Università degli Studi di Napoli Federico II Master II livello - REACH. Standard di qualità applicabili ai dati analitici e ai laboratori di prova

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1 Università degli Studi di Napoli Federico II Master II livello - REACH Standard di qualità applicabili ai dati analitici e ai laboratori di prova Sergio Fasan sergio.fasan@fastwebnet.it

2 PROGRAMMA 1. REACH e metodi di prova 2. Standard di Qualità richiesti per i Laboratori di Prova (cenni su GLP & UNI EN ISO/IEC 17025) 3. Parametri di performance dei metodi analitici e strategie di convalida 4. Esercitazione teorica (questionario)

3 REACH e metodi di prova

4 REACH E METODI DI PROVA Articolo 13(3) Quando per acquisire informazioni sulle proprietà intrinseche delle sostanze sono necessari test, questi sono eseguiti secondo i metodi specificati nel regolamento della Commissione ( 1 ) o, se del caso, secondo altri metodi internazionali riconosciuti dalla Commissione o dall'agenzia. Articolo 13(4) I test e le analisi ecotossicologiche e tossicologiche sono eseguiti nel rispetto dei principi delle buone pratiche di laboratorio, enunciati nella direttiva 2004/10/CE, o di altre norme internazionali riconosciute equivalenti dalla Commissione o dall'agenzia, e delle disposizioni della direttiva 86/609/CEE, ove applicabile. ( 1 ) I metodi di prova finalizzati alla detmn delle proprietà intrinseche (chimico-fisiche) delle sostanze sono pubblicati nell Allegato I del Reg. 440/2008/CE applicabile a partire dal 1 giugno 2008 (ex Allegato V della Dir. 67/548/CE)

5 CONDIZIONI PER L USO L DI DATI ESISTENTI Allegato XI Sez. 1.1 Dati sulle proprietà fisico-chimiche risultanti da esperimenti non effettuati secondo la buona pratica di laboratorio o i metodi di prova di cui all'articolo 13, paragrafo 3 Questi dati sono considerati equivalenti ai dati risultanti dai metodi di prova corrispondenti di cui all'articolo 13, paragrafo 3, se sono soddisfatte le seguenti condizioni: 1) i dati sono idonei ai fini della classificazione e dell'etichettatura e/o della valutazione dei rischi; 2) è fornita una documentazione sufficiente per valutare l'adeguatezza dello studio; e 3) i dati sono validi per la rilevazione dell'«end point» e lo studio è effettuato con un livello accettabile di assicurazione della qualità.

6 VALUTAZIONE DELLA QUALITA DEI DATI DISPONIBILI Un prerequisito per la valutazione degli studi esistenti è stabilire la loro qualità scientifica. In conformità alla guida OECD, il processo di determinazione della qualità dei dati esistenti deve prendere in considerazione i seguenti 3 aspetti: 1) Affidabilità (reliability): qualità intrinseca di un certificato di analisi o di una pubblicazione preferibilmente riferibili ad una metodologia standardizzata e modalità in cui sono descritti la procedura sperimentale e i risultati al fine di garantire la chiarezza e la plausibilità dei risultati 2) Pertinenza (relevance): appropriatezza dei dati e dei test ai fini dell identificazione di un particolare pericolo o della caratterizzazione di un rischio 3) Adeguatezza (adequacy): utilità dei dati ai fini della caratterizzazione del pericolo e/o del rischio Quando vi sono più studi per un determinato punto finale, il peso maggiore è attribuito solitamente allo studio più affidabile e più pertinente. Rif.: Guidance on Data Sharing

7 VARIABILITA DELLA QUALITA DEI DATI DISPONIBILI Vi sono diverse ragioni per cui i dati di studi esistenti possono avere una qualità variabile. Klimisch et al., 1997, hanno suggerito quanto segue: l uso di linee guida sperimentali diverse (rispetto agli standard attuali); l incapacità di caratterizzare in modo appropriato la sostanza testata (in termini di purezza, caratteristiche fisiche, ecc.); l uso di tecniche/procedure rudimentali, che sono state successivamente affinate; il fatto che determinate informazioni non siano state registrate (o talvolta persino misurate) per un certo endpoint, ma che siano state riconosciute in seguito come importanti. L affidabilità dei dati è quindi una considerazione iniziale chiave necessaria per eliminare gli studi inaffidabili prima di valutarne la pertinenza e adeguatezza.

