Le mutazioni 3. By NA. Lezione 12

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1 Le mutazioni 3 Lezione 12

2 MEMENTO La cosidetta patologia molecolare ha come fine quello di spiegare se e come un particolare allele sia collegabile ad un fenotipo clinico, quindi ci si domanda: la mutazione che effetto ha sulla quantita', qualita', funzione del prodotto? cosi' si tenta di spiegare perche' sia o meno patogenetica ormai vi saranno chiare le difficolta' che si incontrano e la portata della sfida per comprendere il funzionamento del genoma umano: le malattie genetiche sono il risultato di un complesso network di interazioni, ma costituiscono il fulcro per lo studio delle funzioni.

3 Quando si trova una mutazione Mutazione mai descritta in letteratura, ma che potrebbe essere patogenetica (il meccanismo di azione del prodotto e noto): e presente in altri soggetti sani della famiglia? Mutazione mai descritta in letteratura, con effetto ignoto sulla funzionalita : e presente in soggetti sani della famiglia? Mutazione mai descritta in letteratura, ma il cui effetto si ritiene innocuo sulla funzionalita : e presente in soggetti sani della famiglia? Mutazione descritta in letteratura, il cui effetto e accertato essere innocuo sulla funzionalita (come?)

4 esempio mutazione conservativa patologica: Distrofia dei cingoli LGMD2 gene Calpaina3: la mutazione e' in terza base e la nuova tripletta e' sinonima codifica sempre per una glicina, ma origina un sito di splicing criptico che puo' portare alla perdita di parte dell'esone 16 con conseguente frameshift

5 esempio mutazione potenzialmente patologica in un introne sito preesistente puo' divenire un sito di splicing si origina un nuovo esone con conseguenze non prevedibili in quanto legate alle sequenze contenute nel nuovo esone : frameshift, stop, alterazione della conformazione o creazione di un nuovo prodotto funzionante.

6 La perdita di funzione: non solo missenso/non senso. PAX3 sindrome di Waardenburg Le mutazioni riportate in alto distruggono la struttura della proteina e sono abbastanza distribuite, mentre le missenso sono concentrate in due regioni, il risultato e' lo stesso e conferma che la perdita di funzione e' alla base della malattia

7 Chan ge Exam ple Tabella riassuntiva di mutazioni che provocano perdita di funzione Delete: (i) the entire g en e Most -thalassemia m utations (ii) part o f the g ene 60% of Duchenne m uscular d ystrophy Insert a sequence i nto the gen e Insertion of LINE-1 repetitive sequen ce (see into F8C gene in hem ophili a A Disrupt th e gene st r ucture : (i) by a translocatio n X-autosom e translocations in women wi th Duchenne m uscul ar d ystrophy (ii) by an inversion Inversion in F8C gene Prevent the prom oter working: (i) by m utation -Globin -29A G mutation (ii) by m ethylation Fragile-X full m utation ( FM R1 ) Destabilize the mrna : (i) by a polyadenylation site m utation -globin AATAAA AATAGA m utation (ii) by nonsense-m ediated RNA decay Fibrillin mutations ( FBN1 ) Prevent correct splicing: (i) by inactivating donor s plice si te PAX G T m utation (ii) by i nactivating acceptor sp lice site PAX A G m utation (iii) by activating a cryptic splice site -Globin intron 1-110G A m utation Introduce a fram eshift in trans lation PAX insG m utation Convert a codon into a s top codo n PAX3 Q254X m utation Replace an essential aminoacid PAX3 R271C m utation Prevent post-trans criptional processing Cleavage-resistant collagen N-terminal propeptide in Ehlers Danlos VII syndrom e Prevent correct cel l ular localization of pr oduct F508del m utation i n cystic f ibrosis

