Prof. Antonello Paparella

Transcript

1 METODI ALTERNATIVI PER LA RICERCA DEI MICROORGANISMI E PER LA VALUTAZIONE DELLA LORO VITALITA Prof. Antonello Paparella apaparella@unite.it

2 1 gennaio 2006 entra in vigore il Regolamento CE 2073/05 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari

3 I PRIMI EFFETTI Sensibilizzazione dei laboratori Osservanza delle procedure analitiche Sensibilizzazione dei produttori Osservanza dei criteri microbiologici

4 VOLONTA DI CONFORMARSI AI CRITERI Può spingere il produttore ad adottare pratiche di decontaminazione su m.p. e p.f. Anomala estensione della shelf-life life Danni subletali e falsi negativi Eventuali residui indesiderati

5 DECONTAMINAZIONE SUPERFICIALE DEI PRODOTTI ALIMENTARI Le soluzioni più frequenti: Acidi organici Etanolo Iperclorazione Radiazioni UV Vapore pressurizzato

6 UN CASO PARTICOLARE: DECONTAMINAZIONE DEI PRODOTTI IN INGRESSO NELLA CAMERA BIANCA

7 UNA LINEA DI DECONTAMINAZIONE SUPERFICIALE CON IPERCLORAZIONE DA UNA LINEA COME QUESTA, IN CONTATTO CONTINUO CON IPOCLORITO, E STATO ISOLATO

8 un ceppo di Listeria monocytogenes con particolari performance adesive

9 Pratiche di decontaminazione inefficaci Cicli di congelam./scongelam. ripetuti POTREBBERO GENERARE FALSE NEGATIVITA nell analisi microbiologica

10 per transizione delle cellule microbiche da uno stato coltivabile AD UNO STATO VITALE NON COLTIVABILE (VNC)

11 CELLULE VNC (VIABLE NOT CULTURABLE) Strategia di sopravvivenza in batteri non sporigeni. Dimostrata in Salmonella, Campylobacter, Escherichia, Vibrio, Streptococcus, Micrococcus ma anche in sporigeni come Bacillus subtilis. Riduzione volumetrica da forme coccobastoncellari a piccoli corpi sferici non dotati di involucri Escherichia coli O157:H7 (Zhao and Matthews, 2000)

12 LA CONDIZIONE VNC NON E L UNICA REAZIONE POSSIBILE ALLO STRESS CELLULARE STRESS NELLE CELLULE MICROBICHE esposizione a condizioni nutrizionali sfavorevoli, sostanze chimiche tossiche o condizioni fisiche subottimali (Neidhart e VanBogelen, 2000)

13 STATO FISIOLOGICO DELLE CELLULE ESPOSTE A STRESS

14 LE CELLULE MICROBICHE tra la vita e la morte VITALI assenza di stress crescita regolare e vitalità cellulare STRESSATE stress lieve DANNEGGIATE stress moderato crescita rallentata o bloccata ma cellule vitali crescita bloccata e diminuzione vitalità MORTE stress estremo inattivazione della maggior parte della popolazione ADATTATE ALLO STRESS stress superato risposte adattative con > tolleranza allo stress SUICIDATE stress lieve/moderato autolisi per > metabolismo futile

15 STRESS, ADATTAMENTO E SOPRAVVIVENZA AI PROCESSI DELL INDUSTRIA ALIMENTARE

16 DECONTAMINAZIONE E VNC Maggiore probabilità in caso di: Alimenti a shelf-life life estesa (ESL) Criteri microbiologici severi in esportazione Alimenti con elevate cariche superficiali Alimenti con SL bloccata dalla distribuzione

17 STRATEGIE ANALITICHE IN SITUAZIONI A RISCHIO DI DECONTAMINAZIONE E VNC

18 SE SI SOSPETTA UN FALSO NEGATIVO DA VNC Doppia procedura: arricchim.. + resuscitation Doppia semina: con/senza disattivante Ricerca modificazioni substrato (inibenti, ph) Metodi specifici per VNC

19 METODI PER LA STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE

20 Alla ricerca delle VNC Metodi per stimare la vitalità cellulare DEFT (Jakobsen et al 1984; Ruocco et al 1991) Riduzione del 2,3,5-Trifeniltetrazolio (Chang et al 1999) Colorazione CTC-DAPI (Cappelier et al 1997) Bioscreen/Turbidometria(Phillips et al 1998;Paparella et al 2003) CO 2 detection time in GC (Guerzoni et al 1985) Citometria di flusso (Petrova e Donnelly, 2004)

21 STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE NELLA BIOCONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI CON OLI ESSENZIALI

