Strumenti della Genetica Molecolare Umana (5) Prof. Mario Ventura Capitoli 6-7-8
LEZIONE SUMMARY PER TECNICHE GIORNO 23 OTTOBRE LEZIONE AGGIUNTIVA GIORNO 30 NOVEMBRE ORE 8:30-11:00 Prof. Mario Ventura
RICERCANDO UN GENE NELLE BANCHE DATI GENOMICHE Per trovare un clone di interesse e necessario testare la libreria con una data sequenza Screening di librerie Si puo cercare il clone genomico che contiene un dato STS (si amplifica il DNA genomico con i primer corrispondenti all STS (sequenza singola) e si ibrida sui filtri il prodotto di PCR) sts su sequenza non codificante sts su sequenza codificante Prof. Mario Ventura Si puo cercare il numero di copie di un dato gene (o STS) (e essenziale conoscere la ridondanza della libreria)
Esempio di screening I Marcatura radioattiva Ibridazione FILTRO 3 PCR product Ogni Segmento e costituito da un numero variabile di filtri (fogli di nitrocellulosa dove sono depositati I cloni BAC della libreria) Prof. Mario Ventura FILTRO 4 P O N M L K J I H G F E D C B A P O N M L K J I H G F E D C B A 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Pannello4 Pannello2 Pannello1 Pannello6 Pannello5 Pannello3
Esempio di screening II Il BAC e 151P3 Prof. Mario Ventura
Ridondanza e copy number differences Per una libreria di genomico umano con inserti di dimensioni medie di 40kb: 1GE = 3000 Mb (DNA totale)/ 40 kb (grandezza inserto medio) = 75.000 cloni Se dopo clonaggio otterro 300.000 cloni la libreria sara ridondante 4 volte IMPORTANTE PER EVIDENZIARE LE DUPLICAZIONI SEGMENTALI/COPY NUMBER VARIATIONS Data ridondanza 6 se doppo screening si ottengono 20 cloni positivi si puo supporre che il numero di copie sia ~3 (20/6~3) Ricorda che non e una stima precisa perche risente dei bias di clonaggio (presenza/ assenza di siti di restrizione) Prof. Mario Ventura
Ibridazione di ASO (allele-specific oligonucleotide) Fondamentale l alta stringenza! Prof. Mario Ventura 7
ASO per la β 39 N βn β39 Test per la mutazione β39 basato sul dot-blot. Ibridazione con oligonucleotide normale (N) e mutante (β39) Prof. Mario Ventura 8
Southern e Northern blot Si distinguono per il materiale target utilizzato s o u t h e r n Quando usare il southern? Quando usare il Northern? Prof. Mario Ventura 9
DNA genomico digerito con Enzimi di restrizione gel di agarosio colorato con EtBr Il righello serve per calcolare la lunghezza dei frammenti in funzione dello spazio percorso (cfr.foto succ.) Marker per sapere come si sono distribuiti i frammenti La luminosita nei pozzetti deriva da DNA non ben digerito e/o da impurita per una estrazione poco accurata Questa banda piu intensa e data da sequenze ripetute che essendo tagliate periodicamente e in frammenti sempre della stessa lunghezza si accumulano alla stessa altezza La intensita equivalente del DNA delle diverse corsie indica che le quantita caricate di DNA dei campioni sono le stesse. Il DNA a basso peso verso il fondo del gel si vede male perche sono meno rappresentati infatti la maggior parte del DNA e nella parte alta del gel Prof. Mario Ventura 10
Southern blot (digestione e ibridazione su filtro) DNA genomico digerito caricato su gel con EtBr Lastra sviluppata dopo esposizione del filtro ottenuto dopo trasferimento su filtro (Southern blot) e ibridazione con sonda marcata radioattivamente (P32) Prof. Mario Ventura 11
Gli RFLP come tutti i maracatori polimorfici permettono l identificazione dell aplotipo Definiti polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione Definizione di aplotipo Quali sono i vantaggi della PCR per identificare gli RFLP? Trova le differenze! Prof. Mario Ventura 12
Tecniche per l identificazione degli RFLPs Prof. Mario Ventura 13
Polimorfismo ed uso di RFLP Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite, microsatellite. RFLP: La sonda riconosce il polimorfismo con un particolare enzima, ma non con altri. Quindi e la coppia sonda-enzima che evidenzia il RFLP!!! Enzima Enzima A B A1 B1 B2 A2 A3 A1 B1 B2 mutazione elimina il sito di restrizione A3 endonucleasi A endonucleasi B Pattern su filtro Prof. Mario Ventura 14
