Alcune classi particolari di malattie genetiche

Alcune classi particolari di malattie genetiche Malattie Mitocondriali Imprinting (sindrome di Prader-Willi e sindrome di Angelman) Malattie da triplette (X-fragile, SCA, Corea di Huntington). Concetto di premutazione ed anticipazione

Genetica mendeliana classica: Le mutazioni sono stabili e vengono trasmesse invariate da una generazione all altra. ECCEZIONE: Mutazioni instabili dovute ad espansione di DNA ripetuto

Triplette trinucleotidiche in tandem sono abbastanza comuni nel nostro genoma Ci sono 10 possibili triplette: AAC/GTT AAG/CTT ACT/AGT AGG/CCT AAT/ATT ACT/GAT ACC/GGT CAG/CTG ACG/ CGT CCG/CGG Alcune triplette CAG/CTG e CCG/GGC mostrano un comportamento anomalo: al di sopra di una certa soglia diventano estremamente instabili in mitosi e meiosi

MUTAZIONI DA DNA INSTABILE..CGGCGGCGG..!.. CGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGG..!..CAGCAGCAG..!.. CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG..! AMPLIFICAZIONE DI TRIPLETTE DI DNA CHE AVVIENE DI GENERAZIONE IN GENERAZIONE NUOVO MECCANISMO DI MUTAZIONE E DI TRASMISSIONE GENETICA

MECCANISMO!

Ci dovremmo aspettare sia espansioni che riduzioni di triplette." " " C e una tendenza all espansione!"

Genetica delle malattie da triplette: Concetto di premutazione Instabilita somatica e germinale Anticipazione

Concetto di Premutazione Ripetute al limite superiore del normale, che di per se non causano la malattia, ma possono espandersi e diventare patogenetiche nella generazione successiva 22 29 82 29 80 22 83 22 90 ~500 >200 >200

Instabilita genetica normal: 5-37 premutation: 38-50 (minimal transition threshold: 35) very late onset: 42-180 adult onset: few - several hundreds congenital disease: greater than approx. 1000

Generic Pedigree of a Dominantly Inherited Due to CAG Repeat Instability

SCA1 INSTABILITA GERMINALE S. CHONG et al. 1995

Instabilita germinale

" Origine parentale della tripletta può " essere importante:" La trasmissione paterna ha un rischio aumentato di espansione nel caso delle malattie da poliglutamine (CAG codifica per glutamina): i casi piu gravi sono ereditati dal padre. Le grandi espansioni di triplette alla base della distrofia miotonica e della sindrome dell X fragile non vengono in genere trasmesse dal padre affetto: c è probabilmente una selezione a livello spermatico. Es. nella distrofia miotonica, madri lievemente affette possono avere figli con una gravissima forma di miopatia congenita"

Anticipazione = peggioramento della malattia da una generazione alla successiva Esempio nella distrofia miotonica: I I 1 = caratatta, a 50 anni insorge il il difetto muscolare II III II 2 = debolezza muscolare insorta nell adolescenza, cataratta, cardiomiopatia III 1 = neonato affetto da miotonia congenita ( insufficienza respiratoria ipotonia ecc.)

Zoghbi & Orr 1995 Relationship between the age of onset and the number of CAG repeats on the expanded alleles of individuals affected with SCA1.

PATHOGENIC EFFECT OF GLUTAMINE REPEATS Relationship between the age of onset and size of the CAG repeat in SCA1-3 An inverse correlation is observed between the size of expansion and age of onset The effect of expansion is different for each mutation

Qual e il meccanismo con cui l espansione da triplette causa la malattia?" 1. Perdita di funzione 2. Acquisizione di una nuova funzione" Posizione della tripletta nel gene

La tripletta espansa si trova nella regione codificante. Malattie di tipo I HD SCA1 DRPLA MJD 121 Affected Normal DRF 5 UTR Normal 3 UTR Affected SCA2 SBMA SCA6 Alleli normali tra 10-30, alleli espansi tra 40-200 Il tratto poliglutaminico conferisce una nuova, patologica funzione alla proteina

Type I Trinucleotide Disease REDDY & HOUSMAN 1997

STORIA George Huntington medico americano; nel 1872 a 22 anni, descrisse il ballo di San Vito if by chance these children go through life without it, the thread is broken and the children and grand-children of the original shakers may rest assured that they are free from the disease George Huntington

Corea di Huntington" " Malattia neurologica devastante dovuta alla degenerazione dei neuroni del corpo striato Autosomica dominante Eta di insorgenza intorno ai 40 anni Sintomi iniziali irritabilita, depressione; progredisce con gravi disturbi del movimento (corea) e demenza" "

