Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR)

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1 È basata sulle interazioni tra la componente magnetica di una radiazione elettromagnetica, dell ordine delle radiofrequenze, con i nuclei delle molecole poste in un forte campo magnetico.

2 Permette di ottenere informazioni relative a: intorno del nucleo atomico (natura del gruppo funzionale) connettività tra gli atomi distanze tra gli atomi dinamica molecolare Principali applicazioni: determinazione strutturale dei composti organici (in fase gassosa, liquida, solida) studio della dinamica dei sistemi molecolari all'equilibrio diagnostica medica 2

3 Proprietà di spin dei nuclei atomici Caratteristiche nucleari: M = massa (protoni + neutroni) Z = numero atomico (protoni) I = numero quantico di spin (0, /2,, 3/2, 2.) Le particelle nucleari, protoni e neutroni, (come gli elettroni), sono dotate di spin. I nuclei che possiedono un numero dispari di protoni e un numero dispari di neutroni possiedono un momento angolare intrinseco p, o spin, che classicamente può essere associato alla rotazione del nucleo attorno a se stesso. P 3

4 Proprietà di spin dei nuclei atomici Il momento angolare p è quantizzato attraverso il numero quantico di spin nucleare I. Può avere valore intero o semintero (0, ½,, 3/2, 2.) a seconda dell isotopo ed è legato al numero di protoni e di neutroni che costituiscono il nucleo. Numero di protoni pari e numero di neutroni pari danno uno spin nucleare complessivo nullo ( I = 0 ) Alcuni nuclei con SPIN Nucleo Protoni non appaiati Z Neutroni non appaiati M (protoni + neutroni) Spin totale I H dispari 0 dispari /2 2 H dispari pari 3 P dispari 0 dispari /2 23 Na dispari 2 dispari 3/2 4 N dispari pari 3 C 0 pari dispari /2 9 F dispari 0 dispari /2 4

5 Analisi dei Medicinali I G. Poce Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Stati di spin nucleare Un nucleo con spin nucleare ( H, 3 C, 5 N, 9 F, 3 P, I = ½) è una carica che ruota sul proprio asse e per questo genera campi magnetici di debole intensità, comportandosi come un piccolo magnete. In assenza di perturbazioni esterne questi magneti si orientano in maniera casuale. 5

6 Stati di spin nucleare In presenza di un campo magnetico esterno (B 0 ) gli spin nucleari si allineano secondo due possibili orientazioni (stati di spin): parallela ed antiparallela. I=/2 B 0 /2 ħ z =/2 ħ mi =, 2 2 z = -/2 ħ Queste due orientazioni hanno diversa energia: orientazione parallela (α, I = +½) minore energia; orientazione antiparallela (β, I = -½) maggiore energia. In generale: un nucleo con spin nucleare (I 0), immerso in un campo magnetico esterno omogeneo, potrà assumere un numero di orientazioni (stati di spin) pari a 2I +. 6

7 Stati di spin nucleare La rotazione del nucleo produce un momento magnetico µ associato al momento angolare p tramite una costante di proporzionalità, γ (rapporto giromagnetico), che è caratteristica di ciascun nucleo: µ = γ p 7

8 energia Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Stati di spin nucleare I=/2, m I =/2, -/2 m I =-/2, B 0 In assenza di campo magnetico m I =/2, In presenza di campo magnetico La differenza di energia tra i due livelli energetici: h= costante di Plank ΔE = (hγ/2π) B 0 ΔE è proporzionale al campo magnetico

9 Stati di spin nucleare Una transizione dallo stato ad energia inferiore a quello ad energia superiore può essere promossa applicando una radiazione avente una frequenza esattamente uguale a quella richiesta per un dato campo magnetico applicato. Il valore di radiofrequenza è correlato con il campo magnetico secondo l equazione: = B 0 /2 Tale frequenza (frequenza di Larmor) dipende dal nucleo (attraverso il rapporto giromagnetico ) e dall intensità del campo magnetico applicato. 9

10 Risonanza Il protone possiede due livelli energetici (2I+=2). Si può fornire energia sottoforma di radiofrequenza (ν ) per promuovere la transizione tra questi 2 livelli energetici in un campo magnetico stazionario B 0 secondo l equazione: = B 0 /2 Fornendo al protone una frequenza di 00MHz in un campo magnetico B 0 di 2.35 tesla (T) esso risuona l energia viene assorbita dal protone che passa ad uno stato energetico superiore E m I = -/2, E E m I =/2, E 0 B 0 0

11 Risonanza Il protone possiede due livelli energetici (2I+=2). Si può fornire energia sottoforma di radiofrequenza (ν ) per promuovere la transizione tra questi 2 livelli energetici in un campo magnetico stazionario B 0 secondo l equazione: = B 0 /2 Fornendo al protone una frequenza di 00MHz in un campo magnetico B 0 di 2.35 tesla (T) esso risuona l energia viene assorbita dal protone che passa ad uno stato energetico superiore E m I = -/2, E E m I =/2, E 0 B 0

12 Cosa succede dopo che il sistema è stato irradiato? z x y 2

13 Cosa succede dopo che il sistema è stato irradiato? z Gli spin nucleari tornano alla situazione di equilibrio, attraverso una serie di processi noti come fenomeni di rilassamento, che permettono alla magnetizzazione totale di allinearsi al campo magnetico. Per effetto del rilassamento la componente della magnetizzazione nel piano xy si riduce sino ad annullarsi, e di conseguenza si riduce anche la corrente elettrica oscillante rivelata dalla bobina posta nell asse y. Questo è il segnale NMR. x y FID: Free Induction Decay Decadimento (decay) all equilibrio, libero (free) dall influenza del campo a rf ed indotto (induced) nella bobina 3