RFLP per distinguere lo stato degli alleli In questo gruppo di individui il cdna riconosce nel genoma dopo digestione 2 frammenti di = lunghezza e : 14 kb perche su entrambi i cromosomi in quella regione non e presente un altro sito QUINDI UNA SOLA BANDA A1 A1 14Kb 14Kb A2 A2 Omozigoti allele 14 In questo gruppo di individui il cdna riconosce nel genoma dopo digestione 4 frammenti 2 da 10.5 e 2 da3.5 kb perche su entrambi i cromosomi in quella regione e presente un altro sito che cade all interno della regione identificata dal cdna. QUINDI 2 BANDE 3.5Kb A1 3.5Kb A1 A3 10.5Kb 10.5Kb A2 A2 Omozigoti allele 10.5,3.5 Eterozigoti alleli 14 e 10.5,3.5 In questo gruppo di individui il cdna riconosce nel genoma dopo digestione 3 frammenti : 1 da 10.5 e 1 da3.5 kb originati dalla digestione di un cromosoma (perche e presente un altro sito che cade all interno della regione identificata dal cdna) e 1 frammento da 14 originato dalla digestione dell altro cromosoma. QUINDI 3 BANDE A1 3.5Kb A1 14Kb A3 10.5Kb Prof. Mario Ventura 15 A2 A2
RFLP in diagnostica: RFLP interno al gene di interesse Un esempio di malattia diagnosticabile attraverso gli RFLP e l anemia falciforme. In questa patologia, a livello del gene della b-globina si verifica una sostituzione nucleotidica (A>T) nel codone 6. Questa alterazione porta ad una sostituzione amminoacidica glu > val e nello stesso tempo abolisce un sito di restrizione per l enzima MstII. Come risultato, i diversi frammenti di restrizione per l enzima MstII possono essere evidenziati con una sonda del gene della b-globina. Prof. Mario Ventura 16
Ibridazione in situ L ibridazione in situ si esegue direttamente sul materiale biologico che sia tessuto o cromosomi. Permette di definire le localizzazione del materiale target in un esperimento. Anche in questo caso si possono usare DNA, RNA e cdna come sonde Quando usare l uno o l altra? RNA antisensoper catena pesante di b-miosina Prof. Mario Ventura 17
cromosoma sul vetrino FISH sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo denaturazione A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T doppia elica di DNA A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T denaturazione A ibridazione della sonda sui cromosomi denaturati sul vetrino A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T T A G G C A T A G G A T A T C G G T A T C C T A T A G G C A T A G G A T Prof. Mario Ventura osservazione del vetrino
FISH Per la FISH si possono utilizzare: 1. Sonde puntiformi (fosmidi, cosmidi, BAC, PAC o YAC) 2. Sonde ottenute da ibridi (librerie totali e parziali) che colorano interamente o parzialmente i cromosomi 1. 2. Prof. Mario Ventura
Principio della fluorescenza Spettri di assorbimento ed emission Prof. Mario Ventura
FISH : microscopio a fluorescenza Osservazione al microscopio Lampada a vapori di mercurio filtro di eccitazione filtro di emissione CCD camera obiettivo/ condensatore fotografia Elaborazione al computer Prof. Mario Ventura
Prof. Mario Ventura Filtri del microscopio a fluorescenza
FISH: metafase in DAPI Cromosomi 1. denaturati 2. colorati con DAPI Prof. Mario Ventura
Prof. Mario Ventura FISH: segnali Utilizzando sonde puntiformi (BAC)
Prof. Mario Ventura FISH: merge
Tipologia di FISH La FISH in relazione alla tipologia di bersaglio si distingue in: 1. su metafasi (l ibridazione si opera su vetrini con cromosomi metafasici); 2. su cromosomi stretchati 3. su fibre di DNA (fiber-fish) 4. sui nuclei interfasici Tipologie piu recenti di FISH si sono studiate per la colorazione di tutto il cariotipo, sistema utile ed indispensabile per lo studio delle alterazioni cromosomiche dei tumori (principalmente solidi) IMP. distingui tra risoluzione e sensibilita del metodo! Prof. Mario Ventura
