MATERIALI e METODI. Filip Pošćić

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1 MATERIALI e METDI Pag: (1) Estrazione DA 2 (2) Lettura al Fluorimetro per la determinazione della concentrazione del DA 3 (3) Soluzioni per l estrazione di DA, l elettroforesi e la PCR 5 (4) Verifica della qualità di DA su gel di agarosio 7 (5) Preparazione della PCR 8 (6) Preparazione dei campioni per sequenziamento 9 (7) Formule chimiche dei prodotti usati nei protocolli 10

2 (1) ESTRAZIE DA (DYLE & DYLE modificato) 1. Mettere in bagnetto a 65 C la falcon contenente la soluzione CTAB + βmercaptetal. La soluzione deve rimanere calda durante l uso percui avvolgere la falcon in alluminio prima di matterla in bagnetto. 2. La quantità di campione da utilizzare per singola estrazione è di 0,06 0,5g variabili a seconda dell efficienza di estrazione. 3. Prendere il campione vegetale, porlo dove va meglio a seconda del campione (Eppendorf da 2 ml, mortaio o altro) e tirarlo in AZT LIQUID. Pestellare con gli appositi pestelli. Pestellare violentemente! Deve rimanere una polvere finissima tipo talco. 4. Il tirato va messo in eppendorf da 2 ml, facendo attenzione a non lasciarlo scongelare, e ad esso ancora congelato si aggiungono 900 μl di CTAB a 65 C (è una quantità variabile a seconda di quanto campione in partenza io ho). 5. Mescolare. Si può mescolare con i pestelli oppure, dopo aver chiuso la eppendorf, a mano agitando fortemente. Per poi lavare i pestelli essi si risciacquano con abbondante acqua e poi vanno immersi in etanolo. 6. A bagnomaria fare avvenire la lisi a C per un tempo di circa 2 ore mettendo le eppendorf nell apposito floating rack e immergendo quest ultimo nel termostato. Mescolare ogni 5-10 minuti. I passaggi dal 3. al 6. sono critici. Bisogna lavorare veloci e sistemare campione per campione e non tutti insieme evitando così di lasciarli scongelare. Inoltre, aggiunto il CTAB e mescolato, trasferire subito in bagnomaria. 7. Togliere dal bagnomaria, mettere in ghiaccio per 5 minuti ed aggiungere CLRFRMI-ALCL ISAMILIC (sotto cappa aspirante!) nella stessa quantità del CTAB aggiunto in precedenza (900 μl). Attenzione: Il CLRFRMI-ALCL ISAMILIC ha una tensione superficiale molto bassa per cui tende ad uscire facilmente dal puntale sfasando così il volume nelle eppendorf. 8. Mescolare accuratamente: si può mescolare con la stessa pipetta con cui ho caricato oppure con un vortex oppure agitando fortemente con le mani. 9. Centrifugare con centrifuga Eppendorf a rpm per 7-8 minuti. 10. Prendere la fase acquosa con una pipetta e metterla in eppendorf da 2 ml. Stare attenti a non toccare con il puntale la fase alcolica contenente le proteine. (Tenere conto del volume prelevato!). Lavorare d ora in poi tenendo sempre le Eppendorf in ghiaccio. 11. Aggiungere SDI ACETAT (sotto cappa aspirante!) ad una concentrazione finale di 0,3 M. el nostro caso vanno bene 80 μl. 12. Aggiungere ISPRPAL FREDD nella quantità di circa 2/3 del volume contenuto nella Eppendorf fino a questo punto. el nostro caso vanno bene 590 μl. 13. Mescolare accuratamente. 14. Riporre in freezer a -80 C per 20 minuti circa. 15. Centrifugare con centrifuga Eppendorf a rpm per 20 minuti. 16. Togliere il surnatante versandolo in un beaker (il DA rimane attaccato alle pareti). 17. Lavare con ETAL 70% FREDD per 20 minuti utilizzando circa 500 μl 18. Togliere l etanolo completamente sfruttando ripetute e leggere centrifughe e asportazioni con pipetta. La prima centrifuga della serie si lascia andare per 8 minuti. 19. Mettere in stufa a 45 C con tappo aperto fino a completa evaporazione dell etanolo (circa 5-10 minuti). 20. Aggiungere 100 μl di TE1X (o H 2 ) e 1 μl di RA-asi (1mg/mL). 21. Mettere in stufa a 37 C per 1 ora colpettando ogni tanto l Eppendorf (ogni 15 minuti circa). 22. Fare uno spin alla centrifuga per far scendere tutte le goccie. Aggiungere 200 μl di TE1X (o H 2 ), 100 μl di AMMI ACETAT 10M e 1,2 ml di ETAL ASSLUT FREDD. 23. Mescolare e mettere a -80 C per circa 20 minuti. 24. Centrifugare con centrifuga Eppendorf a rpm per 20 minuti. 25. Eliminare il surnatante sfruttando ripetute e leggere centrifughe e asportazioni con pipetta. 26. Mettere in stufa a 45 C con tappo aperto fino a completa evaporazione. 27. Aggiungere 50 μl di acqua milli-q sterile. 28. Conservare a -80 C. 29. Leggere la concentrazione del DA al Fluorimetro. Pagina 2 di 11