8 AFFIDABILITA DEI DATI: APPROCCI POSSIBILI L OECD ha proposto 2 approcci per assistere l analisi iniziale dei rapporti di studio allo scopo di eliminare i dati degli studi inaffidabili. 1) KLIMISCH SCORING SYSTEM (1977) 2) Criteri US EPA (1998, High Production Volume Challenge Program) Permettono di avere un quadro chiaro dell affidabilità di ogni studio tramite l assegnazione di un punteggio. Possono essere utilizzati sia separatamente sia insieme.

9 KLIMISCH SCORING SYSTEM 1 = affidabile senza restrizioni: studi/dati generati secondo linee guida universalmente valide e/o accettate a livello internazionale (es. test eseguiti in conformità alle BPL/GLP) o in cui i parametri documentati sono basati su specifiche metodologie (a livello perlomeno nazionale) o in cui tutti i parametri descritti sono strettamente correlati/paragonabili a una linea guida esempi: prove accreditate o meno eseguite secondo metodi ufficiali in conformità alla UNI CEI EN ISO/IEC = affidabile con restrizioni: studi/dati (spesso non generati in conformità alle BPL/GLP) in cui i parametri documentati non sono completamente conformi ad una specifica linea guida, ma sono sufficienti per accettare i dati o in cui le ricerche descritte non possono essere condotte seguendo una specifica linea guida ma risultano tuttavia ben documentate e scientificamente accettabili esempi: dati verificati da esperti ( peer reviewed ) provenienti da fonti secondarie come handbook (es. Merck Index), database (es.iupac) o prove eseguite secondo metodi interni validati in conformità alla UNI CEI EN ISO/IEC 17025, ecc.)

10 KLIMISCH SCORING SYSTEM 3 = non affidabile: studi/dati dove sono presenti interferenze tra il sistema di misura e la sostanza in esame o in cui sono stati usati organismi/sistemi di sperimentazione non pertinenti in relazione al tipo di esposizione o che sono stati generati secondo metodi non accettabili, che presentano una documentazione non sufficiente per la valutazione e non convincente secondo il giudizio di un esperto esempi: test interni effettuati secondo metodi sviluppati in-house e non validati o per i quali non è garantita una tracciabilità completa dei dati 4 = non assegnabile: studi/dati che non presentano dettagli sperimentali sufficienti esempi: dati riportati in abstract, pubblicazioni secondarie come libri, riviste, SDS, ecc.

11 CRITERI US EPA CRITERI CHIAVE ENDPOINTS Forniscono un maggior numero di informazioni rispetto al sistema Klimisch, si basano sull individuazione di criteri chiave per ogni gruppo di dati attraverso i quali si giudica l integrità, la validità e quindi l affidabilità di uno studio NB: sono criteri compatibili con l approccio Klimisch: agli studi che NON soddisfano i criteri chiave EPA viene attribuito un punteggio 4 (non assegnabile) secondo il sistema Klimisch 1. Per i valori di tensione di vapore, coefficiente di partizione ottanolo/acqua e solubilità in acqua. 2. Tutti gli studi devono avere controlli negativi e alcuni studi (ad es. biodegradazione, test su Salmonella/di Ames) devono avere anche controlli positivi. Se per la somministrazione del prodotto testato viene usato un mezzo, bisogna stabilire e riportare i controlli sul mezzo. Sono permesse eccezioni per gli studi di tossicità acuta sui mammiferi. 3. Deve essere riportato il tipo/via di esposizione (ad es. inalazione orale ecc. per gli studi sui mammiferi) o il sistema di analisi (statica, di flusso, ecc. per l ecotossicità).

