutte le età, suggerendo un ruolo degli estrogeni nella funzione e nello sviluppo testicolare (27,28). La distribuzione mirata dei geni che codificano per ERα o per l aromatasi indicano che gli estrogeni sono essenziali per la normale fertilità maschile (29). D altra parte è stato osservato come non solo gli estrogeni prodotti localmente sono sufficienti ad indurre cambiamenti neoplastici nel tessuto mammario (30), ma un loro eccesso nei roditori stimola l iperplasia delle cellule del Leydig (LCH) associata a criptorchidismo, cancro testicolare, e alterazioni della spermatogenesi (31,32,33). Tuttavia il ruolo della produzione estrogenica in situ come risultato di una alterata espressione dell aromatasi nella tumorogenesi delle cellule testicolari, non è stato ancora definito. Diverse sono le evidenze che supportano l esistenza di tale correlazione. Ad esempio, topi transgenici over-esprimenti l aromatasi possiedono alti livelli di estrogeni e sviluppano tumori delle cellule del Leydig (34). Proprio partendo da queste osservazioni, lo scopo di tale progetto di ricerca è quello di investigare i meccanismi molecolari che determinano l over-espressione dell aromatasi nelle cellule del Leydig tumorali. Infatti non è stato ancora definito se tale over-espressione e la conseguente aumentata produzione estrogenica sia una causa o un epifenomeno dell insorgenza di tali Leydigiomi. Poiché l espressione dell aromatasi nel testicolo di ratto varia nei diversi compartimenti cellulari in base all età, facendo presumere la presenza di meccanismi molecolari probabilmente guidati da fattori di trascrizione cellulo-specifici, scopo di tale progetto di ricerca sarà quello, in primo luogo, di investigare l espressione ed il ruolo dei più importanti fattori trascrizionali coinvolti nell espressione del gene CYP19. L ipotesi di studio è che l aumentata espressione del gene CYP19 possa essere determinata da un alterata espressione di fattori di trascrizione presenti in maniera specifica nelle cellule del Leydig tumorali. Successivamente saranno valutati gli effetti degli estrogeni e conseguentemente gli effetti di molecole antiestrogeniche, quali ICI e idrossitamoxifene o inibitori dell aromatasi quali il Letrozole, sulla proliferazione delle cellule del Leydig tumorali. Tali dati daranno una prima indicazione sperimentale sulla possibilità di utilizzare tali farmaci, già largamente utilizzati nella terapia di altri tumori estrogeni-dipendenti, anche nel carcinoma delle cellule del Leydig, tumore raro ma estremamente aggressivo. Contributo che l attività proposta potrà dare allo sviluppo delle conoscenze del settore Studio dei fattori trascrizionali responsivi all AMP ciclico I siti CRE e di conseguenza i fattori di trascrizione che legano tali siti, ricoprono un importanza fondamentale nella regolazione dell espressione del gene CYP19. La scoperta di un nuovo fattore di trascrizione appartenente alla famiglia CREB/ATF che risulta essere tessuto-specifico e particolarmente espresso nelle cellule germinali del testicolo denominato CREM, ci ha indotto ad indagare un possibile ruolo di CREM anche nelle cellule somatiche del testicolo, ed in particolare, nel modulare l espressione del gene CYP19 nelle cellule del Leydig. Come modelli sperimentali utilizzeremo una linea cellulare murina immortalizzata (TM3) di Leydig, come controllo, ed una linea cellulare di Leydigioma di ratto (R 2 C), quest ultima particolarmente adatta al nostro studio in quanto esprime in maniera costitutiva l enzima aromatasi. Inoltre è stato rilevato che nelle cellule R2C l alta e costitutiva espressione di tale enzima non è modulabile da sostanze che attivano la via del camp, dal momento che l aggiunta di analoghi dell camp non solo non aumenta i livelli di attività aromatasica, ma addirittura ne determina una lieve down-regolazione (12). Abbiamo dunque ipotizzato che una delle cause della over-espressione dell aromatasi possa essere dovuta alla presenza di una via dell AMP ciclico attiva in maniera costitutiva che determina un fattore CREB fosforilato in maniera costante. L ulteriore aggiunta di camp esogeno potrebbe indurre una