3 (2) LETTURA AL FLURIMETR PER LA DETERMIAZIE DELLA CCETRAZIE DEL DA MEDIATE PICGREE E FLURIMETR PerkinElmer Wallak VICTR 2 1. Bisogna predisporre del PicoGreen dsda Quantitation Kit assays. Il kit include: - soluzione madre di PicoGreen 200X, - soluzione madre di DA λ; - soluzione TE 20X. 2. Si prepara ora la curva di taratura con DA λ a concentrazione nota. Vengono qui riportate le quantità per una sola sessione di lettura. TE 1X (1400 L) (si preparino più eppendorf con questa soluzione perchè se ne farà uso): 1330 L H 2 milli-q sterile 70 L TE 20X Soluzione DA standard #1 (75 L) (una eppendorf): 73.5 L TE 1X 1.5 L Soluzione madre di DA λ Soluzione DA standard #2 (140 L) (una eppendorf): L TE 1X 3.5 L Soluzione DA standard #1 Si preparino ora le vere soluzioni usate per la misurazione. Di seguito sono riportate le quantità in L da aggiungere per ognuna delle nove eppendorf: Epp. Concentrazione Soluzione DA Soluzione DA TE 1X finale DA* standard #1 standard # ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml * La concentrazione finale viene raggiunta dopo l'aggiunta di Picogreen immediatamente prima della misurazione. 3. Si preparano ora le soluzioni di DA standard e dei campioni per la quantificazione: Soluzione Picogreen 1X: 79.6 L TE 1X 0.4 L Picogreen 200X Questa soluzione deve essere preparata per un numero di campioni uguale a: - 8 (soluzioni di DA standard) + n soluzioni di DA da quantificare. Si ricordi di fare duplice copia per ogni campione (per motivi di controllo) e di pipettare bene. Preparazione di ciascun campione da quantificare: 78.4 L TE 1X Pagina 3 di 11