14 intensità intensità Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Il segnale che rappresenta il decadimento dell induzione magnetica in funzione del tempo può essere convertito, applicando la trasformata di Fourier, in un segnale in funzione della frequenza. f(ω(= f(t)e iωω dt Trasformata di Fourier (FT) tempo frequenza 4

15 In un campione reale i nuclei di un dato isotopo non risuonano alla stessa frequenza, in quanto il campo magnetico che effettivamente viene sentito dal nucleo dipende dalla distribuzione elettronica attorno al nucleo, la quale a sua volta dipende dal contesto molecolare in cui è inserito il nucleo. Per fare entrare contemporaneamente in risonanza tutti i nuclei protonici si inviano contemporaneamente tutte le frequenze entro l intervallo in cui risuonano i nuclei protonici. Questo viene fatto inviando una radiazione monocromatica ν 0 per un tempo molto breve (dell ordine dei µs): un breve pulso di durata t P converte la radiazione monocromatica in una banda di frequenze aventi tutte la stessa intensità entro un intervallo di +/- /4t P Hz. t p 4t P /t p 0 5

16 FT tempo frequenza FT tempo frequenza FT tempo frequenza 6

17 Campione Inserimento nel Magnete 7

18 Campione B 0 z x z x Magnetizzazione Inserimento nel Magnete y y 8

19 Campione Inserimento nel Magnete B 0 z x y Impulso rf a 90 x z y x y Magnetizzazione Perturbazione: irraggiamento 9

20 Campione Inserimento nel Magnete B 0 z x Magnetizzazione Risposta Perturbazione: irradiamento y Rivelazione 20

21 Campione Inserimento nel Magnete Magnetizzazione Perturbazione: irradiament Risposta Rivelazione Raccolta Dati 2

22 intensità Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Campione Inserimento nel Magnete Magnetizzazione Perturbazione: irradiament Risposta Rivelazione FT Raccolta Dati Trasformata di Fourier frequenza Spettro NMR 22

23 Strumentazione Strumenti di a generazione - spettrometri a onda continua I primi spettrometri, costruiti a partire dal 953, utilizzavano magneti permanenti o elettromagneti con campi da.4,.87, 2.2 o 2.35 tesla. Questo tipo di strumento utilizza elettromagneti che arrivano a intensità massime di circa 2.35 T bassa intensità di campo bassa intensità di segnale In genere si mantiene costante il campo magnetico applicato B 0 e si fa variare nel tempo la frequenza della radiofrequenza applicata 23

24 Strumentazione Strumenti di 2 a generazione - spettrometri a impulsi o a Trasformata di Fourier Questo tipo di strumento utilizza crio-magneti (superconduttori che possono essere magnetizzati a bassissime temperature). Questi consentono di raggiungere intensità di campo magnetico molto elevate. Strumenti a.7 T (500 MHz per H) sono comuni, si arriva oltre i 8.8 T per H (800 MHz 24

25 Strumentazione In questi strumenti si invia un impulso di radiofrequenza nel range di frequenze di risonanza del nucleo in studio, perpendicolarmente al campo magnetico applicato B 0. Questo impulso induce la transizione di tutti i nuclei interessati dallo stato di spin α allo stato β. 25

26 Strumentazione: Spettrometri a Trasformata di Fourier I nuclei che sono passati nello stato di spin a più alta energia ritornano allo stato fondamentale riemettendo una radiazione nel campo delle radiofrequenze. Viene emessa una serie di radiofrequenze, una per ogni differente nucleo presente che nel loro insieme costituisce il FID (free induction decay - segnale di decadimento a induzione libera), un insieme di frequenze modulate nel dominio del tempo. Un ricevitore di radiofrequenze registra e amplifica il FID (intensità vs tempo) Il FID viene elaborato mediante trasformata di Fourier per ottenere lo spettro (intensità vs frequenza) 26

27 Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Strumentazione: Spettrometri a Trasformata di Fourier Ogni sequenza di acquisizione base consiste di una serie regolare di operazioni: ) impulso di radiofrequenza, 2) da un breve tempo morto (non si acquisisce segnale) 3) tempo di acquisizione sufficientemente lungo 4) eventuale intervallo intersequenza. 27

28 Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Strumentazione: Spettrometri a Trasformata di Fourier Le sequenze di acquisizione possono essere ripetute in successione una serie molto lunga di volte e i FID ottenuti possono essere sommati. I segnali risuonano sempre alla stessa frequenza mentre il rumore di fondo risuona a frequenze casuali sommando i FID si incrementa molto di più il segnale rispetto al rumore di fondo notevole miglioramento del rapporto segnale / rumore, con notevole incremento della sensibilità. 28

29 Strumentazione: Spettrometri a Trasformata di Fourier Vantaggi dell FT-NMR Campi magnetici applicati stabili e molto intensi aumento dell intensità del segnale di risonanza possibilità di effettuare spettri di NMR su quantità più esigue di campione maggiore risoluzione dei segnali Possibilità di acquisire in tempi molto brevi un FID Possibilità di sommare più FID dello stesso campione in modo da migliorare il rapporto segnale / rumore Con modeste differenze strumentali si possono acquisire con la stessa strumentazione spettri di più nuclei ( H, 3 C, 9 F, 3 P ) 29

