Approccio diagnostico alle sindromi talassemiche

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1 LE EMOGLOBINOPATIE DIAGNOSI CLINICA E DI LABORATORIO Approccio diagnostico alle sindromi talassemiche F. Manzato (Mantova) 1 The thalassemias constitute a heterogeneous group of naturally occurring, inherit mutations characterized by abnormal globin gene expression resulting in total absence or quantitative reduction of α- or β-globin chain synthesis in human erythroid cells. 2

2 β Talassemia major La β Talassemia major, detta anche morbo di Cooley, è definita come un disordine genetico della sintesi delle catene β- globiniche in cui la vita è resa possibile solo attraverso la regolare trasfusione di sangue β Talassemia intermedia La β Talassemia intermedia è definita come un quadro clinico ad ampio spettro di variabilità applicato a quei pazienti con fenotipo talassemico lieve-moderato, in grado di mantenere spontaneamente livelli di Hb uguali o superiori a 7 gr/dl, senza regolare fabbisogno trasfusionale, in assenza di fattori aggiuntivi decrementali 3 Età della diagnosi Età (anni) Talassemia major (%) Talassemia intermedia (%) < > Modell CB;

3 Approccio diagnostico alla talassemia major Clinico Arresto di crescita Pallore Anoressia Febbre ricorrente Epato-splenomegalia Laboratoristico Aspetto dello striscio periferico HbF elevata Dimostrazione dello stato di portatore nei genitori 5 Anemia di grado severo (6 9 gr/dl) Ipocromica Microcitica Reticolociti: normali, raramente aumentati Allo striscio periferico: Poichilociti Schistociti Leptociti Emazie a bersaglio Eritroblasti poli- ortocromatici 6

4 Frazioni emoglobiniche nella talassemia major HbA: assente (β 0 ) o poco rappresentata (β + ) HbF : > 50% HbA 2 : 3.0% ( ) Il dosaggio di HbA 2 non è di alcun valore diagnostico 7 Approccio diagnostico alla talassemia intermedia Clinico Pallore Ittero Splenomegalia Infezioni ricorrenti Alterazioni ossee Laboratoristico Anemia emolitica ipocromica, micronormocitica Eritroblastosi e reticolocitosi HbA 2 normale o aumentata Incremento variabile di HbF (5-99%) 8

5 Approccio diagnostico al portatore di β-talassemia Clinico Asintomatico Laboratoristico Esame emocromocitometrico RBC MCV MCH Reticolociti HPLC di Hb HbA 2 HbF N Esclusione di eventuali emoglobine anomale 9 Approccio diagnostico al portatore di β-talassemia GR microcitici ipocromici Target cells: presenza molto variabile e di poco valore diagnostico Punteggiature basofile: frequenti soprattutto negli alleli più severi 10

6 Parametri ematologici nel portatore β-talassemico in funzione dell età Età Hb MCV MCH HbA2 (anni) (g/dl) (fl) (pg) (%) ± ± ± ± ±1 61 ± ± ± ±1 62 ± ± ±0.6 Adulto M 13.3 ± ± ± ±0.5 Adulto F 11.8 ± ± ± ± Limiti di MCV e MCH nell identificare i portatori di β-talassemia Falsi positivi: - α talassemia - deficit di ferro Falsi negativi: - interazione α β talassemia - deficit di folato e B 12 - β talassemia silente 12

7 Formule basate sugli indici dei GR Mentzer Index : MCV / RBC (± 13) 13 J Clin Pathol 1994 these formulae are not applicable to children, pregnant women, or polycythaemic patients with iron deficiency and will only predict the correct diagnosis in 80%-90% of patients. 14

8 15 Am J Clin Pathol 2007 From the present study, we concluded that automated cell counter based parameters and formulas are technically good, rapid, cheaper, easily available, and reliable methods for BTT detection. 16

9 .they cannot be used neither as a screening tool for β-tt because they could result in a significant number of false negative results. Ntaios G. 17 Europen Journal of Haematology 2007 Results: Finally, none of these different formulations are superior to RBC value obtained from automated analyzers in adult cases with IDA and Β-TT. Conclusions: Total body iron status and hemoglobin A2 level should be obtained for accurate differential diagnosis of IDA and B-TT until more efficient tools develop. 18

10 European Journal of Haematology 2007.these indices cannot even be used as a screening tool for β-tt, as they could result in a significant number of false negative results. George Ntaios, Anastasia Chatzinikolaou 19 British Journal of Haematology 1998 Guideline THE LABORATORY DIAGNOSIS OF HAEMOGLOBINOPTHIES Investigation of microcytosis In the non-urgent investigation of microcytosis the various published formulae for discriminating between iron deficiency and thalassaemia trait can be used to indicate which diagnosis is more likely and which test should be carried out first. 20