12 Standard di Qualità richiesti per i Laboratori di Prova (GLP - ISO/IEC 17025)

13 BPL RIFERIMENTI NORMATIVI D.Lgs. 50/2007 (Attuazione delle Dir. 2004/9/CE e 2004/10/CE) OECD Series on Principles of GLP and Compliance Monitoring - No1 OECD Principles on Good Laboratory Practice ENV/MC/CHEM(98)17 In Italia la BPL è di competenza del Ministero della Salute, presso cui è stata istituita, con decreto del Ministro della Salute 10 agosto 1997, l'unità di monitoraggio per la BPL L elenco dei Centri di Saggio autorizzati dal Ministero della Sanità è consultabile al sito: La certificazione ha una validità di 2 anni a partire dalla data di rilascio

14 CERTIFICAZIONE BPL CHELAB

15 BPL DEFINIZIONI Buona Pratica di Laboratorio: sistema di qualità che riguarda i processi organizzativi e le condizioni sotto le quali gli studi sono pianificati, eseguiti, controllati, registrati, riportati ed archiviati Centro di Saggio: l'insieme di persone, locali e unità operative necessarie per l'esecuzione di uno studio non clinico sulla sicurezza per la salute umana e l'ambiente

16 Agenda Obiettivi del training Campo di applicazione GLP Scopo GLP I principi di GLP Studi a breve termine Differenze GLP e ISO 17025

17 Campo di applicazione delle GLP (1 di 4) DIRETTIVA 2004/10/EC Articolo 1 1. Gli Stati membri adottano tutte le misure necessarie per assicurare che i laboratori che effettuano prove sui prodotti chimici, conformemente alla direttiva 67/548/CEE, soddisfino ai principi di buona pratica di laboratorio (BPL) 2. Il paragrafo 1 è parimenti applicabile quando altre disposizioni comunitarie prevedano l'applicazione dei principi di BPL per le prove su prodotti chimici al fine di valutare la sicurezza per l'uomo e/o l'ambiente.

18 Campo di applicazione delle GLP (2 di 4) DIRETTIVA 2004/10/EC Allegato 1 - Sezione I Introduzione - 1. Campo d'applicazione I principi di buona pratica di laboratorio devono essere applicati alle sperimentazioni non cliniche destinate ad appurare la sicurezza delle sostanze contenute in prodotti farmaceutici, antiparassitari, prodotti cosmetici, medicinali ad uso veterinario, additivi alimentari, additivi per mangimi e prodotti chimici industriali. scopo dei saggi è ottenere dati sulla loro proprietà e/o sulla loro sicurezza per la salute umana e/o l'ambiente. Salvo specifiche deroghe disciplinate da disposizioni nazionali, i principi di BPL si applicano a tutti gli studi non clinici sulla sicurezza per la salute umana e per l'ambiente resi obbligatori dalla normativa in materia di registrazione e licenze di prodotti farmaceutici, antiparassitari, additivi per mangimi ed alimenti, prodotti cosmetici, medicinali ad uso veterinario e prodotti analoghi e da quella sui prodotti chimici.

19 Campo di applicazione delle GLP (3 di 4) FDA 21cfr Scope. (a) This part prescribes good laboratory practices for conducting nonclinical laboratory studies that support or are intended to support applications for research or marketing permits for products regulated by the Food and Drug Administration, including food and color additives, animal food additives, human and animal drugs, medical devices for human use, biological products, and electronic products.

20 Campo di applicazione delle GLP (4 di 4) EPA 40 CFR Part 160 Federal Insecticide, Fungicide and Rodenticide Act (FIFRA): GLP Standards Scope. (a) This part prescribes good laboratory practices for conducting studies that support or are intended to support applications for research or marketing permits for pesticide products regulated by the EPA. EPA 40 CFR Part 792 Toxic Substances Control Act (TSCA): GLP Standards Scope. (a) This part prescribes good laboratory practices for conducting studies relating to health effects, environmental effects, and chemical fate testing.