4 1.6 L Soluzione di DA da quantificare (eventualmente già diluita) Prima della misurazione si dovrebbero avere a disposizione: - 8 soluzioni di DA standard (ciascuna di 80 L); - n soluzioni di DA da quantificare (ciascuna di 80 L); n soluzioni di Picogreen 1X (ciascuna di 80 L). 4. Aggiungere 80 L di Picogreen 1X a ciascuna soluzione e trasferire tutto (160 L) nell'aposita piastra nera da 96 campioni del VICTR 2 In alternativa si poteva caricare tutto direttamente nella piastra nera. Preparazione del VICTR 2 e analisi dati: 1. Accendere il VICTR 2 (interruttore sul retro della macchina a destra) 2. Accendere il computer 3. Avviare il software WALLAC 1420 manager a meno che non venga avviato autimaticamente 4. Cliccare sul pulsante «DEFIE PLATE MAP.» 5. Seguire le istruzioni scegliendo come protocollo «picogree (485nm/535 nm, 1.0s)», indicando i pozzetti della piastra nella quale effettuare la misura e inserendo eventuali note che verranno associate ai risultati finali. Prima di cliccare su FIISH, inserire la pistra nell'apposito alloggiamento del VICTR 2. Cliccando su FIISH si avvia il processo di misurazione. 6. Si possono osservare i dati raccolti in tempo reale durante il processo scegliendo l'opzione «Live dispay» sulla finestra principale del software 7. Alla fine del processo si possono osservare i risultati cliccando sul menu «Tool» e scegliendo l'opzione «Results of latest assay run». Si apre un dana sheet con i valori di fluorescenza associati ad ogni pozzetto 8. Esportare il dana sheet (menu «File», opzione «export»). Scegliere un nome per il file del tipo nomefile.xls 9. Avviare il software excel. el menu file scegliere l'opzione «apri» e selezionare il file salvato al punto Copiare i valori di fluorescenza corrispondenti alle 8 soluzioni standard in un nuovo foglio excel. In una colonna adiancente inserire i dati delle concentrazioni corrispondenti (500, 250, 100, 25, 10, 2.5, 1,0) 11. Selezionare le due serie di dati (concentrazioni, fluorescenza), cliccare sul menu «Strumenti», scegliere l'opzione «analisi dati» e selezionare «regressione». Si apre una finestra in cui si immettono (selezionandole con il mouse sulla finestra principale di excel) le celle della serie Y (fluoscerenza) e le cella della serie X (concentrazioni). Come opzione di utput scegliere «nuovo foglio di lavoro». Dare K 12. Sul nuovo foglio di lavoro Excel vengono quindi riportati i dati della regressione tra cui il coefficente angolare a e l'intercetta all'origine b della retta di regressione 13. Le concentrazioni delle soluzioni da quantificare si calcolano usando la formula concentrazione = [(fluorescenza b)/a]* Salvare il file di excel cliccando sul menu «file opzione salva con nome» 15. Spegnere il VICTR 2 e gettare la piastra nei rifiuti solidi contaminati da etidio e altri mutageni. Pagina 4 di 11

5 (3) SLUZII PER L ESTRAZIE DI DA, L ELETTRFRESI E LA PCR Per l estrazione di DA: 1. CTAB + MERCAPTETAL per singolo campione: Soluzione di CTAB + 0,2% di MERCAPTETAL; el nostro caso: 1000 μl di CTAB + 2 μl di MERCAPTETAL per campione. 2. CTAB per 100 ml: 2 gr CTAB; 10 ml TRIS 1 M ph = 8,0 ; 4 ml EDTA 0,5 M ph = 8,0; 8,18 gr acl; Portare a volume di 100 ml con H 2 milli-q sterile; Filtrare con filtro da 0,2 μm. 3. TRIS 1 M ph = 8,0 per 100 ml: Pesare 12,11 g di TRIS e scogliere in 100 ml di H 2 milli-q sterile; Portare a ph = 8,0 con HCl. 4. EDTA 0,5 M ph = 8,0 per 200 ml: Pesare 37,22 g di EDTA e scogliere in 200 ml di H 2 milli-q sterile; Portare a ph = 8,0 con HCl. 5. CLRFRMI-ALCL ISAMILIC (Rapporto 24:1) per 250 ml: 240 ml CLRFRMI; 10 ml ALCL ISAMILIC. 6. SDI ACETAT 3 M ph = 5,2 per 100 ml: Pesare 24,61 g di SDI ACETAT e sciogliere in 80 ml H 2 milli-q sterile; Scaldare; Portare a ph = 5,2 con ACID ACETIC GLACIALE; Portare a volume 100 ml con H 2 milli-q sterile; Autoclavare. 7. ISPRPAL FREDD 8. ETAL ASSLUT FREDD 9. ETAL 70% per 200 ml: 140 ml ETAL ASSLUT; 60 ml H 2 milli-q sterile; Mettere in bottiglia autoclavata. 10. TE1X per 200 ml: 10 mm TRIS (prelevare 2 ml TRIS da una soluzione 1M); 1 mm EDTA (prelevare 0,4 ml EDTA da una soluzione 0,5 M); Portare a volume finale di 200 ml con H 2 milli-q sterile. 11. AMMI ACETAT 10 M per 100 ml: Pesare 77,08 g H 4 ACETAT e sciogliere in 80 ml di H 2 milli-q sterile; Portare a ph = 7,7 con ACID ACETIC GLACIALE (glaciale sta a indicare che l acido è puro al 99,98%); Portare a volume 100 ml con H 2 milli-q sterile; Filtrare con filtro 0,45 μm. Pagina 5 di 11