30 Liq N 2 Liq He Magnete 30

31 3

32 Probe Probe Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Spire del Magnete Bobine di shimming 32

33 Magnete Bobine di shimming Probe Probe Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Sorgente RF 33

34 Magnete Bobine di shimming Probe Probe Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Amplificatore Timer Sorgente RF 34

35 Magnete Bobine di shimming Probe Probe Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) z z x 90 x y y Amplificatore Timer Sorgente RF 35

36 Magnete Bobine di shimming Probe Probe Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) z z x 90 x y y Amplificatore Ricevitore Timer Sorgente RF 36

37 Magnete Bobine di shimming Probe Probe Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Sottrae la frequenza proveniente dal probe dalla frequenza operativa Amplificatore Ricevitore Detector Timer Sorgente RF 37

38 Magnete Bobine di shimming Probe Probe Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Trasforma il segnale da analogico (elettrico) in digitale (cioè in numeri che possano poi essere analizzati dal computer) Convertitore AD Amplificatore Ricevitore Detector Timer Sorgente RF 38

39 Magnete Bobine di shimming Probe Probe Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) FT Computer Convertitore AD Amplificatore Ricevitore Detector Timer Sorgente RF 39

40 Magnete Bobine di shimming Probe Probe Per aumentare la sensibilità intrinsecamente bassa della spettroscopia NMR si registra lo stesso spettro per un numero anche molto elevato di volte Computer Convertitore AD Amplificatore Ricevitore Detector Timer Sorgente RF 40

41 Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Preparazione del campione Tubi I tubi sono in quarzo, sono lunghi da 7 a 22 cm e per l uso più comune sono larghi 5 mm. Per nuclei meno sensibili ( 7 O) si utilizzano tubi larghi 0 mm. Gli spinner servono a tenere il tubo contenente il campione all interno del probe dello spettrometro e a permettergli di ruotare velocemente e senza vibrazioni. 4

42 Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Preparazione del campione Solventi Si utilizzano solventi deuterati (D 2 O, CDCl 3, CH 3 OD, (CD 3 ) 2 CO, (CD 3 ) 2 SO, C 6 D 6, CD 3 CN ) con percentuali di D > % Non danno segnali nel campo delle frequenze osservate ( H, 3 C, 5 N, 9 F.) Il segnale del D può essere utilizzato come riferimento per compensare elettronicamente (circuito di LOCK) lo spostamento degli altri segnali dovuti alle oscillazioni di intensità del campo magnetico B 0 42

43 Clean clear solution Suspension or opaque solution Precipitate Concentration gradient Two phases Not enough solvent GOOD! B a d S a m p l e s! 43

44 H-NMR: Lo spettro Gli assorbimenti NMR sono in genere in forma di picchi stretti I valori di assorbimento NMR sono relativi alla posizione di un composto di riferimento, il tetrametilsilano (TMS) cui si assegna il valore 0 I segnali sono riportati con valori crescenti di chemical shift da destra a sinistra La maggior parte dei protoni assorbe da 0 a 0 ppm 44

45 H-NMR: Lo spettro In uno spettro di NMR-protonico guardiamo: Il numero di segnali ci dice quanti tipi di H equivalenti ci sono nella molecola La posizione dei segnali ci dà informazioni sul tipo di H presenti (aromatici, alchilici, vinilici, alcolici, ammidici ) Intensità dei segnali ci dice quanti H dello stesso tipo ci sono Molteplicità del segnale ci da informazioni sul numero di H vicini a quello considerato 45

46 H-NMR: Numero di segnali Il numero di segnali è uguale al numero di differenti tipi di H presenti nel composto H con un diverso intorno chimico (non equivalenti) danno differenti segnali H equivalenti danno lo stesso segnale 46

47 H-NMR: Numero di segnali Per determinare gli H equivalenti in alcheni e cicloalcani conviene esplicitare tutti gli H Possiamo dire che due H sono equivalenti solo se sono entrambi cis (o trans) rispetto allo stesso gruppo 47

48 H-NMR: Numero di segnali 48

49 H-NMR: Intensità dei segnali L area sottesa a ciascuno dei picchi che compongono uno spettro NMR viene definita come intensità del segnale e viene rappresentata con una curva a gradino detta integrale. Nella spettroscopia H le aree associate ai vari picchi sono direttamente proporzionali al numero dei protoni che danno origine al segnale stesso. 49

50 H-NMR: Intensità dei segnali Si misura l area del segnale e si calcola il numero di H che lo hanno dato 2 casi Si conosce la formula bruta della sostanza in esame Si somma il valore dell altezza di tutti gli integrali e si divide per il numero totale di H presenti nella molecola. Si calcola l altezza di integrale corrispondente ad un H. Si divide poi l altezza di ciascun integrale per il valore precedentemente calcolato e si ottiene il numero di Non si conosce la formula bruta della sostanza in esame Si divide il valore dell altezza di ciascun integrale per il valore di altezza corrispondente all integrale meno alto. Se si hanno numeri frazionari si moltiplicano tutti i valori per un numero intero tale da ottenere numeri interi più piccoli possibile. Bisogna tenere presente che se la molecola è simmetrica si può osservare un numero di H inferiore a quello realmente presente si conosce solo il rapporto tra gli H che hanno dato i vari segnali 50