8 Tabella conclusiva ma non esaustiva

9 esempio mutazione missenso:acondroplasia 2 mutazioni patogenetiche che vengono ritrovate (una sola!) nel 99% degli affetti. Entrambe sono a carico del codone 380 al nucleotide 1138 e provocano, a causa della sostituzione della prima base della tripletta, la sostituzione di una glicina con una arginina nel dominio transmembrana G380R. 2 G>A 2 G>C Nel 98% e una transizione nell 1% e una trasversione

10 Il collagene α2 α1 α1 N-term Dominio a tripla elica C-term Esistono tipi diversi di collagene nei vari tessuti. Essi si differenziano per lunghezza, sequenza dei diversi domini, per composizione e dimensione dei peptidi C e N terminali e per proprieta fisiche. (vedi tabella nel libro) Il collagene di Tipo I e piu abbondante in pelle, tendini, ossa e arterie. Questi sono anche i tessuti maggiormente interessati dalla OI 10

11 M I TRAMITE SCREENING DI LIBRARY GENOMICHE E STATO POSSIBILE ISOLARE DIVERSI GENI PER IL COLLAGENE. M I tipi di collagene ESISTONO DIVERSE CLASSI DI COLLAGENE: COLLAGENI FIBRILLARI(DI TIPO I II III V E XI) COLLAGENI NON FIBRILLARI(i domini a tripla elica sono interrotti da domini non a tripla elica) COLLAGENI A CATENA BREVE (TIPO VII) OGNI CATENA DEL COLLAGENE E CODIFICATA DA UN GENE DISTINTO. QUESTI GENI PRESENTANO OMOLOGIA DI SEQUENZA ELEVATA. I GENI PER IL COLLAGENE FANNO PARTE DI UNA FAMIGLIA GENICA (insieme di geni con un elevato grado di omologia di sequenza e codificanti per prodotti con funzione simile o correlata. Possono contenere elemeni non funzionanti detti PSEUDOGENI) 11

12 Perche la patologia dominante E POSSIBILE RICONOSCERE MUTAZIONI PIU FREQUENTI PER CIASCUN TIPI DIVERSO DI OI MUTAZIONE IN UN ALLELE DEL GENE PER LA CATENA α1 α1 Nonostante un solo allele del gene COL1A1 e mutato ben il 75% delle triple eliche sono anomale. α2 α1 DEGRADATE La mutazione riguarda il 50% del prodotto genico, ma influenza il 75% della proteina..l EFFETTO E DOMINANTE anche in caso di eterozigosi 12

13 Relazione genotipo-fenotipo M GRAZIE A TALI STUDI MOLECOLARI E BIOCHIMICI E STATO POSSIBILE IDENTIFICARE MUTAZIONI NEI DIVERSI GENI DEL COLLAGENE CAUSA DELLE DIVERSE FORME DI OI Mutazioni di grosse dimensioni(delezioni o inserzioni multiesoniche) sono rare perche compromettono la stabilita di gran parte delle molecole di collagene. Questo tipo di mutazioni si riscontra spesso in casi di OI di tipo II nelle forme letali in fase perinatale. M Piu frequenti sono le mutazioni puntiformi. Queste sono anche piu difficili da trovare viste le dimensioni della molecola del collagene. nei geni COL1A1 e COL1A2 sono state trovate numerose mutazioni che causano una sostituzione di una glicina con un altro amminoacido. A seconda del sito di sostituzione si manifestano diversi fenotipi OI. Questi ultimi sono piu gravi quando la sostituzione si verifica piu vicino all estremita carbossi terminale. 13

14 M M Relazione genotipo-fenotipo Tutte le sostituzioni Gly-Asp sono risultate letali. Mutazioni in siti di splicing possono provocare delezioni di esoni o splicing anomali con conseguente sintesi di molecole anomale di collagene. MLe mutazioni nel COL1A1 sono generalmente associate a fenotipi piu gravi rispetto a quelle che colpiscono il gene COL1A2 e i fenotipi piu gravi nel caso di mutazioni vicine all estremita 3 della tripla elica. L APPROCCIO DI STUDI O DELL OI E STATO QUELLO DELLA GENETICA DIRETTA IN CUI SI PARTE DA UN PRODOTTO PROTEICO PER ARRIVARE AL GENE E ALLO STUDIO DELLE MUTAZIONI AD ESSO ASSOCIATO M IN OGNI CASO IL PRIMO PASSO PER LO STUDIO DI QUALSIASI PATOLOGIA E L ANALISI DEL FENOTIPO! 14

