(Reazione a catena della polimerasi) & ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO Corso di Ingegneria Genetica e Microbiologa Applicata Prof. Renato Fani Percorso1: Analisi della variabilità genetica di popolazioni microbiche elettrigeniche
L identificazione dei microrganismi avviene attraverso l ANALISI del 16S rdna
GGCTGAGATGGCTAGCTGGTCTGAGAGGATGGCCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGTGATGA AGGCCTTCGGGTCGTAAAGCCCTGTCAAGAGGGACGAAACCTCGTCGACCTAACACGTCGACGACCTGAC GGTACCTCTGAAGGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTG TTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGTGTAGGCGGCCTTCTAAGTCTGGTGTGAAAGCCCGGGGCTCAAC CCCGGAAGTGCATTGGATACTGGGAGGCTGGAGTACCGGAGAGGAGGGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTG AAATGCGTAGATATCAGGAGGAACACCGGTAGCGAAGGCGGCCCTCTGGACGGATACTGACGCTGAGACG CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGGGCACTAGGTGT TCGGGGTATTGACCCCCTGAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAATACGGCCGCAAG GTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGC GAAGAACCTTACCTGGGCTAGACAACATCGGACAGCCCCAGAAATGGGGTCTCCCCGCAAGGGGCCGGTG GTTCAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA
Verdi non zolfo-ox Deinococci Spirochete Verdi zolfo-ox Bacteroidi Planctomyces Chlamidie Gram+ Thermotoga Cianobatteri Aquifex Hydrogenobacter Proteobatteri
E. coli S. flexneri S. typhimurium S. enterica Y. pestis B. aphidicola B.floridanus S. oneidensis V. cholerae V. parahaemolyticus V. vulnificus P. multocida H. influenzae P. aeruginosa P. putida P. syringae X. fastidiosa X. campestris X. axonopodis N. europaea C. violaceum N. meningitidis R. solanacearum B. pertussis B. parapertussis B. bronchiseptica C. crescentus B.japonicum S. meliloti A. tumefaciens M. loti B. melitensis B. suis H. hepaticus W. succinogenes C. jejuni 0.05 Albero filogenetico dei proteobatteri
DETERMINAZIONE ed ANALISI DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DETERMINAZIONE DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DEL 16S rdna Costruzione albero filogenetico (MEGA) Allineamento delle sequenze (ClustalW) CONFRONTO IN BANCA DATI DELLE SEQUENZE OTTENUTE (BLASTn)
Come si ottiene il 16S rdna da una colonia batterica?
AMPLIFICAZIONE DEL 16S rdna LISI TERMICA 16S rdna MILIARDI DI COPIE DEL 16S rdna
AMPLIFICAZIONE DEL 16S rdna LISI TERMICA 16S rdna ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO MILIARDI DI COPIE DEL 16S rdna
La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica che ha rivoluzionato il mondo della chimica e della genetica, permettendo l amplificazione in vitro di frammenti di DNA con innumerevoli applicazioni in campo medico, agrario, animale e nelle investigazioni della magistratura.
DNA polimerasi termoresistenti e optimum di T 70 C Oligonucleotidi che fungono da innesco 18-20 nt e 50-60% GC dntp DNA stampo Mg 2+
Non è indispensabile conoscere la sequenza intera PERCHE?
Basta conoscere le estremità del frammento di DNA da amplificare GATTCC CTAAGG GATTCC CTAAGG AAGCCC TTCGGG Disegnare oligonucleotidi (frammenti di DNA) a singola elica complementari ad una delle due estremità TTCGGG AAGCCC TTCGGG GATTCC
PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI: 1- DENATURAZIONE: TEMP. 95 C. IL DNA STAMPO VIENE DENATURATO 2-APPAIAMENTO: TEMP. 50-65 C. I PRIMER SI APPAIANO CON IL DNA STAMPO 3- SINTESI: TEMP.72 C E OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI
Denaturazione del DNA GATTCC AAGCCC CTAAGG TTCGGG Rinaturazione del DNA GATTCC GATTCC CTAAGG AAGCCC TTCGGG TTCGGG Estensione Taq POLIMERASI 72 C
Estensione Taq POLIMERASI 72 C GATTCC CTAAGG AAGCCC TTCGGG GATTCC CTAAGG AAGCCC TTCGGG
Denaturazione GATTCC CTAAGG Estensione Taq POLIMERASI 72 C AAGCCC TTCGGG GATTCC CTAAGG AAGCCC TTCGGG GATTCC CTAAGG AAGCCC TTCGGG GATTCC CTAAGG AAGCCC TTCGGG
DNA stampo Primer 5 3 3 5 94-95 C per 30-60 55-72 C (5 C < T m primer) 72 C
Nella provetta è presente una sola copia del gene X Nella provetta sono adesso presenti miliardi di copie del gene X gene X gene X
Nella provetta non è presente il gene X Nella provetta non è presente il gene X
ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO Controllo negativo Marker
AMPLIFICAZIONE DEL 16S rdna LISI TERMICA 16S rdna ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO MILIARDI DI COPIE DEL 16S rdna
Preparazione Reazione di Sequenziamento