51 H-NMR: Intensità dei segnali C H 3 NO ,5=6,5 6,5/3=0,5 H=0,5 2H 2H 2H 2H 2H 3H 5

52 52 2H 3H 3H Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) H-NMR: Intensità dei segnali Valore di integrale più piccolo = 5.00 divido tutti i valori di integrale per 5 a 5.00/5 = b 7.5/5 =.5 c 7.49/5 =.5 Moltiplico tutto per 2 per arrivare ai più piccoli valori interi

53 H-NMR: Intensità dei segnali Valore di integrale più piccolo =.50 divido tutti i valori di integrale per.5 a.50/.5 = b.5/.5 = c 2.26/.5 =.5 Moltiplico tutto per 2 per arrivare ai più piccoli valori interi a 2H b 2H c 3H Osservati in totale 7 H La formula bruta è C 6 H 4 O 53

54 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali 54

55 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali In prossimità del nucleo, il campo magnetico generato dalla circolazione degli elettroni fa diminuire l intensità del campo magnetico che effettivamente agisce sul nucleo. In virtù della presenza degli elettroni i nuclei sono magneticamente schermati, ciò vuol dire che risentono di un campo effettivo che è minore rispetto al campo magnetico applicato. I differenti nuclei di H in una stessa molecola avranno differenti schermature e quindi differenti frequenze di risonanza 55

56 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali Gli elettroni sono particelle cariche e, come tali, quando vengono immersi nel campo magnetico B o, si muovono e generano un piccolo campo magnetico indotto βi opposto a quello molto più forte applicato. Questo campo magnetico indotto scherma il nucleo dalla piena forza del campo applicato. Il campo magnetico sentito dal nucleo è quindi B = B o β i. 56

57 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali Gli elettroni sono particelle cariche e, come tali, quando vengono immersi nel campo magnetico B o, si muovono e generano un piccolo campo magnetico indotto βi opposto a quello molto più forte applicato. Questo campo magnetico indotto scherma il nucleo dalla piena forza del campo applicato. Il campo magnetico sentito dal nucleo è quindi B = B o β i. 57

58 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali Per l atomo di idrogeno, che possiede un elettrone ed una distribuzione di carica simmetrica (sferica), lo schermo è principalmente dato da quello che, viene definito termine di schermo diamagnetico, che viene calcolato, facendo riferimento al moto di un elettrone su un orbita circolare. In pratica, questo effetto diamagnetico fa sì che il campo magnetico esterno sul nucleo venga schermato dalla carica elettronica. 58

59 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali Questo non è valido se prendo in considerazioni protoni all interno di una molecola. Viene meno l assunto iniziale della distribuzione di carica sferica e simmetrica. Gli elettroni negli orbitali p non hanno simmetria sferica. Essi daranno luogo a campi magnetici più intensi (relativamente al nucleo interessato) originando uno spostamento a frequenze maggiori (ex low field shift). Questo "deshielding" viene detto paramagnetic shift. 59

60 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali Per l atomo di idrogeno: SCHERMO (Shielding) equivale al campo magnetico che si oppone e quindi significa: maggiore densità elettronica intorno al nucleo minore frequenza precessionale (il nucleo risente di un B eff minore) valori più bassi di chemical shift (ppm) =low-freq shift (ex upfield shift) DESCHERMO (Deshielding) vuol quindi significare: minore densità elettronica al nucleo (minore schermo dovuto ad es. alla vicinanza di gruppi elettron-attrattori) maggiore frequenza precessionale (il nucleo risente di un B eff maggiore) valori più alti di chemical shift (ppm)=hi-freq shift (ex downfield shift) 60

61 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali Gli elettroni di legame, in particolare, possono trovarsi più vicini o più lontani dall atomo in esame (ad es. H) a seconda dell elettronegatività dell altro atomo legato. 6

62 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali La differenza nella posizione di assorbimento di un particolare protone rispetto alla posizione di assorbimento di un protone di riferimento viene detto spostamento chimico (chemical shift) Il composto di riferimento più utilizzato è il tetrametilsilano (TMS) CH 3 H 3 C Si CH 3 Vantaggi: CH Chimicamente inerte 3 Simmetrico E volatile e può essere allontanato dal campione per recuperare quest ultimo Solubile nella maggior parte dei solventi organici I 2 H del TMS producono un solo picco e sono i più schermati tra i protoni organici. 62

63 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali In un insieme di nuclei quelli meno schermati sentono maggiormente il campo magnetico applicato (B 0 ) rispetto a quelli più schermati. I nuclei deschermati, rispetto a quelli schermati, sentono un campo magnetico più intenso e richiedono una maggiore frequenza per la risonanza. Le frequenze più alte sono a sinistra nello spettro NMR, quindi segnali di nuclei maggiormente deschermati si spostano a frequenze di risonanza più elevate 63

64 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali Il protone H b più vicino a Cl, atomo elettronegativo, risulta maggiormente deschermato rispetto ad H a risuona a frequenze più alte (downfield shift) Il protone H b vicino a F, atomo più elettronegativo rispetto a Br, risulta maggiormente deschermato rispetto ad H a risuona a frequenze più alte (downfield shift) Il protone H b vicino a due atomi di Cl risente di un maggior effetto deschermante rispetto ad H a risuona a frequenze più alte (downfield shift) 64