22 STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE RIDUZIONE DEL 2,3,5- TRIFENILTETRAZOLIO

23 Studio del danno da olio essenziale in L.monocytogenes con riduzione del 2,3,5- trifeniltetrazolio cloruro (Paparella( et al 2004) AGGIUNTA DI TTC AL TERRENO COLTURALE LIQUIDO: Riduzione del TTC (incolore, idrosolubile) formazano (rosso, insolubile) Valutazione quantitativa della vitalità cellulare (deidrogenasi) - usata in studi di fisiologia vegetale - Numerosi ceppi di L.monocytogenes sono stati esposti a diverse % olii essenziali. La Minimal Inhibitory Concentration (MIC) è stata valutata, in un primo screening, con TTC.

24 Studio del danno da olio essenziale in L.monocytogenes con riduzione del 2,3,5- trifeniltetrazolio cloruro (Paparella( et al 2004)

25 Paparella et al 2004

26 STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE CITOMETRIA DI FLUSSO

27 Doppia colorazione Secondo Ananta et al., 2004: Carbossifluoresceina diacetato (cfda) Attività esterasica Propidio ioduro (PI) Danno di membrana

28 Determinazione in citometria di flusso Coulter EPICS XL (BeckmanCoulter Inc.): FLOW RATE: events/sec events/samplesample FL1 CHANNEL (525 ± 20 nm): FUORESCENZA VERDE (cf) FL2 CHANNEL (620 ± 15 nm): FLUORESCENZA ROSSA (PI)

29 Gate delle cellule colorate con cf e PI (Ananta et al., 2004) Gate G1 G2 G3 G4 Fluorescenza delle cellule cf - and PI + cf + and PI + cf - and PI - cf + and PI - Possibile spiegazione del meccanismo cellulare coinvolto Attività esterasica non rilevabile, membrana compromessa Esterasi attiva,membrana danneggiata Attività esterasica non rilevabile, membrana intatta Esterasi attiva,membrana intatta apaparella@unite.it

30 Sottopopolazioni dopo doppia colorazione con cf e PI FL2 CHANNEL: PI GATE 1 INATTIVATE GATE 3 BASSA FLUORESCENZA GATE 2 DANNEGGIATE GATE 4 VITALI FL1 CHANNEL: cf apaparella@unite.it

31 STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE TURBIDOMETRIA/BIOSCREEN

32 4% NaCl O.D. (600 nm) Time (Hrs)

33 Effetto dell aggiunta di NaCl durante i trattamenti con differenti % OE Origano ATCC O.D. (600 nm) 0% NaCl Time (Hrs)

34 VALUTAZIONE DELLA PERMISSIVITA DEL SUBSTRATO

35 DECONTAMINAZIONE SUPERFICIALE DEI PRODOTTI A BASE DI CARNE MICROBIOLOGICAL CHALLENGE TEST E MODELLAZIONE DEI RISULTATI (L.monocytogenes)

36 PRODOTTI STUDIATI: Prodotti a base di carne: prosciutto crudo, coppa, lardo SCOPO: Decontaminazione superficiale in camera bianca (prima dell affettatura) OBIETTIVO MICROBICO: Diminuzione dell inoculo (L. monocytogenes ATCC19114)

37 CHALLENGE TEST: Cocktail di 5 ceppi di L. monocytogenes: ATTC ceppi isolati da prodotti a base di carne (1 x 10 5 UFC/cm 2 ) DISEGNO SPERIMENTALE (E MODELLAZIONE): Effetto interattivo di NaCl, acido lattico e % olio essenziale sulla diminuzione logaritmica dell inoculo

38 Effetto dell aggiunta di NaCl durante il trattamento con differenti % olio essenziale di origano, con (a) o senza (b) emulsionante (lecitina) Logarithmic decrease (LogMPN) = 7,07x[EO] - 1,353x[NaCl] - 0,785x[NaCl] 2-11,43x[Lactic Ac.] 2-22,26x[EO]x[Lactic Ac.] + 13,87x[NaCl]x[Lactic Ac.] Logarithmic decrease (LogMPN) = 5,58x[EO] - 3,29x[Lactic Ac.] - 2,33x[EO] 2-1,39x[EO]x[NaCl] +3,03x[NaCl]x[Lactic Ac.]

39 CONCLUSIONI NUOVE NORME PIU FLESSIBILI SEMPRE PIU FREQUENTE LA DECONTAMINAZIONE RISCHIO DI FALSI NEGATIVI NELL ANALISI MICROBIOLOGICA STRATEGIE E METODI GIA DISPONIBILI

40 Grazie per l attenzione! Prof. Antonello Paparella apaparella@unite.it