6 Per l elettroforesi: 12. TBE1X per 1 L: 13. TBE10X per 500 ml: 14. MARKER per 1 ml: Porre in un cilindro da 1 litro 100 ml di TBE10X; Portare a volume con acqua milli-ro. 54 g TRIS BASE; 27,5 g ACID BRIC; 20 ml EDTA 0,5 M ph = 8,0; Portare a 500 ml con acqua milli-q sterile; Porre in un recipiente sterile; La bottiglia vuota va lavata accuratamente con acido acetico sotto cappa e poi sciaquata con acqua milli-ro prima dell uso. 200 μl Leader 1Kb; 200 μl addensante (BBF); 600 μl TE1X o H 2 milli-q. Per la PCR: 15. MIX dtp (2,5 mm) per 400 L: 10 L 100 mm A 10 L 100 mm T 10 L 100 mm C 10 L 100 mm G 360 L H 2 milli-q sterile fresca 400 L. 16. Preparazione primer nuovi liofilizzati: Quando si ricevono primer nuovi liofilizzati, senza aprirli, fare una veloce spinata in centrifuga e poi scoglierli con H 2 milli-q sterile per avere una concentrazione finale di 100 M. 17. Primer MIX (FR + REV) per PCR (10 M) di 200 L: 100 M (la concentrazione nella provetta acquistata) 10 M (il MIX FR + REV) 100 M X L = 10 M 200 L X = 20 L e allora: 20 L di primer FR; 20 L di primer FR; 160 L di H2 milli-q sterile; 200 L totali. Pagina 6 di 11

7 (4) VERIFICA DELLA QUALITÀ DI DA SU GEL DI AGARSI 1. Attenzione usare doppi guanti. Guanti bianchi e sopra quelli azzurri! 2. Accendere un piccolo bagno termostatato e impostare la temperatura a 56 C; 3. Aggiungere nastro adesivo ai lati scoperti del gel-supporto ricordandosi di lasciare una linguetta per poter successivamente strappare con facilità via il nastro adesivo; 4. Sistemare il pettine con le viti verso l esterno del gel-supporto in modo che vi siano 2-3 mm di luce tra aghi del pettine e fondo del supporto; 5. Preparare 40 ml (gel a 8 corsie) o 75 ml (gel a corsie) o 200 ml (gel maxi) di TBE1X; 6. Aggiungere agarosio ad una concentrazione dello 0,8%. Pesare 320 mg per gel a 8 corsie; 600 mg per gel a corsie; 1,6 g per gel maxi; 7. Versare l agar pesato in TBE1X e scaldare in microonde fino a bollitura. Si ricorda che mentre la bottiglia è nel microonde il tappo deve essere svitato; 8. Agitare fino a completo dissolvimento; 9. Mettere a bagno a 56 C, agitando ogni tanto; Questo passaggio si può saltare e raffreddare la soluzione manualmente sotto acqua corrente fredda. Attenzione che l acqua non entri nel contenitore. gni tanto sfiatare un pò il contenitore. on far raffreddare troppo altrimenti la soluzione gelifica nel contenitore; 10. Aggiungere ETIDI BRMUR (Et) alla miscela agarosio-tbe1x in modo da ottenere una concentrazione finale di 0,5 μg/ml di gel. Utilizzando una soluzione madre avente una concentrazione di 10 mg/ml, prelevo 2 μl per un gel da 8 corsie-40 ml; prelevo 3,75 μl per un gel da corsie-75 ml; prelevo 10 μl per un gel maxi-200 ml); 11. Mescolare piano senza fare bolle e versare in gel-supporto; 12. Portare le eventuali bollicine agli angoli del supporto con una spatola; prestare particolare cura alle zone prossime al pettine e dunque ai futuri pozzetti. Per evitare di fare bolle versare la soluzione quando è ancora calda; 13. Lavare il recipiente utilizzato prima che gelifichino i residui. La prima acqua con la quale si sciacqua il recipiente deve essere versata in apposito contenitore per acque con Et. 14. Attendere minuti prima di rimuovere il pettine. Il pettine si rimuove tenendo fermo il gel-supporto con i pollici e sollevando con indice e medio il pettine con lento movimento verticale; 15. Togliere il nastro adesivo stando attenti affinché il gel non scivoli via o si danneggi; 16. Sistemare il gel-supporto nella cella e versare TBE1X fino a che il livello non superi di 1-2 mm il gel; 17. Togliere i guanti azzurri e lasciarli sul banco di lavoro riservato per l Et. Buttare i guanti bianchi in apposito contenitore; Lavarsi le mani con acqua e sapone; 18. Prendere un pezzo adeguatamente grande di parafilm sul quale si poggerà per ogni campione 1 μl di addensante (blu di bromofenolo BBF); 19. Aggiungere ora sopra ogni goccia di BBF 5 μl di campione di DA pipettando e cambiando ogni volta puntale prima di prelevare il successivo campione; ei passaggi 18. e 19. lavorare velocemente perché il BBF si secca all aria; 20. Portato il parafilm con i campioni sopra il banco di lavoro riservato per l Et. Indossare nuovamente doppi guanti. 21. Riprendere più volte con il puntale il campione e caricarlo nel pozzetto senza creare bolle e senza inserirsi in profondità con il puntale; 22. Chiudere la cella ed avviare l elettroforesi a 75 V (in teoria 5-10 V per cm, i nostri gel sono solitamente lunghi 10 cm); quando l addensante ha percorso il 60% della lunghezza del gel, il gel può essere prelevato, osservato al transilluminatore a UV e/o fotografato. Il gel deve essere poi scaricato nel contenitore dei rifiuti tossici; il tampone TBE1X può essere riciclato o raccolto in tanica se presenta una colorazione azzurrina. La cella e il gel-supporto devono essere lavati con H 2 e risciacquati con H 2 milli-ro. MII SUB CELL (8 pozzetti): La procedura è sempre la stessa, ma: 1. Agarosio (0,8%) 0,28 g in 35 ml di TBE1X; 2. A 56 C aggiungere 1,75 μl di Etidio omuro; 3. Per ogni pozzetto vanno 15 μl totali composti da: 1/5 addensante (3μL); Volume di DA desiderato; Differenza in H 2 milli-q sterile a 15 μl. PS. Se si usa la nuova metodica senza Et le procedure rimangono le stesse solo che invece dell Et si mette il nuovo colorante fluorescente che non è cancerogeno. on si deve quindi lavorare su bancali inquinati da Et. Pagina 7 di 11