11 HbA2 Hb minore senza una chiara funzione fisiologica Il gene δ (cromosoma 11) differisce da β per soli 31 nucleotidi 10 aminoacidi L espressione di δ e β è molto differente (2-3% contro 95%) Distribuzione pancellulare (a differenza di HbF) Le δ talassemie e le varianti δ descritte sono poche: Nessuna anomalia clinica o ematologia Nessun vantaggio contro la malaria HbA 2 non aumenta in sincronia con HbA A 32 settimane di gestazione HbA/HbA 2 = 100 A 45 settimane di gestazione HbA/HbA 2 = 75 A 6 mesi dalla nascita HbA/HbA 2 = Bassi livelli di HbA2 Disordini acquisiti Deficit di ferro ATMDS Anemia sideroblastica Leucemia mieloide acuta Leucemia granulocitica cronica giovanile Disordini genetici α talassemia δ talassemia (50% eterozigoti) δ+β talassemia δβ talassemia γδβ talassemia Hb Lepore HPFH Varianti δ 22

12 Elevati livelli di HbA2 Disordini acquisiti Ipertiroidismo Anemia megaloblastica Zidovulina Anemia diseritropoietica Malaria Disordini genetici β talassemia HbS- β talassemia Varianti β instabili Aumento isolato ereditario Sferocitosi. 23 Differenti Fenotipi della β Talassemia minor Con elevati livelli di HbA 2 Con normali livelli di HbA 2 HbF bassa o lievemente aumentata HbF insolitamente alta HbA 2 insolitamente alta Sintomatici β talassemia dominante β talassemia con ααα o αααα β talassemia con δ- talassemia β talassemia lieve β talassemia silente β talassemia con α- talassemia 24

13 Variabilità delle frazioni emoglobiniche dalla nascita all età adulta in condizioni fisiologiche e patologiche Normale HbA 2 % βthal HbA 2 % Normale HbF % βthal HbF % Nascita M M M M >2 ANNI Ivaldi G. Bioch Clin Normal HbA 2 β Thalassemia Type 2 Due to Compound Heterozygosity for β and δ Thalassemia β Thal. mutation δ Thal. mutation HbA 2 level ISV-II 745 C G δ +69 G A (cis) 2.97 ISV-II 745 C G δ +27 G T (cis?) 2.2 ISV-II 745 C G δ +27 G T (trans) 2.5 β 39 C T δ +27 G T (trans) 3.4 ISV-II 745 C G δ +27 G T (cis) 3.2 β 39 C T δ 059 A (cis) 3.5 ISV G A δ 059 A (cis) 3.2 ISV-16 T C δ +27 G T (trans)

14 Genotypes associated with borderline/normal HbA2 levels GENOTYPE MCV fl MCH pg HbA 2 α/β ratio β-101 (C T) 85.5 ± ± ± ± 0.4 β-92 (C T) 83.0 ± ± ± ± 0.8 β+33 (C G) 82.0 ± ± ± ± 0.6 Cap +1(A C) β IVS1-6 (T C) 71.0 ± ± ± ± 1.0 β IVS2-844 (T 96.0 ± ± ± ± 0.6 C) β (C G) 83.3 ± ± ± ± 0.4 ααα/αα 85.5 ± ± ± ± 0.4 δ + β thalassemia 67.6 ± ± ± ± 0.6 Galanello R. 27 Effetti della co-ereditarietà di diversi alleli α-talassemici in soggetti portatori di β-talassemia MCV, fl HbA, % HbA 2, % 50 1 α/αα αα ND /αα α/ α /αα αα/αα α/αα αα ND /αα α/ α /αα (R. Galanello, 2002) 28

15 Elevati livelli di HbF Disordini acquisiti Espansione eritropoietica trapianto di midollo emolisi acuta gravidanza Associata con tumori ematopoietici leucemia juvenile cronica mielogena anemia di Fanconi sindromi preleucemiche Farmacologica Disordini genetici β 0 talassemia GγAγ (δβ) 0 talassemia Gγ (Aγδβ) 0 talassemia HPFH 29 Condizioni genetiche con aumento di HbF nell adulto Delezione HPFH δβ talassemia GγAγ (δβ) 0 HPFH GγAγ (δβ) 0 thal Gγ (Aγδβ) 0 thal Legate al cluster β Non-Delezione Non Legate al cluster β 30