COREA DI HUNTINGTON Autosomica dominante Anticipazione Origine paterna delle forme piu gravi

Numero CAG <28 Normale, non a rischio 29-34 Normale, ma la generazione successiva e a rischio 35-39 Alcuni sviluppano la malattia, la generazione successiva e a rischio >40 Sviluppano la malattia

Huntingtin" " " Espressa in tutti i neuroni" Q" Funzione normale: "regolazione della trascrizione" " " " "protezione dalla apoptosi" " Espansione poliglutamine: acquisizione di una nuova funzione tossica per la cellula, tendenza a formare aggregati nucleari"

FORMAZIONE DI AGGREGATI INTRANUCLEARI"

Caratteristiche comuni delle malattie da poliglutamine: Progressivo fenotipo neurologico dovuto a perdita di neuroni Sono tutte caratterizzate da un acquisizione di funzione della proteina dovuta al tratto poliglutaminico Espressione ubiquitaria, ma fenotipo selettivo Il contesto proteico media la selettiva vulnerabilita neuronale

La tripletta si trova in regioni non codificanti. Malattie di tipo II FRAXA FA MD Full mutation Pre/protomutation Normal 1997 Current Opinion in Cell Biology Exon Exon Exon Intron Intron 5 UTR 3 UTR Alleli normali tra 5-50 ripetute, alleli espansi hanno centinaia, o migliaia di copie. La ripetuta inibisce l espressione del gene, causando una perdita di funzione della proteina

Type II Trinucleotide Disease REDDY & HOUSMAN 1997

SINDROME DELL X FRAGILE E una delle forme piu comuni di ritardo mentale ereditario, e rappresenta il 15-20% dei ritardi mentali legati all X. Incidenza: 1/4000 maschi; 1/8000 femmine Si trasmette come tratto legato all X recessivo con penetranza ridotta (80% nei maschi, 30% nelle femmine)

Fragile X Cromosome Quando i linfociti in coltura vengono privati di folato si evidenziano i siti fragili

QUADRO CLINICO Ritardo mentale" Facies anormale con mandibola prominente e grosse orecchie" Macroorchidismo" Anomalie comportamentali (iperattivita autismo) nei maschi"

Fragile X Syndrome

Fragile X Syndrome

(CGGCGGCGGCGG) 20-50 5 ATG STOP 3 Gene FMR1 normale (CGGCGGCGGCGGCGGCGGCGG) 50-200 5 ATG STOP 3 Gene FMR1 premutazione (CGGCGGCGGCGGCGGCGGCGG) 200-1000 5 ATG STOP 3 Gene FMR1 pazienti

FMR1 FMR1 codifica per una proteina con un possibile ruolo nel trasportare mrna dal nucleo alla macchina traduzionale Piu del 99% delle mutazioni in FMR1 sono dovute all espansione di una sequenza ripetuta CGG nel 5 non codificante del gene

Quando il numero di triplette supera la soglia di 230 l estremita 5 del gene FMR1 diventa ipermetilata e si blocca la trascrizione

Cause di variabilita fenotipica Dimensione della ripetuta CGG (premutazione/ mutazione) Metilazione Mosaicismo somatico (instabilita della ripetuta): un maschio con mosaicismo somatico avra generalmente un ritardo mentale piu lieve rispetto ad un individuo con la stessa espansione in tutte le cellule.

X FRAGILE: LA genetica rivisitata Legata all X Necessaria una mutazione in due step per l espressione della malattia Non ci sono nuove mutazioni: tutti i maschi affetti hanno madri portatrici Alto rischio di trasformazione dalla premutazione alla mutazione nella linea germinale femminile Possibile trasmissione da parte di maschi normali: attraverso le figlie portatrici sani ai loro nipoti

La tendenza all espansione della CGG si verifica solo quando la premutazione e trasmessa dalla madre

Quando la premutazione e trasmessa dal padre rimane stabile quindi le figlie femmine ricevono la premutazione senza che ci sia espansione ed i figli maschi ricevono l Y e non sono a rischio di ereditare la premutazione

REGOLA ECCEZIONE LE MALATTIE MONOGENICHE SI TRASMETTONO SECONDO PATTERN BEN DEFINITI (AD, AR, XL) EREDITA MITOCONDRIALE Es. Neuropatia ottica di Leber ASSENZA DI RISCHIO DI RICORRENZA NELLE MUTAZIONI DE NOVO MOSAICISMO GERMINALE Es. Osteogenesis imperfecta PER UN LOCUS AUTOSOMICO IL FIGLIO EREDITA UN ALLELE DA CIASCUNO DEI DUE GENITORI DISOMIA UNIPARENTALE Es. PWS e AS ENTRAMBI GLI ALLELI DI UN LOCUS AUTOSOMICO SONO UGUALMENTE ESPRESSI IMPRINTING Es. Prader Willi /Angelman LE MUTAZIONI SONO STABILI MUTAZIONI IN STABILI X Fragile