21 Conclusione 1 La BPL si applica agli studi regolatori Uno studio che andrà a far parte di un dossier da fornire all Autorità Regolatoria competente per la notifica, l autorizzazione, o la registrazione di.farmaci, prodotti chimici, prodotti fitosanitari, biologici.

22 Quindi NON si applica a Controllo qualità Ricerca Studi su base volontaria senza giustificazione regolatoria

23 BPL SCOPI GENERALI Promuovere la qualità e validità dei dati sperimentali Promuovere il mutuo riconoscimento degli studi a livello internazionale Aiutare i ricercatori ad ottenere risultati: affidabili ripetibili verificabili riconosciuti a livello internazionale

24 BPL SCOPI GENERALI Non si propone di stabilire la validità scientifica intrinseca di uno studio Proporre un set di requisiti procedurali che definiscono le condizioni nelle quali gli studi sono: Pianificati Condotti Registrati Archiviati Monitorati

25 Conclusione 2 Scopo della BPL Lo scopo della BPL è assicurare la qualità, l integrità e la rintracciabilità degli studi non clinici di sicurezza, da sottoporre alle autorità regolatorie

26 BUONA PRATICA DI LABORATORIO CENNI STORICI I principi di Buona Pratica di Laboratorio (BPL) o Good Laboratory Practices (GLP) sono entrati a far parte del panorama regolatorio nell ultima parte degli anni 70 dopo che molti studi commissionati da compagnie farmaceutiche americane a centri di ricerca specializzati si dimostrarono del tutto inattendibili a seguito di accertamenti dell FDA Date chiave: 1978: Norme BPL US FDA 1980: Norme BPL US EPA 1981: Linee Guida BPL OECD 1986: Direttiva Europea sulle BPL

27 Organisation for Economic Co-operation operation and Development OECD: Paesi membri (34) Australia, Austria, Belgium, Canada, Chile, Czech Republic, Denmark, Estonia, Finland, France, Germany, Greece, Hungary, Iceland, Ireland, Israel, Italy, Japan, Korea, Luxembourg, Mexico, Netherlands, New Zealand, Norway, Poland, Portugal, Slovak Republic, Slovenia, Spain, Sweden, Switzerland, Turkey, United Kingdom, United States I Paesi evidenziati in rosso sono entrati a far parte dell OECD nel 2010.

28 MUTUO RICONOSCIMENTO DEI DATI Decision C(97)186/Final of the OECD Council: data generated in the testing of chemicals in an OECD Member Country, in accordance with OECD Test Guidelines and the Principles of GLP, shall be accepted in other OECD Member Countries for assessment purposes and other uses relating to the protection of human health and the environment In aggiunta: Mutual Recognition Agreements in the area of GLP between European Union with Israel, Japan and Switzerland. Treaty of the European Economic Area (EEA) of 13 December 1993, the European Regulations and Directives also apply to Iceland, Liechtenstein and Norway

29 CENTRI SAGGIO La normativa italiana (DLvo 50/2007) richiede che ogni centro di saggio che conduca o intenda condurre studi resi obbligatori dalla normativa (regolatori) deve far parte del Programma Nazionale di conformità alla BPL dell unità di monitoraggio italiana

30 I PRINCIPI FONDAMENTALI DELLA BPL 5 PUNTI FONDAMENTALI 1. RISORSE 2. RUOLI 3. CARATTERIZZAZIONE (della sostanza in esame) 4. DOCUMENTAZIONE 5. UNITA' DI ASSICURAZIONE QUALITA'

31 DOCUMENTAZIONE: RELAZIONE FINALE DELLO STUDIO Name and address of test facility Dates of start and finish of experimental work Name of study director Objectives Details of test substance and vehicles Description of test system Details of dosing, route and duration (if any) Summary of findings Statistics (if any) Discussion References GLP compliance statement from study director QA statement of inspections/audits Signed/dated reports from scientists