16 GγAγ (δβ) 0 HPFH Eterozigote: HbA 2 : N HbF: 15 30% pancellulare Indici eritrocitari:n o Omozigote: Hb: g/dl HbF: 100% MCV: MCH: Doppia eterozigosi con β talassemia: Clinicamente silente HbF: 60-75% MCV: MCH: 31 GγAγ (δβ) 0 e Gγ (Aγδβ) 0 talassemia Eterozigote: HbA 2 : N HbF: 5 15% eteroc. MCV: MCH: Omozigote: Hb: g/dl HbF: 100% MCV: MCH: Doppia eterozigosi con β talassemia: Clinica variabile: da lieve a grave talassemia intermedia 32

17 Heterozygous β-thalassemia: Phenotipe Modification Phenotype Normal RBC indices Normal HbA 2 level Genotype α and β thalassemia interaction Co-inheritance of δ and β thalassemia Some mild β thalassemia mutations γδβ thalassemia Iron deficiency Normal RBC indices and HbA 2 level Silent β thalassemia mutations (Silent) α globin gene triplication α, β and δ thalassemia mutations Severe heterozygous β thalassemia Co-inheritance of heterozygous β thalassemia and triplicated α-globin gene Hyper unstable hemoglobin Cao A. 33 Hemoglobin and HbA 2 in non-β and β thalassemia trait with iron deficiency β-thal trait non β Galanello et al.,

18 Relazione tra mutazione del gene α e sintesi delle catene α Le mutazioni del cluster dei geni α globinici possono inattivare uno dei 2 geni (-α, α Τ α, αα Τ ) o risultare nella delezione di entrambi (--). Se la mutazione riguarda un singolo gene, la sintesi delle catene α dipende : mutazione con (-α) o senza (α Τ α, αα Τ ) delezione perdita dell espressione del gene parziale o completa locus interessato α1 (αα Τ ) o α2 (α Τ α) compensazione da parte del gene rimanente (es:-α 3.7,-α 4.2 ) 35 Tipo di α-tal Genotipo Ematologia α + -talassemia -α/αα Assenti o MCV e MCH Omozigote α + Eterozigote α 0 Malattia da HbH -α/-α --/αα --/-α --/αα* HbBart s (γ 4 ) nel neonato (1-2%) Hb, MCV e MCH, HbA 2 e HbF N, HbH occasionale, HbBart s nel neonato (3-10%) Anemia microcitica ipocromica moderatamente grave; HbH 2-25%.HbBart s nel neonato (25%) Idrope fetale --/-- HbBart s >80%. Incompatibile con la vita 36

19 α-talassemia con HbBart 37 α-talassemia con HbH 38

20 Laboratory Hematology MCH and α globin gene 32 MCH (pg) pg αα/αα α/αα ατα/αα α/ α /αα ατα/ α ατα/ατα α/ ατα/ (Wilkie AOM; 1991) 40

21 Management and Genetic Counseling of People with α-thalassemia Trait Patients with MCH 26 pg but with a normal level of HbA2 (<3.5%) and a normal iron status, almost always have α-thalassemia trait....the partners of such individuals should be screened and if they too have α-thalassemia trait, with a MCH of 26 pg or less, the couple should be offered counseling and genotype analysis Higgs DR et al Flow chart for β-thalassemia carrier screening MCV fl MCH pg Hb pattern > 78 > 27 A+A2<3% < 78 < 27 A+F 0.1-7% +A2>3.5% Normal β-thal Characterisation of undefined mutations by DGGE and direct sequencing Screening for common mutations by DNA analysis 42

22 Flow chart for β-thalassemia carrier screening MCV fl MCH pg Hb pattern < 78 < 27 A+A2<3.5% A+F 2-16% + A2 <3% Iron deficiency ZnPP and/or iron studies Globin chain syntesis or α-globin gene analysis HbF quantit., HbF distribution, α/ β ratio, DNA analysis α-thal δ and β gene analysis δβ-thal HPFH δ+β-thal Normal HbA2 β-thal γδβ-thal 43 Resistenze osmotiche e HbA ROE HBA2 44

23 Il problema degli indici eritrocitari e di HbA2 borderline 125 casi HbA % 37 (30%) βtal lieve 16 δ + βtal 2 ααα Nessuna anomalia dei geni δ, β,α. Galanello R A. Giambona et al. haematologica casi HbA % 94 (23%) 55 (MCV<80) 39 (MCV 80) 30 β tal 11 δ+β tal 10 α tal 3 Hb varianti 1 ααα 14 ααα 14 β tal 6 non definito β SNP 3 Hb varianti 2 - α Nessuna anomalia dei geni δ, β,α. 46

24 A. Giambona et al. haematologica borderline HbA2 levels are not a rare event in a population with a high prevalence of β-thalassemia carriers, with the most severe genotypes associated with microcytosis. These data support the necessity to investigate these cases at a molecular level, particularly if the partner is a carrier of β- thalassemia. 47