3 attivazione dell isoforma inibitoria di CREM, ICER, che andrebbe ad alterare tale equilibrio bloccando l espressione del CREB e dell aromatasi e determinando, quindi, la down-regolazione dell attività aromatasica. Investigheremo tali ipotesi studiando l espressione di ICER e del fattore CREB fosforilato tramite Western Blotting sulle cellule R2C in condizioni basali. Successivamente investigheremo il pattern di espressione di entrambi questi due fattori nelle R2C dopo stimolazione con un attivatore della PKA, la forskolina (FSK), a diversi tempi. Nelle stesse condizioni sperimentali misureremo sia l espressione dell mrna che l attività del citocromo P450 aromatasi. Studio dei fattori trascrizionali leganti siti NRE E noto come la trascizione del gene CYP19 richiede il coinvolgimento del sito NRE a cui si legano nelle cellule del Leydig primarie di ratto principalmenete i recettori nucleari SF-1 e LRH-1, dove regolano positivamente l espressione dell aromatasi (17). Recentemente è stato dimostrato che basse concentrazioni del plasmide di LRH-1 in cellule del Leydig immortalizzate di topo (TM3) determinano una maggiore efficienza sia dell induzione di base che di quella camp indotta rispetto all SF-1. Inoltre, in condizioni basali, né l espressione di LRH-1 né di SF-1 determinano una induzione dell attività del promoter in cellule del Sertoli immortalizzate murine (TM4) indicando che in queste ultime l azione di SF-1 è capace solo di potenziare la stimolazione camp-dipendente del sito CRE ma non è sufficiente a determinare un induzione dell aromatasi, mentre nelle cellule del Leydig questi recettori nucleari orfani sembrano essere capaci di guidare sia una trascrizione basale che una via camp-dipendente (17). Pertanto lo scopo di questa seconda parte del progetto è quella di investigare se nelle R2C il pattern di espressione di entrambi questi fattori fosse alterato. Investigheremo, dunque, sia a livello di mrna messaggero che a livello di espressione proteica, se le R2C presentano una over-espressione dei fattori SF-1 o LRH-1 comparato a quello espresso in linee cellulari primarie di ratto o rispetto a linee cellulari murine immortalizzate (TM3). Inoltre effettuando delle co-trasfezioni transienti, utilizzando cellule TM3 e R2C, con un plasmide di espressione di SF-1 ed un plasmide reporter per la luciferasi coniugato con il promoter II del gene dell aromatasi, valuteremo se l introduzione di SF-1 esogeno nelle R2C sortisce gli stessi effetti osservati sulle cellule non tumorali TM3. Studio dell azione modulatrice del recettore nucleare DAX-1 Recentemente diversi lavori stanno mettendo in luce l azione modulatrice dei due recettori nucleari orfani DAX-1 e SHP, su diversi fattori di trascrizione che modulano l espressione di enzimi della steroidogenesi. In particolare è stato messo in evidenza l azione di repressione da parte di DAX-1 e SHP rispettivamente della transattivazione di SF-1 e di LRH-1 del promoter di CYP19 in trasfezioni transienti in vitro nelle cellule TM3 (35). In un recente lavoro è stato rilevato come nelle R2C il fattore DAX-1 non sia espresso (36). Inoltre, è stato osservato che topi knockout per il gene DAX-1 hanno una elevata espressione dell aromatasi nel tessuto testicolare associata a tumori bilaterali della linea leydigiana e sertoliana (19). Partendo, dunque, da questi dati di letteratura abbiamo ipotizzato che l assenza del DAX-1 nelle R2C possa determinare una iperattivazione dell SF-1 e quindi una elevata attività aromatasica. Al fine di dimostrare tali ipotesi effettueremo degli esperimenti di trasfezione con dosi crescenti di DAX-1 esogeno nelle R2C, valutando se l aggiunta ectopica di tale fattore determini una diminuzione dell attività aromatasica nelle R2C. Ruolo degli estrogeni nella proliferazione delle cellule R2C. In questa ultima fase del progetto determineremo se l alterata espressione dell aromatasi e la conseguente produzione autocrina degli estrogeni influisce sulla proliferazione delle cellule R2C e quindi sul meccanismo di progressione tumorale.

4 Valuteremo, dunque, se diverse concentrazioni di E2 e/o molecole antiestrogeniche, quali ICI e idrossitamoxifene o inibitori dell aromatasi quali il Letrozole, influenzano la proliferazione delle cellule R2C. Tali dati daranno una prima indicazione sperimentale sulla possibilità di utilizzare tali farmaci, già largamente utilizzati nella terapia di altri tumori estrogenidipendenti, anche nel carcinoma delle cellule del Leydig, tumore raro ma estremamente aggressivo. Risultati attesi I dati ottenuti porteranno alla pubblicazione di almeno un articolo su una rivista internazionale nel campo dell oncologia endocrina e verranno comunicati in congressi internazionali e nazionali. Bibliografia 1. Pelletier G. et al Localization of oestrogen receptor alpha, oestrogen receptor beta and androgen receptors in the rat reproductive organs. J. Endocrinol. 165: Sharpe RM The role of oestrogen in the male. Trends Endocrinol. Metab. 9: Aquila et al J Clin Endocrinol Metab 87: Aquila et al Human Reproduction 18: Andò S Human Reproduction. 19 (1) : Inkster et al J Clin Endocrinol Metab 80: Simpson ER et al Aromatase cytochrome P450, the enzyme responsible for estrogen biosynthesis. Endocr. Rev. 15: Means GD et al Tissue-specific promoters regulate aromatese cytochrome P450 gene expression in human ovary and fetal tissues. Mol. Endocrinol. 5: Bulun SE et al Use of tissue-specific promoters in the regulation of aromatase cytochrome P450 gene expression in human testicular and ovarian sex cord tumors as well as in normal fetal and adult gonads. J. Clin. Endocrinol. Metab. 