32 STUDI A BREVE TERMINE (1/4) Studies of short duration with widely used, routine methods Short" in the context of biological studies may not be regarded as "short" in a physical-chemical study. This makes it advisable to treat biological studies differently from physical-chemical ones with regard to the application of the provisions for short-term studies It is more useful to consider those characteristics of the conduct of a study which may qualify it to be classified as a short term study. These include the duration of critical phases, the frequency with which such studies are conducted and the complexity of the test system as well as the routine of the personnel involved

33 STUDI A BREVE TERMINE (2/4) Short-term biological studies include acute toxicity studies, some mutagenicity studies, and acute ecotoxicological studies Physical-chemical studies (e.g. chemical characterisation studies, melting point, vapour pressure, partition coefficient, explosive properties and other similar studies for which test guidelines exist) are those studies, tests or measurements which are of a short duration (typically not more than one working week), employ widely-used techniques (e.g. OECD Test Guidelines) and yield easily repeatable results, often expressed by simple numerical values or verbal expressions

34 STUDI A BREVE TERMINE (3/4) A sample for analytical purposes from each batch of test item should be retained for all studies except short-term studies Where a particular short-term study is performed frequently within a laboratory, it may be appropriate to prepare a single general study plan containing the majority of general information required in such a plan and approved in advance. Study-specific supplements to such plans (e.g. with details on test item, experimental starting date) should then be issued as a supplementary document requiring only the dated signature of the designated Study Director. The combined document the general study plan and the study-specific supplement is the study plan.

35 STUDI A BREVE TERMINE (3/4) Where short-term studies are performed using general study plans, it may also be appropriate to issue "standardised final reports" containing the majority of general information required in such reports and authorised in advance Study-specific extensions to such reports (e.g. with details of the test item and the numerical results obtained) may then be issued as a supplementary document requiring only the dated signature of the Study Director.

36 BPL vs. ISO/IEC Oggetto della certific./accredit. Campo di applicazione GLP Centri di Saggio "[...] ricerche di laboratorio, anche denominate studi, per le prove non cliniche effettuate ai fini previsti dalla regolamentazione in materia e volte a valutare gli effetti sull'uomo, sugli animali e sull'ambiente di tutti i prodotti chimici, tra cui vanno annoverati anche i cosmetici, i prodotti chimici per l'industria, i prodotti medicinali, i detergenti, gli additivi alimentari ed i coadiuvanti tecnologici, gli additivi per la mangimistica, gli antiparassitari, i solventi e gli aromatizzanti usati nell'industria alimentare e i costituenti chimici di materiali e di oggetti destinati a venire a contatto con gli alimenti" (All. 1 sez. I D.Lgs. 50/2007) ISO/IEC Laboratori di Prova "[...] le prove e le tarature eseguite utilizzando metodi normalizzati, metodi non normalizzati e metodi sviluppati dal laboratorio" (UNI CEI CEN ISO/IEC p. 1.1) Tipi di test Destinazione test/studi Studi predefiniti con lo sponsor Sottoposti alla valutazione delle autorità regolatorie competenti Analisi routinarie a breve termine Generalmente non sottoposti alla valutazione delle autorità competenti

37 GLP vs ISO specifici GLP sovrapposizione specifici ISO Prospetto degli studi Direttore dello studio Programma di studio Relazione finale dello studio Archivista e restrizione all accesso all archivio Archiviazione alla conclusione dello studio Ispezione di ogni studio Caratterizzazione sostanza in esame e catena di custodia Segregazione attività GLP Non richiesta indagine sulle cause delle deviazioni SOP approvate dal Management Change control solo per SI Management Training Materiali di riferimento Equipment and maintenance Sampling Sample reception Audits Corrective actions Method validation QC procedures Reclami Incertezza di misura Proficiency testing Azioni preventive Servizio ai clienti Miglioramento continuo