8 (5) PCR 1. Si prepari la tabella riportante il PCR plate: A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 2. Immettere 1 μl di DA campione (tamplate) nei pozzetti scelti e farlo in modo che la goccia tocchi il fondo del pozzetto. Controllare se tutti i pozzetti prescelti sono stati riempiti. Tenere conto del numero di campioni (n). 3. Si prepari il MIX con tutti i reagenti necessari per la PCR: PCR μl ٠ (n+1) Tamplate 1 /// Buffer 2,5 MgCl 2 1 dtp 2 Primers 4 DMS 1,25 H 2 12,95 Taq. pol. 0,3 TTALE 25 μl μl Buffer: 10X PCR Buffer (contiene già 15 mm MgCl 2 ) della Roche; MgCl 2 : 25 mm della Roche; dtp: 2,5 mm; Primers: mix 10 M di FR e REV; Taq. pol: della Roche. Il mix va preparato moltiplicando i singoli componenti del mix per n+1. Attenzione: la Taq polimerasi va messa all ultimo e subito dopo l uso rimessa in congelatore a 20 C. 4. In ogni pozzetto vanno immessi 24 μl del mix. 5. Coprire con i tappi o coperchio adatto e con un movimento veloce della mano far scendere tutte le goccie in fondo ai pozzetti. 6. Riporre nella macchina da PCR e avviare il programma prescelto. Per scegliere la T m solitamente si usa il valore di T a diminuito di 4 C. 7. Per Zea mays solitamente si usa un ciclo Touch down: 7 cicli 31 cicli Temperatura ( C) Tempo (mm:ss) 5:00 0:45 0:45 1:15 0:45 0:45 1:15 7:00 * 8. Controllare se c è dell amplificato su elettroforesi. In caso positivo procedere alla fase della purificazione e del sequenziamento. Pagina 8 di 11