65 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali 65

66 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali In uno spettro H-NMR le differenze nelle frequenze di risonanza tra i vari tipi di H sono molto piccole se riportate in MHz (differenze di Hz su valori di campo in MHz) La frequenza di risonanza di un nucleo (quindi anche le differenze nelle frequenze di risonanza) dipende dal campo magnetico applicato B 0 e dallo strumento utilizzato. Lo spostamento chimico assoluto, è proporzionale al campo applicato, quindi strumenti che usano campi magnetici più intensi producono spostamenti chimici assoluti maggiori. NECESSITA DI UNIFORMARE I CHEMICAL SHIFT INDIPENDENTEMENTE DAI CAMPI MAGNETICI APPLICATI E QUINDI DI DIVERSI STRUMENTI UTILIZZATI 66

67 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali Scala δ del chemical shift Per rendere indipendente la posizione del segnale rispetto al campo applicato si utilizza la scala δ (in ppm) In questo modo lo spostamento chimico δ, misurato in ppm (Hz/MHz), è indipendente dal campo applicato, quindi è uguale su tutti gli strumenti indipendentemente dall intensità del loro campo magnetico. 67

68 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali Sono QUATTRO i principali fattori che determinano la posizione (sulla scala ppm ) dei principali tipi di protoni:. Deschermatura per la presenza di atomi elettronegativi (effetto induttivo). 2. Campi di anisotropia di solito dovuti a elettroni π nella molecola. 3. Deschermatura dovuta a legami H. 4. Effetto del solvente. 68

69 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift. Effetto induttivo Csp 3 -H In una molecola contenete gruppi elettron-attrattori esiste un campo elettrico che influenza la distribuzione della densità elettronica all interno della molecola e quindi lo schermo magnetico dei nuclei. La diminuzione di densità elettronica per effetto di gruppi elettronegativi comporta deschermaggio. Gli effetti di elettronegatività sono trasmessi attraverso gli orbitali molecolari e si risentono non solo sul H legato ad un C a sua volta legato direttamente ad X ma anche su H legati a C vicinali. 69

70 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift. Effetto induttivo Csp 3 -H Es: Il Cloro descherma il protone, diminuendo la densità elettronica del C, che a sua volta diminuisce la densità elettronica dell idrogeno deschermando quindi il protone. 70

71 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift. Effetto induttivo Csp 3 -H 7

72 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift. Effetto induttivo Csp 3 -H 72

73 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift 2. Campi di anisotropia (Csp 2 -H e Csp-H) I legami chimici sono in genere magneticamente anisotropi hanno un comportamento magnetico differente nelle tre direzioni dello spazio cartesiano. Il momento magnetico indotto da un campo applicato non è quindi uguale in tutte le direzioni dello spazio e lo schermo di un nucleo dipende essenzialmente dalla sua posizione nella geometria della molecola. 73

74 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift 2. Campi di anisotropia (Csp 2 -H e Csp-H) Quando un qualsiasi legame covalente è sottoposto ad un campo magnetico esterno B o, il movimento degli elettroni impegnati nel legame genera delle linee di forza. L effetto globale della costante di schermo determinato da queste linee di forza può essere calcolato. Si determinano così delle zone, i cosiddetti coni di anisotropia diamagnetica, che si possono sommare o opporre (schermare o deschermare + o - ) al campo B o 74

75 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift 2. Campi di anisotropia (Csp 2 -H e Csp-H) Per un Csp 3 il H cade in una zona di schermo Per un Csp 2 il H cade in una zona di deschermo (CH=C tra 5 e 7 ppm, CH=O tra 9 e 0 ppm) Per un Csp il H cade in una zona di schermo (CHC tra e 3 ppm) 75

76 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift 2. Campi di anisotropia (Csp 2 -H e Csp-H) Es: Acetilene Molecola lineare ed il triplo legame è simmetrico rispetto all asse della molecola. Se tale asse si trova allineato con il campo magnetico applicato, gli elettroni π del legame acquistano un moto circolare perpendicolare al campo applicato generando un campo magnetico indotto che si oppone a quello applicato. 76

77 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift 2. Campi di anisotropia (Csp 2 -H e Csp-H) Es: Acetilene L idrogeno, che si trova direttamente sull asse del cono di schermo risuonerà a frequenze più basse (2.88 ppm) rispetto ad un normale CH ad esempio rispetto ad C=CH ( 5.28 ppm). 77

78 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift 2. Campi di anisotropia (Csp 2 -H e Csp-H) Anche se la densità elettronica dei doppi legami C=C e C=O non è proprio a simmetria assiale, l anisotropia per questi gruppi può essere calcolata, osservando che i coni di schermo e deschermo risultano invertiti rispetto a quelli visti per l acetilene. 78

79 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift 2. Campi di anisotropia (Csp 2 -H e Csp-H) L anisotropia del gruppo carbonilico spiega per esempio perché gli idrogeni aldeidici risuonano a 9-0 ppm. Il protone aldeidico infatti si trova nel cono dove il contributo di schermo è negativo per cui risulterà fortemente deschermato. 79

80 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift 2. Campi di anisotropia (Csp 2 -H e Csp-H). Effetto della corrente d anello Quando una molecola con un sistema di elettroni delocalizzato viene posta in un campo magnetico si genera una corrente d anello. Anelli aromatici 4n+2 elettroni liberi di muoversi in una corrente d anello 80

81 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift 2. Campi di anisotropia (Csp 2 -H e Csp-H). Effetto della corrente d anello La corrente d anello genera un campo magnetico le cui linee di forza al centro del sistema aromatico sono opposte al campo applicato e pertanto determineranno un effetto di schermo (+). Gli idrogeni dell anello aromatico si trovano invece in una regione dello spazio in cui le linee di forza hanno la stessa direzione per cui si sommano producendo un effetto di deschermo (-). 8