38 specifici GMP GMP vs GLP sovrapposizione specifici GLP Persona qualificata Rilascio lotto Reclami e ritiro del prodotto Azioni preventive VMP, Qualifica impianti, sistemi, attrezzature Quality risk management Accordo scritto con il Committente Gestione OOS Richiesta indagine sulle cause delle deviazioni Requisiti specifici (sterili) Change control per ogni change Management Training Materiali di riferimento Convalida sistemi computerizzati Convalida dei metodi Taratura e manutenzione Campionamento Ricevimento campioni Audit Azioni correttive Procedure di QC Registrazione dati grezzi Prospetto degli studi Direttore dello studio Programma di studio Relazione finale dello studio Archivista e restrizione all accesso all archivio Archiviazione alla conclusione dello studio Ispezione di ogni studio Requisiti di caratterizzazione e Catena di custodia Requisiti di segregazione Non richiesta indagine sulle cause delle deviazioni SOP approvate dal Management Change control solo per SI

39 BPL e normative product oriented Normativa / Linea Guida Campo di applicazione Reg. 1907/2006/CE (art. 13.4) REACH D. Lgs. 174/2000 (recep. Dir. 98/8/CE) biocidi D.Lgs. 194/95 (recep. Dir. 91/414/CE) Reg. 1831/2003/CE Reg. 1935/2004/CE Reg. 648/2004/CE D.M. 4 marzo 2005 Linea guida EMEA CPMP/EWP/QWP/1401/98 Decreto ISS 26 aprile 2002 Linea guida CdM - Comitato nazionale per la biosicurezza e le biotecnologie Provvedimento Min. San. 5/2/99 prodotti fitosanitari additivi per mangimi materiali a contatto con gli alimenti detergenti revisione dei medicinali per uso veterinario (deplezione residuale di chemioterapici) medicinali (studi di biodisponibilità e bioequivalenza) composizione e innocuità dei farmaci di nuova istituzione (prima della sperim. clinica sull uomo) uso di prodotti di terapia genica presidi medico chirurgici (PMC)

40 REQUISITI TECNICI DELLA ISO/IEC Generale 5.2 Personale 5.3 Condizioni ambientali 5.4 Metodi prova e taratura e validazione dei metodi 5.5 Apparecchiature 5.6 Riferibilità delle misure 5.7 Campionamento 5.8 Manipolazione degli oggetti sottoposti a prova o taratura 5.9 Assicurazione della qualità dei risultati di prova e taratura 5.10 Rapporti di prova

41 ISO/IEC17025 CRITERI GENERALI (5.1) Molti fattori determinano la correttezza e l affidabilità delle prove e/o delle tarature eseguite da un laboratorio. Questi fattori includono i contributi riferibili a: fattori umani (5.2); postazione di lavoro e condizioni ambientali (5.3); metodi di prova e metodi di validazione (5.4); apparecchiature (5.5); riferibilità delle misure (5.6); campionamento (5.7); manipolazione dei dispositivi da provare (5.8).

42 ISO/IEC17025 VALIDAZIONE (5.4) Validazione: conferma, sostenuta da evidenze oggettive, che i requisiti relativi ad una specifica utilizzazione o applicazione prevista sono stati soddisfatti (UNI EN ISO 9000:2000) Le tecniche utilizzate per la determinazione della prestazione di un metodo dovrebbero essere una, o una combinazione delle seguenti: taratura, utilizzando campioni o materiali di riferimento confronto dei risultati ottenuti con altri metodi confronti interlaboratorio; valutazione sistematica dei fattori che influenzano il risultato; stima dell incertezza di misura; NB: È richiesto il riesame periodico della validazione dei metodi.

43 Parametri di performance dei metodi di prova e strategie di convalida

44 Cenni sui parametri di performance dei metodi analitici Accuratezza Esattezza grado di concordanza tra un risultato di prova e un valore di riferimento accettato. Per valutare l accuratezza si prendono in considerazione le due componenti esattezza e precisione esprime la vicinanza di un valore medio ottenuto da un numero elevato di misure ripetute ad un valore di riferimento che può essere un valore noto o un valore accettato come standard può essere valutata in termini di recupero recupero il recupero di un analita in un campione viene normalmente valutato aggiungendo deliberatamente ad un campione (che viene perciò definito fortificato fortificato, prima dell analisi, una quantità nota di analita, verificando la differenza tra la concentrazione misurata dell analita nel campione fortificato e la concentrazione dell analita misurata nel campione non fortificato e rapportando tale differenza alla concentrazione calcolata (teorica di analita aggiunta. Il recupero può essere valutato anche su un materiale di riferimento certificato.