15 Relazione genotipo-fenotipo riepilogo TIPO I: e causato da mutazioni nel COL1A 1, in generale si tratta di mutazioni non senso (sostituzione di un codone di senso con un codone di stop) o mutazioni di splicing. Queste provocano una riduzione nella sintesi del collagene, ma le molecole che vengono sintetizzate hanno una struttura normale. TIPO II:e causato o da mutazioni multiesoniche(nei casi di forme letali) o da mutazioni missenso sostituzione di un codone per un AA con uno per un AA diverso) che non comportano mancata produzione della proteina, ma produzione di catene α1 (I)anomale. queste aggregandosi con catene normali portano alla formazione di triple eliche anomale causando il fenomeno dell effetto dominante negativo. TIPO III: e una forma geneticamente eterogenea, si riscontrano mutazioni in geni diversi. A volte sono presenti anche piu mutazioni in geni diversi contemporaneamente. E l unica forma per la quale e stata dimostrata anche trasmissione ditipo autosomico recessiva, frequente solo in alcune popolazioni come quella sud africana dove, pero di riconosce un EFFETTO DEL FONDATORE(prevalenza di un allele nella popolazione dovuta alla sua presenza in uno dei membri originari della popolazione stessa ed alla tendenza dei membri della popolazione ad accoppiarsi tra loro). In questo caso sono piu frequenti soggetti omozigoti per mutazioni in geni COL1A1 e COL1A2. TIPO IV: pur essendo generalmente lieve, puo presentare variazioni notevoli anche nella stessa famiglia(non e noto il perche di questa variabilita ). Si trovano frequentemente mutazioni puntiformi nei geni COL1A1 o COL1A2. 15

16 L M COL5A1 o COL5A2 Sindrome di Ehlers-Danlos Iperplasticita della cute. Esistono diversi tipi Vengono ereditati con modalita diverse. Tipo I : piu grave tipo II: piu lieve DOMINANTI L Ipersensibilita delle articolazioni M Sono dovuti a mutazioni in locus diversi interessano principalmente cute e articolazioni. sono state trovate mutazioni nel collagene di tipo V (mutazioni in COL5A1 o COL5A2 ). TIPO IV vascolare : pelle traslucida con vene chiaramente visibili e facilmente escoriabile. Minima ipersensibilita delle articolazioni. Gravi rischi di rottura di arterie, del colon e utero. Attesa di vita non superiore ai 50 anni. E causata da mutazioni nel gene COL3A1 che codifica per le catene di tipo III (mancata produzione del collagene di tipo III) di cui sono particolarmente ricche le pareti arteriose, dell intestino e utero. 16

17 L Iperplasticita della cute. TIPO VI:cute soffice e iperelasticita, fragilita oculare (distacco della retina). mutazioni nel gene per la lisil idrossilasi traduzionali del collagene. Sindrome di Ehlers-Danlos RECESSIVE L Ipersensibilita delle articolazioni ipersensibilita delle articolazioni e Autosomica recessiva, causata da responsabile delle modifiche post TIPO VII: dislocazione congenita delle anche e altre articolazioni ed estrema ipersensibilita articolare. Autosomica recessiva causata da mutazioni nel gene per la Procollagene peptidasi responsabile del processamento extracellulare del collagene TIPO IX: RECESSIVA X-LINKED cute lassa, diverticoli e rottura della vescica e deformita scheletriche. Colpisce gravemente i soggetti di sesso maschile. E causata da un difetto del metabolismo del rame. ( L attivita della lisil idrossilasi e coadiuvata dal rame) 17

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