82 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift 2. Campi di anisotropia (Csp 2 -H e Csp-H). Effetto della corrente d anello 82

83 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift 3. Legami idrogeno Protoni legati ad ossigeni attraverso legami ad idrogeno sono particolarmente deschermati il valore di chemical shift è in molti casi superiore a 0. 83

84 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift 3. Legami idrogeno 84

85 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift 3. Legami idrogeno 85

86 H-NMR: Fattori che influenzano il Chemical shift 4. Effetto del solvente Quando un composto viene sciolto in determinato solvente, lo spettro di risonanza magnetica nucleare, o meglio i valori di chemical shift, dipenderanno dalla interazione con le molecole di solvente. Anche se non è possibile fare una generalizzazione si può sicuramente affermare che effetti diversi si avranno passando da un solvente apolare (CHCl 3 ) ad un solvente polare (DMSO). 86

87 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali 87

88 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali H con un dato intorno chimico (appartenenti a determinati gruppi funzionali) hanno chemical shift entro certi limiti prevedibili 88

89 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali Alcani La principale influenza nel chemical shift dei protoni negli alcani è dovuto alla presenza di sostituenti. I segnali relativi agli alcani sono distribuiti su un range piuttosto vasto di c.s. Alcune regole generali: l effetto induttivo di deschermo è direttamente proporzionale alla elettronegatività del sostituente considerando lo stesso sostituente i protoni metilici (CH 3 ) sono più schermati dei metilenici (CH 2 ) e dei metinici (CH). 89

90 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali Alcani 90

91 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali Alcani Nei cicloalcani il c.s. dei protoni dipende innanzitutto dalle dimensioni dell anello, dalla sua mobilità conformazionale e da eventuali costrizioni steriche. La costrizione d anello nel ciclopropano produce una forte anisotropia diamagnetica che porta a segnali molto schermati (0.22 ppm). Tale schermo diminuisce avvicinandosi al cicloeptano, oltre il quale non si osserva più variazione considerevole di c.s. 9

92 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali 92

93 93

94 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali ALCHENI I protoni olefinici di etileni variamente sostituiti si incontrano solitamente nel range compreso tra 4 e 7.5 ppm. I sostituenti sul doppio legame influenzano il chemical shift dei protoni olefinici per effetto induttivo, mesomerico o sterico. 94

95 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali ARENI Per quanto riguarda i composti aromatici, lo schermo è principalmente determinato dall effetto mesomerico dei sostituenti. Es: nell anilina le posizioni orto e para sono più schermate rispetto alle meta poiché, come si ricava dalle strutture limite, sono le posizioni dove la densità di carica negativa è maggiore. 95

96 H-NMR: Chemical shift, posizione dei segnali ARENI Iprotoni 2,4 e 6 sono schermati rispetto al classico valore di risonanza degli idrogeni del benzene (7,27 ppm). Questo schermo è quindi dovuto all effetto mesomerico (+M) del gruppo amminico. 96

97 H-NMR: Regole di Shoolerey Sulla base dell osservazione dei dati sperimentali, è possibile quantizzare gli effetti sul chemical shift di un protone dovuti alla presenza di vari gruppi funzionali. Poiché tali effetti sono spesso additivi, è possibile applicare delle formule semplici per la predizione del chemical shift. Regole di Shoolerey 97

98 H-NMR: Regole di Shoolerey δ = σ W +δ Z 98

99 H-NMR: Regole di Shoolerey 99

100 H-NMR: Regole di Shoolerey 00

101 H-NMR: Regole di Shoolerey 0

102 H-NMR: H su eteroatomi Protoni su eteroatomi, quali ad es. quelli di gruppi OH, NH 2, SH: Questi sono protoni scambiabili nel senso che formano legami a H con altre molecole della stessa natura e con acqua e/o acidi presenti nel solvente. R-OH + D 2 O R-OD + HDO Il segnale del gruppo -OH scompare Il loro δ pertanto è variabile e dipende dalla concentrazione, purezza e temperatura. Sono suscettibili di legami ad idrogeno. Sono spesso soggetti ad effetti del quadrupolo magnetico nucleare dell eteroatomo, 4 N. Per tali motivi essi possono avere chemical shift variabili in funzione della concentrazione, della temperatura e del solvente, e appaiono di norma non accoppiati. 02

103 H-NMR: H su eteroatomi Protoni su eteroatomi, quali ad es. quelli di gruppi OH, NH 2, SH: In genere sono segnali allargati poiché contengono il contributo di tutte le specie intermedie di scambio. Ragionevolmente, aumentando la temperatura, aumenterà la velocità di scambio per cui il segnale diverrà più stretto. 03

104 H-NMR: H su eteroatomi Un metodo per mettere in evidenza la presenza di idrogeni di tipo X-H è quello di sfruttare la loro acidità e quindi la loro facilità a dare processi di scambio. Per trattamento con acqua deuterata, più o meno velocemente, questi idrogeni vengono scambiati con deuterio. Come risultato, dal punto di vista spettroscopicico, si ha che scompariranno dallo spettro NMR protonico tutti i segnali relativi a protoni X-H. 04