9 (6) PREPARAZIE DEI CAMPII PER SEQUEZIAMET Purificazione: 1. Portare a volume 100 L con H 2 milli-q sterile ogni pozzetto contenente il campione che si desidera sequenziare. (Dato che in ogni pozzetto originariamente c'erano 25 L e 5 L sono stati successivamente tolti per fare la corsa elettroforetica, si devono aggiungere 80 L); 2. Trasferire i campioni mediante pipetta singola o multipla in piastra da purificazione; 3. Riporre la piastra da purificazione su macchina da aspirazione a -22 mmhg e lasciarla sotto aspirazione per 10 minuti (controllare con il timer); 4. Sbattere la piastra da purificazione su carta per togliere i residui; 5. Aggiungere 50 L di H 2 milli-q sterile ad ogni pozzetto contenente il campione; 6. Riporre la piastra da purificazione su minishaker e impostarla su microtitter per 5 minuti (controllare con il timer); 7. Trasferire tutti i campioni purificati in piastra (PCR PLATE STRY) per la conservazione dei campioni a - 20 C. Tenere uno schema della piastra per indicare la posizione dei campioni; 8. Contrassegnare i pozzetti non usati della piastra da purificazione per un loro successivo uso. Sequenziamento: 1. Preparare uno schema dei campioni ove indicare di che campione si tratta, cosa si sequenzia e il primer usato (FR o REV) è il file sample sheet; 2. Diluire i primers a 2 M. A tale scopo preparare due provettine: una per primer FR e l'altra per il primer REV. Prelevare 4 L dalla soluzione 100 M di primer e aggiungere 196 L di H 2 milli-q sterile per avere una soluzione di 200 L (se ne fa tanto per una riserva)(100 M x L = 2 M 200 L x = 4 L); 3. In ciascun pozzetto immettere 1,6 L del relativo primer; 4. Prelevare dalla piastra PCR PLATE STRY 5 L di ogni campione e immetterli nella piastra da sequenziamento; 5. Prelevare 3,4 L della MIX per ogni pozzetto; 6. MIX per sequenziamento: reagente 1X 450X H 2 1,3 L 585 L Buffer 5X 1,9 L 855 L Big Dye 0,2 L 90 L 3,4 L 1530 L ; 7. Chiudere tutto in alluminio e riporre in ghiaccio; 8. Eseguire la PCR di sequenza; 9. Purificare la miscela di sequenza (tutto al buio!): 10. Spinnare il plate; 11. Aggiungere 2,5 L di EDTA 125 mm; 12. Aggiungere 25 L di Et 100%; 13. Sigillare per bene con nastro adesivo d alluminio e mescolare per inversione 4-6 volte; 14. Incubare per 15 m a temperatura ambiente (nel frattempo preparare gli eventuali bilancini); 15. Centrifugare a 2900 RCF (g) per 55 m a 10 C; 16. Togliere il nastro adesivo d alluminio e capovolgere la piastra su carta assorbente dando dei leggeri colpetti; 17. Centrifugare la piastra capovolta su carta assorbente a 190 RCF (g) per 2 m; 18. Lasciare evaporare l Et per 15 m; 19. Conservare a 4 C oppure proseguire: 20. Aggiungere 8 L di formamide; 21. Applicare il tappo septa alla piastra; 22. Denaturare a 95 C per 2 m senza chiudere il coperchio del termociclatore; 23. Mettere in ghiaccio e tenendo al buio portare al sequenziatore assieme al file sample sheet in chiavetta USB. Pagina 9 di 11

10 (7) FRMULE CHIMICHE DEI PRDTTI USATI EI PRTCLLI Cl CH 3 H Cl Cl + CH 3 (CH 2 ) CH X 3 CH 3 Cloroformio CTAB = omuro di cetiltrimetilammonio CH 3 CH CH 3 Isopropanolo HS Mercaptoetanolo H B CH 3 CH 2 Etanolo Acido Borico H C H 3 Acido acetico H H 2 TRIS = tris (idrossimetil) amino metano H 3 C a + H 3 C H 4 + Sodio acetato e Ammonio acetato Pagina 10 di 11

11 H 2 H 2 + CH 3 Etidio omuro (Et) S Blu di bromofenolo (BBF) EDTA e il relativo processo chelante. EDTA = acido etilendiamminicotetracetico H 3 C H Il colorante HECHST Pagina 11 di 11