Prof. Mario Ventura Tipologia di FISH
Prof. Mario Ventura FISH: merge
FISH nei tumori Prof. Mario Ventura WCP, Whole Chromosome Paint (librerie cromosomiche totali)
FISH su cromosomi stretchati Prof. Mario Ventura
Prof. Mario Ventura DNA Fibers
Prof. Mario Ventura FIBER-FISH
FISH in interfase Quando la uso? Perche? Prof. Mario Ventura
FISH PER IDENTIFICARE TRASLOCAZIONI E INVERSIONI Prof. Mario Ventura
CARIOTIPO SKY Utilizzando sonde che colorano tutto il cromosoma Prof. Mario Ventura
SKY Ogni cromosoma è marcato con una combinazione unica di massimo quattro dei cinque fluorocromi utilizzati. SkyPaint Labeling Scheme chr Label chr Label chr Label 1 BCD 9 ADE 17 C 2 3 4 5 6 7 8 E ACDE CD ABDE BCDE BC D A = Rodamina B = Texas Red C = Cy 5 10 11 12 13 14 15 16 CE ACD BE AD B ABC BD D = FITC E = Cy 5.5 18 19 20 21 22 X Y ABD AC A DE ABCE AE CDE Si ottiene così una specifica fluorescenza, o spettro, per ciascun cromosoma. Prof. Mario Ventura 36
Prof. Mario Ventura
Prof. Mario Ventura SKY: Studio di marker cromosomici
Comparative Genomic Hybridization (CGH) Prof. Mario Ventura
CGH Comparative Genome Hybridization AUMENTI O DIMINUZIONI DEL NUMERO DI COPIE DI SEQUENZE DI DNA IN UN CAMPIONE TEST (spesso tumori) CONFRONTATO CON UN DNA NORMALE DI RIFERIMENTO POTERE RISOLUTIVO 10-20MB DNA GENOMICO NORMALE ROSSO + DNA GENOMICO TUMORALE VERDE FISH COMPETITIVA SU METAFASI NORMALI DNA TUMORALE CON UNA REGIONE GENOMICA AMPLIFICATA DELEZIONI DI REGIONI SPECIFICHE NEL DNA TUMORALE INCREMENTO DI FLUORESCENZA VERDE NELLA REGIONE AMPLIFICATA INCREMENTO DI FLUORESCENZA ROSSA NELLA REGIONE DELETA Prof. Mario Ventura
Prof. Mario Ventura
Comparative Genomic Hybridization (CGH) Prof. Mario Ventura 1. Normale: si lega tanto DNA verde quanto DNA rosso.il rapporto dell intensità della fluorescenza nei 2 colori è pari a 1. 2. Duplicazione: si lega più DNA verde del DNA rosso.il rapporto dell intensità della fluorescenza verde/rosso è > 1. 3. Delezione: si lega meno DNA verde del DNA rosso. Il rapporto dell intensità della fluorescenza verde/rosso è < 1.
Prof. Mario Ventura
Red=control DNA DEL DEL Green=test DNA DUP Prof. Mario Ventura
Conventional CGH Array CGH ( acgh ) RISOLUZIONE=20Mb Label patient DNA with Cy3 Label control DNA with Cy5 Label patient DNA with Cy3 RISOLUZIONE=<1Mb Label control DNA with Cy5 Label patient DNA with Cy5 Label control DNA with Cy3 Mix Mix Mix Hybridize DNA to genomic clone microarray Analyze Cy3/Cy5 fluorescence ratio of patient to control Cy3/Cy5 ratio >1 Duplication Cy3/Cy5 ratio <1 Deletion Cy3/Cy5 ratio >1 Duplication Cy3/Cy5 ratio <1 Deletion Cy3/Cy5 ratio <1 Duplication Cy3/Cy5 ratio >1 Deletion Prof. Mario Ventura
ARRAY-CGH MICROARRAY Prof. Mario Ventura
Prof. Mario Ventura
Prof. Mario Ventura Array-CGH
Indicazioni per la CGH Dismorfismi, ritardo mentale, anomalie congenite multiple con cariotipo normale. VANTAGGI Combina analisi dei telomeri e delle regioni specifiche di malattie con un singolo esperimento Rivela delezioni e duplicazioni LIMITI Non rivela translocazioni bilanciate, inversioni, o bassi mosaicismi. Prof. Mario Ventura
Prof. Mario Ventura Il sequenziamento
Prof. Mario Ventura Sequenziamento automatico
Prof. Mario Ventura Lettura gel di sequenziamento
Next generation Sequencing The high demand for low-cost sequencing has driven the development of high-throughput sequencing technologies that parallelize the sequencing process, producing thousands or millions of sequences at once. High-throughput sequencing technologies are intended to lower the cost of DNA sequencing beyond what is possible with standard dye-terminator methods. Three major strategies: - 454 pyrosequencing - Illumina (Solexa) sequencing - SOLiD sequencing Prof. Mario Ventura
Link da vedere... fortemente consigliati... ovviamente in inglese! https://www.youtube.com/watch?v=opiq7sre5vk https://www.youtube.com/watch?v=6is3w7jkfp8 Prof. Mario Ventura