77: Lanzino M et al Aromatase messenger RNA is derived from the proximal promoter of the aromatase gene in Leydig, Sertoli, and germ cells of the rat testis. Biol. Reprod. 64: Lephart ED et al The structure of cdna clones encoding the aromatase P-450 isolated from a rat Leydig cell tumor line demonstrates differential processing of aromatase mrna in rat ovary and a neoplastic cell line. Mol. Cell Endocrinol. 70: Young M. et al Expression of aromatase cytochrome P450 in rat H540 Leydig tumors cells. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 63: Fitzpatrick SL, Richards JS cis-acting elements of the rat aromatase promoter required for cyclic adenosine 3',5'-monophosphate induction in ovarian granulosa cells and constitutive expression in R2C Leydig cells.mol. Endocrinol. 7: Young M., McPhaul MJ A steroidogenic factor-1-binding site and cyclic adenosine 3,5 - monophosphate respons element like elements are required for the activity of the rat aromatase promoter in rat Leydig tumor cell lines. Endocrinology 139: Carlone DL, Richards JS Functional interactions, phosphorylation and levels of 3,5 - cyclic adenosine monophosphate-regulatory element binding protein and steroidogenic factor-1 mediate hormone-regulated and constitutive expression of aromatase in gonadal cells. Mol. Endocrionol. 11: Fitzpatrick SL, Richards JS Identification of a cyclic adenosine 3,5 -monophosphaterespons element in the rat aromatase promoter that is required for transcriptional activation in rat granulosa cells and R2C Leydig cells. Mol. Endocrinol. 8:

5 17. Pezzi V. et al Differential expression of SF-1/AD4BP and LRH-1/FTF in the rat testis: LRH-1 as a potential regulator of testicular aromatase expression. Endocrinology. 145(5): Giguere V Orphan nuclear receptors: from gene to function Endocrine Rev. 20 (5): Wang ZJ et al Aromatase (Cyp19) expression is up-regulated by targeted disruption of Dax1.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: Foulkes NS et al CREM gene: use of alternative DNA-binding domains generates multiple antagonists of camp-induced transcription.cell 64: Laoide BM et al The functional versatility of CREM is determined by its modular structure. Embo. J. 12: Foulkes NS, Sassone-Corsi P More is betters activators and repressors from the same gene. Cell 68: Foulkes NS et al Developmental switch of CREM function during spermatogenesis : from antagonist to transcriptional activator. Nature 355: Molina CA et al Inducibility and negative autoregulation of CREM: an alternative promoter directs the expression of ICER, and early response repressor. Cell 75: Hall JM et al The multifaced mechanism of estradiol and estrogen receptor signaling. J Biol Chem 276: Couse et al Estrogen receptor null mice : what have we learned andwhere will they lead us? Endocr Rev 20: Couse et al Tissue distribution and qualitative analysis of estrogen receptor-alpha (Eralfa) and estrogen receptor-beta (ERbeta) messenger ribonucleic acid in the wild-type and ERalfa-knockout mouse. Endocrinol 138: Abney To, The potential roles of estrogen in regulating Leydig cell development and function: a review. Steroids; 64: Hess Ra et al A role for estrogens in the male reproductive system. Nature 390: Yue et al In situ aromatization enhances breast tumor estradiol levels and cellular proliferation. Cancer Res 58 : Tekmal et al Overexpression of int-5/aromatase in mammary glands of transgenic mice results in the induction of hiperplasia and nuclear abnormalities. Cancer Res 56: Huseby RA Estrogen-induced Leydig cell tumor in the mouse model system for the study of carcinogenesis and hormone dependency. J Toxicol Environ Health 1: Bosland MC Hormonal factors in carcinogenesis of the prostate and testis in humans and in animal models. Prog Clin Biol Res 394: Kirma et al Aromatase overexpression leads to breast hyperplasia in females and gynecomastia and testicular cancer in males. Proc Am Assoc Cancer Res. 40: Pezzi et al Involvement of orphan nuclear receptors SF-1, LRH-1, DAX-1 and SHP in regulation of aromatase expression in Leydig cells, IV edition EMBO Worjshops on intracellular receptors Villefranche sur Mer (France). 36. Jo Y, Stocco Dm Regulation of steroidogenesis and steroidogenic acute regulatory protein in R2C cells by Dax-1 (Dosage-Sensitive Sex Reversal, Adrenal Hypoplasia Congenita, Critical Region On The X Chromosome, Gene-1). Endocrinology. 145(12): Adele Chimento Il Direttore del Dipartimento Farmaco-Biologico (Prof. Marcello Maggiolini)

6 PROGETTO DI RICERCA RUOLO DELL ESPRESSIONE DELL AROMATASI E DEGLI ESTROGENI NEL PROCESSO DI TUMOROGENESI TESTICOLARE PIANO DI SPESA Materiale di consumo Euro 3500 Partecipazione Congressi Euro 666,66 TOTALE Euro 4166,66 Adele Chimento