105 Analisi dei Medicinali I G. Poce Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) H-NMR: H su eteroatomi Gruppi -OH chemical shift variabile δ 2-6 ppm shift a campi bassi per effetto di leg H singoletti stretti per rapido scambio che impedisce l accoppiamento; protoni fenolici, più acidi, risuonano generalmente tra d 4 e 7.5 ppm. Leg H intramolecolari portano i segnali a campi bassi, fino a d 0-2. gruppi OH di enoli ed acidi carbossilici: d 0-6 ppm. evidenziabili per trattamento con D 2 O (scompaiono). 05

106 H-NMR: H su eteroatomi Gruppi -NH- momento di quadrupolo magnetico di 4 N velocità di scambio variabile, alta per ammine (picchi stretti non accoppiati), intermedia per ammine aromatiche alchilate (picco largo parzialmente accoppiato), bassa per ammidi primarie e secondarie, pirroli, indoli (picchi larghi, protoni adiacenti accoppiati). ammine alifatiche d ppm; ammine aromatiche d 3-5 ppm, ammidi, pirroli e indoli d 5-9 ppm. shift a campi bassi in presenza di dimetilsolfossido. scambiano in presenza di D 2 O (velocità variabile). 06

107 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin Il campo magnetico di un nucleo risente dell orientazione degli spin dei nuclei vicini attraverso gli elettroni di legame, poiché c è una certa tendenza da parte di un elettrone di legame ad accoppiare il proprio spin con quello del protone vicino. Nuclei attivi (protoni) che sono legati (o concatenati) tra loro accoppiano. Questo accoppiamento determina una separazione tra righe, cioè il segnale relativo ad un protone appare come un insieme di linee. Vedere un segnale con una molteplicità di linee significa che il protone in esame vede un altro protone. 07

108 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin Il campo di cui risente H b è influenzato dagli stati di spin di H a e viceversa. A seconda dell orientazione dello spin di H a (parallela o antiparallela), il campo di risonanza di H b sarà di poco inferiore o di poco superiore rispetto al valore in assenza di H a. Il segnale di H b è pertanto sdoppiato da H a in due linee di intensità uguale (doppietto) equidistanti dal valore di chemical shift che avrebbe avuto in assenza di H a. Il chemical shift di H b è il valore medio dei due valori in cui il segnale di H b è sdoppiato Il fenomeno è definito accoppiamento spin-spin. L accoppiamento si manifesta solo tra nuclei non equivalenti H b Cl Br H a 08

109 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin Il momento magnetico del nucleo produce una piccola polarizzazione degli elettroni di legame e questa è trasmessa attraverso la sovrapposizione orbitalica all altro nucleo. Quindi per il H non vi sarà un unica transizione H α -H β ma 2 possibili transizioni. L interazione si propaga attraverso gli elettroni di legame H-C-H (sp 3 ) 09

110 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin L energia di interazione tra i due spin A-B è : J AB è la costante di accoppiamento scalare (tra i legami) ed è indipendente dal sistema di riferimento usato 0

111 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin La distanza tra i segnali, detta costante di accoppiamento (J), si misura in Hz, è indipendente dal campo magnetico applicato ed assume lo stesso valore per i due nuclei che accoppiano. La J si ottiene misurando la differenza in chemical shift tra due picchi di un multipletto (in ppm) e moltiplicando questo valore per la frequenza corrispondente al campo magnetico applicato (B 0 propria dello spettrometro utilizzato). H b Cl Br H a

112 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin Generalmente l accoppiamento perde importanza dopo il terzo legame. In genere, nei sistemi alifatici, l accoppiamento spin-spin si manifesta attraverso massimo 3 legami (J 3 ). Si osservano J 4 o superiori nei sistemi aromatici (J meta 4 legami, J para 5 legami) e J long range nei sistemi coniugati (allilici) o saturi ma conformazionalmente bloccati X Z X Z H a H b X H a H b Z J geminale - 2 legami J vicinale - 3 legami 2

113 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin In due segnali reciprocamente accoppiati il valore di J è lo stesso. 3

114 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin 4

115 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin La molteplicità del segnale è data dalla formula generale: m = 2 n I + dove: m = molteplicità; n = numero di nuclei accoppiati; I = numero quantico di spin dei nuclei accoppiati. Per H, 3 C, 9 F aventi I = ½ la formula diventa m = n + Per cui si è soliti dire che : - un CH che accoppia con un protone è un doppietto (d) - un CH che accoppia con 2 protoni equivalenti è un tripletto (t) - un CH che accoppia con 3 protoni equivalenti è un quartetto (q) - un CH che accoppia con 4 protoni equivalenti è un quintetto (quint) - un CH che accoppia con 5 protoni equivalenti è un sestetto (sest) 5

116 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin Il protone H b risente degli stati di spin dei due nuclei H a che esistono in quattro stati possibili con la stessa probabilità. Il segnale è diviso pertanto in 3 picchi di cui quello centrale di intensità doppia (tripletto di aree :2:). 6

117 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin I protoni del CH 2 risentono dei possibili stati di spin dei 3 protoni del metile. Gli stati a spin tra loro antiparalleli hanno nel complesso due effetti sul chemical shift del CH 2 ed hanno probabilità tripla rispetto agli stati a spin tra loro paralleli. Il segnale è diviso pertanto in 4 picchi di cui quelli interni di intensità tripla (quartetto di aree :3:3:). 7

118 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin Accoppiamento dell isopropile 8

119 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin L intensità relativa delle linee, per numero quantico di spin I = ½, corrisponde ai coefficienti del teorema binomiale (triangolo di Tartaglia o Pascal). Dallo studio della molteplicità m di un segnale possiamo risalire al numero n di nuclei equivalenti adiacenti n = m -. 9