LA TERAPIA GENICA

1-Definizione e principi 2-Strumenti (Vettori) 3-Strategie 4-Trials Clinici 5-Successi e fallimenti

Terapia Genica Trattamento di Malattie attraverso il Trasferimento e l Appropiata Espressione di una Informazione Genica Funzionale in una Cellula Bersaglio Terapia Genica trattamento di malattie attraverso il trasferimento di materiale genetico [DNA RNA]

Il Dogma: DNA DNA nucleus cytoplasm RNA mrna AAAA PROTEIN

Strategie Terapeutiche germinale non accettata su base Etico Scientifica

Strategie Terapeutiche Terapia Genica In Vivo Terapia Genica Ex Vivo

Strategie Terapeutiche Trasferimento genico in vivo Fibrosi Cistica - Tessuto Specifico - Gene Specifico Tumore Cerebrale - Cellula Specifico - Gene Esogeno Emofilia - Tessuto Aspecifico - Gene Specifico

1-Definizione e principi 2-Strumenti (Vettori) 3-Strategie 4-Trials Clinici 5-Successi e fallimenti

IDEALMENTE: Sistema di Trasferimento Genico Efficiente e Specifico Espressione Stabile, Costante/Modulabile Mancanza di Tossicita Non immunogeno Facilita di Produzione

Trasferimento Genico Metodi per Introdurre Acidi Nucleici in Cellule Vettore = Agente che Permette l Ingresso del Gene Terapeutico Vettori Virali Interazione con un Recettore della Cellula Bersaglio Vettori Non Virali Interazione Fisica con la Membrana Cellulare

Vettori Non Virali

Infezione (Virus) Trasduzione (Vettore)

I Virus Rappresentano Vettori Naturali Altamente Evoluti per il Trasferimento di Informazione Genica Estranea Ciclo Vitale del Virus Infezione / Replicazione

Conversione di un virus in un vettore: eliminazione dal genoma dei geni virali..

che vengono poi provvisti in trans nel processo di produzione del vettore

Trasferimento Genico Vettorologia: Sviluppo di Nuovi Agenti per il Trasferimento Genico Retrovirus Adenovirus Adeno-Associated virus

1-Definizione e principi 2-Strumenti (Vettori) 3-Strategie 4-Trials Clinici 5-Successi e fallimenti

Malattie Genetiche Recessive Dominanti Malattie Multifattoriali Cancro Malattie Cardiovascolari Diabete Malattie Infettive

Espressione del Gene Terapeutico Espressione Stabile MALATTIE GENETICHE Espressione Regolata DIABETE Espressione Transiente TUMORI

Le Mutazioni Possono Causare: MUTANT DNA MUTANT mrna AAAA MUTANT PROTEIN Perdita di Funzione Acquisizione di Funzione

Strategia per Perdite di Funzione Virus Ricombinante: Vettore DNA nucleus cytoplasm mrna AAAA PROTEIN

Strategia per l Acquisizione di Funzione RNAi AAAA control.rnai VEGF.RNAi Decreased CNV w/ RNAi vs. VEGF Reich et al, 2003 Mol Vis

1-Definizione e principi 2-Strumenti (Vettori) 3-Strategie 4-Trials Clinici 5-Successi e fallimenti

La Terapia Genica Rimane Confinata Alla Medicina Sperimentale Tuttavia

1-Definizione e principi 2-Strumenti (Vettori) 3-Strategie 4-Trials Clinici 5-Successi e fallimenti

Ragazzo di 18 anni affetto iniettato con 6x10e11 particelle/kg Segni di sofferenza mentale 18 ore dopo la somministrazione, Coagulazione intravascolare disseminata e morte 96 ore dopo polmone fegato milza midollo

Il pz, OTC19, mostra innalzamento patologico di alcune citochine pro-infiammatorie. Questo studio ha stabilito la dose letale di Adenovirus ed ha raffreddato l entusiasmo nei confronti della terapia genica.

Terapia genica ex vivo in 10 pazienti con deficit di ADA e Immunodeficienza Severa Combinata: a 8 anni di distanza dal primo paziente trattato nessun serio evento avverso e tutti I pazienti fanno una vita normale senza dover assumere ADA

Primo trial clinico di terapia genica per una malattia erditaria della retina. Risultati a breve termine mostrano sicurezza ed efficacia alla dose bassa del trattamento

In conclusione. Come in ogni altra terapia sperimentale esistono difficolta tecniche e rischi ma si intravedono anche i primi successi clinici!