Lisi termica La lisi cellulare corrisponde alla rottura degli involucri cellulari (parete e membrana) con conseguente fuoriuscita delle componenti cellulari, tra cui il DNA da cui faremo in seguito l amplificazione via PCR del gene 16S rdna. Protocollo sperimentale 1. Prelevare con la punta di una micropipetta una singola colonia (da piastra di LB del 20/4) del diametro di ca. 1mm 2 e stemperarla in 20 µl di H2O bidistillata sterile, in un tubo eppendorf. 3. Incubare per 10 a 95 C e per almeno 5 in ghiaccio per operare la lisi delle cellule. 5. Il campione viene poi brevemente centrifugato per separare fase solida da fase acquosa dove è solubilizzato il DNA. LISI TERMICA 10 min a 95 C e 5 min in ghiaccio
TIPICA MISCELA DI REAZIONE COMPONENTE VOLUME Concentrazione finale H 2 O (a 20µl di volume finale) 12 µl 10 X PCR Buffer MgCl2 Forward primer P0 (20 pmols/µl) Reverse primer P6 (20 pmols/µl) 10 X dntps (2mM) polimerasi termostabile (5U/µl)
Marker (µl) Sample (µl) DNA 1 18 BBF 1(6X) 2(10X) TE 4 -
ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO Procedura: Pesare un tubo eppendorf vuoto e segnare il risultato. Tagliare con un bisturi il frammento di DNA che interessa dal gel d agarosio. Durante questa fase è opportuno tagliare quanto più vicino al frammento in modo tale da prelevare la minima quantità di gel insieme al DNA di interesse. Porre la fetta di gel nel tubo eppendorf precedentemente pesato e pesare nuovamente il tutto. Segnare il risultato e calcolare il peso della fetta. Campione Peso eppendorf Peso ep p+fetta Peso della fetta V QG DNA [ng/µl]
Procedura: Aggiungere 3 volumi del buffer QG ad 1 volume di gel (100 mg 100 µl). Es: aggiungere 300 µl di buffer QG per un frammento di 100 mg. IL Buffer QG contiene delle sostanze capaci di sciogliere l agarosio permettendo così la liberazione del DNA dalle maglie del gel stesso. Incubare per 10 minuti a 50 C. I tempi di incubazione possono essere aumentati per la completa dissoluzione del gel; per facilitare lo scioglimento vortexare, ogni 3 minuti, il tubo eppendorf (3-4 volte). Trasferire la soluzione nella colonnina fornita dal Kit; essa contiene una membrana che ha grande affinità per il DNA. Centrifugare per 1 minuto a 13000 rpm; in questo modo, durante la centrifugazione, il DNA si lega alla membrana della colonnina, mentre il resto attaversa la colonnina e si deposita sul fondo del tubo di plastica. Eliminare quindi l eluato e riporre la colonnina nel tubo di plastica.
Procedura: Aggiungere 750 µl del buffer PE. Incubare per 2-5 minuti a temperatura ambiente. Questo passaggio serve essenzialmente ad operare un lavaggio della colonnina permettendo l eliminazione delle scorie residue e lasciando il DNA adeso alla membrana della colonnina stessa. Centifugare per 1 minuto a 13000 rpm. Eliminare quindi l eluato e riporre la colonnina nel tubo di plastica. Centrifugare ancora una volta per 1 minuto a 13000 rpm. Questo passaggio permette di eliminare tutti i residui di etanolo. Eliminare l eluato e porre la colonnina in un tubo eppendorf da 1.5 ml. Aggiungere 10 µl del buffer EB (Tris-HCl 10 mm ph 8.5) al centro della membrana. Fare attenzione a non toccare la membrana con la punta. Il tampone EB permette di staccare il DNA dalla colonnina. Centrifugare 1 minuto a 13000 rpm. L eluato presente nell eppendorf contiene il DNA e va quindi conservato I prodotti di amplificazione purificati sono visualizzati e quantificati successivamente mediante elettroforesi su gel di agarosio.
Marker (µl) Sample (µl) DNA 1 9 BBF 1(6X) 1(10X) 1500 bp TE 4 - Marker (µl) Sample (µl) DNA 1 1 BBF (6X) 1 1 TE 4 4 60 ng /µl
Preparazione dei campioni per la reazione di sequenziamento Si richiede la preparazione di una miscela con un volume finale pari a 11 µl in cui vi deve essere una quantità di DNA di cui si vuole ottenere la sequenza nucleotidica pari a 10 ng ogni 100 bp. Il nostro frammento è lungo 1500 bp quindi una quantità totale di 150 ng, se per esempio il nostro campione precedentemente purificato era stato quantificato 50 ng/ µl, avremo bisogno di un volume di 3 µl. Occorre inoltre 1 µl di primer Po alla conc. di 3,2 µm. Dunque in questo particolare esempio, 3 µl di DNA purificato + 1 µl di primer Po + 7 µl di dh 2 O per portare a volume. Vfin = 11µl DNA purificato 10 ng ogni 100 bp P0 (conc. 3,2 µm) dh 2 O 1 µl Per portare a volume