120 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin Sistemi del primo ordine Un sistema di spin è l insieme di nuclei (protoni) che accoppiano tra di loro. Saper analizzare un sistema di spin permette di avere un idea precisa sulle molteplicità attese per i vari gruppi di protoni equivalenti e quindi avere informazioni sulla connettività. Protoni chimicamente equivalenti: sono protoni che presentano lo stesso intorno chimico. Per essi si usa una lettera dell alfabeto con un numeratore che indica il numero di protoni equivalenti ( A 2 ). Se i sistemi sono del primo ordine Δν / J 0 si usano lettere lontane dell alfabeto (AX, A 2 X) se sono di ordine superiore Δν / J < 0 si usano lettere vicine (AB, XY ecc). 20

121 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin Sistemi del primo ordine 2

122 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin Sistemi del primo ordine In tal caso è possibile interpretare lo spettro secondo i criteri di molteplicità visti prima. E possibile calcolare le J. 22

123 c H b H H a X Y H H H c b J a,b = 9 Hz J b,c = 9 Hz a 23

124 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin Sistemi del primo ordine AMX 24

125 H-NMR: Molteplicità dei segnali, accoppiamento spin-spin Sistemi del primo ordine Nei sistemi di primo ordine le costanti di accoppiamento possono essere calcolate scomponendo il segnale, misurando le differenze in ppm e moltiplicando per la frequenza di risonanza in MHz 25

126 nucleo δ (ppm) H m J H a 7.95 dd H b 7.44 td H c 6.98 td H d 6.83 dd

127 nucleo δ (ppm) H m J H a 7.48 t.5 H b 6.94 dt H c 7.32 t 7.5 H d 7.59 dt

128 nucleo δ (ppm) H m J H a d 7.5 H b d

129 H-NMR: Equivalenza chimica ed equivalenza magnetica. 29

130 H-NMR: Equivalenza chimica ed equivalenza magnetica. 30

131 H-NMR: Equivalenza chimica ed equivalenza magnetica. 3

132 H-NMR: Equivalenza chimica ed equivalenza magnetica. Due o più protoni che sono chimicamente equivalenti sono anche magneticamente equivalenti se, rispetto ad un qualsiasi altro protone con cui accoppiano, presentano costanti di accoppiamento uguali. 32

133 33

134 Integrazione =4 4/8=0.5 H=0.5 Assegnazione: Segnale a 2.43 ppm= quadrupletto; 2H;CH 2 ; Ha Segnale a 2. ppm= singoletto; 3H; CH 3 ; Hc Segnale a. ppm= triplettto; 3H; CH 3 ; Hb s 2. Sistema di spin: A 3 A 2 X q t 2H 3H 3H 34

135 35

136 Integrazione.5++.5=4 4/8=0.5 H=0.5 Assegnazione: Segnale a 3.48 ppm= singoletto; 3H; CH 3 ; Hc Segnale a 2 ppm= quadrupletto; 2H; CH 2 ; Hb Segnale a 0.83 ppm= tripletto; 3H; CH 3 ; Hc Sistema di spin: A 3 A 2 X s q t.5.5 3H 2H 3H 36

137 37

138 Integrazione.5+4.5=6 6/4=.5 H=.5 Assegnazione: Segnale a 5.95 ppm= quadrupletto; H; CH; Ha Segnale a 2.08 ppm= doppietto; 3H; CH 3 ; Hb Sistema di spin: AX q d H 3H 38

139 39

140 Integrazione 2+2=4 4/4= H= Assegnazione: Segnale a 3.28 ppm= singoletto; 2H; OH; Ha Segnale a.25 ppm= singoletto; 2H; CH 2 ; Hb.25 Sistema di spin: A2 A s s 2 2 2H 2H 40

141 4

142 Integrazione = /9=0. H=0. Assegnazione: Segnale a 2.44 ppm= tripletto; 2H; CH 2 ; Hb Segnale a.98 ppm= doppio tripletto; 2H; CH 2 ; He Segnale a.79 ppm= tripletto; H; CH; Hf Segnale a.3 ppm= quintupletto; 2H; CH 2 ; Hc Segnale a 0.38 ppm= singoletto broad; 2H; NH 2 ; Ha Sistema di spin: A 2 M 2 X 2 A 2 X t dt t quint Scambia cond 2 O s 2H 2H H 2H 2H 42

143 43

144 Integrazione = /0=0. H=0. 2H H 2H 2H 3H 44

145 Integrazione = /0=0. H=0. Assegnazione: Segnale a 0.30ppm= tripletto; 3H; CH 3 ; Hb Segnale a.25 ppm= quadrupletto; 2H; CH 2 ; Ha Sistema di spin: A 2 X 3 t q 2H 3H 45

146 Integrazione = /0=0. H=0. Assegnazione: Segnale a 7.90ppm= multipletto; 2H; CH; Hc Segnale a 7.47 ppm= multipletto; H; CH; He Segnale a 7.38 ppm= multipletto; 2H; CH; Hd Sistema di spin: AMX m m m 2H H 2H 46

147 47

148 Integrazione = /7=0.4 H=0.4 2H 2H 3H 48

149 Integrazione = /7=0.4 H=0.4 Assegnazione: Segnale a.75ppm= singoletto; 3H; CH 3 ; Ha Segnale a 7.2 ppm= multipletto; 2H; CH; Hc Segnale a 6.90 ppm= multipletto; 2H; CH; Hb Sistema di spin: A A 2 X 2 m m 2H 2H 49