45 Cenni sui parametri di performance dei metodi analitici Precisione del sistema di ripetibilità intermedia accordo tra i risultati di misure indipendenti ottenuti in condizioni stabilite determinata mediante misure ripetute dello stesso campione (es. stessa vial determinata mediante misure ripetute su entità di prova identiche prelevate dal medesimo campione applicando lo stesso metodo, nello stesso laboratorio, con lo stesso operatore, con la stessa apparecchiatura e in un breve intervallo di tempo (short-term variability include anche l influenza di effetti casuali aggiuntivi (es. operatore, tempo, strumento, colonne cromatografiche, ecc. derivati dall applicazione della procedura analitica nello stesso laboratorio e può essere considerata una stima iniziale della variabilità a lungo termine (long-term variability di riproducibilità determinata applicando lo stesso metodo su entità di prova identiche, in laboratori differenti, da operatori diversi e utilizzando apparecchiature diverse

46 Cenni sui parametri di performance dei metodi analitici Specificità/ Selettività Campo di linearità capacità della procedura analitica di qualificare in maniera univoca un particolare analita da una matrice complessa o da potenziali agenti inquinanti ed interferenti (es. impurezze, componenti di degradazione, ecc. intervallo di valori della concentrazione dell analita in cui il metodo fornisce una risposta lineare Incertezza di misura parametro associato al risultato di una misura, che caratterizza la dispersione dei valori ragionevolmente attribuibili al misurando (UNI CEI ENV 13005:2000)

47 Cenni sui parametri di performance dei metodi analitici Limite di rivelabilità Limite di quantificazione Robustezza la più bassa concentrazione di analita in un campione che può essere rilevata, ma non necessariamente quantificata nelle condizioni specificate dal metodo. la più bassa concentrazione di analita che può essere determinata con accuratezza accettabile nelle condizioni specificate dal metodo capacità della procedura analitica di rimanere inalterata da piccole variazioni deliberate nei parametri del metodo, e fornisce un indicazione dell affidabilità del metodo nell uso normale Riferimenti: UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005 Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taraturat aratura UNI ISO :2000 Statistica Vocabolario e simboli Probabilità e termini statistici generali EURACHEM Guide The Fitness for Purpose of Analytical Methods - A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics,, 1998.

48 Esemplificazione grafica dei concetti di esattezza e precisione a) b) c) d) a) preciso ed esatto b) preciso ed inesatto c) impreciso ed esatto d) impreciso ed inesatto

49 REPORTING THRESHOLD o REPORTING LEVEL E' il valore più basso certificato come valore numerico in un Rapporto di Prova o Test Report. Viene anche denominato "reporting level" (SANCO 10684/09) o "reporting threshold" (ICH). Può anche essere maggiore del LOQ effettivo del metodo, per limitare i costi, ma non deve essere inferiore al limite di specifica. Per le autorità di monitoraggio nell'ambito del controllo dei pesticidi a livello UE il reporting threshold dovrebbe essere raggiungibile durante tutto l'anno. In ambito farmaceutico il reporting threshold non deve essere superiore al 50% del limite di specifica applicabile alle impurezze.

50 Precisione del sistema vs Limiti di specifica

51 EQUAZIONE DI HORWITZ E PRECISIONE DI RIPETIBILITA' L'equazione di Horwitz è un'equazione empirica che fornisce una stima del valore dell' incertezza di misura di un analita. Permette infatti di calcolare la RSD, in base alla sola concentrazione dell'analita, a prescindere dalla natura dell'analita, della matrice e dal metodo di misura impiegato. RSD% = 2 [1-0,5 log(c)] dove: - RSD% è la deviazione standard relativa percentuale; - C è la concentrazione dell'analita espressa in frazione (es. 1 ppm = 0,000001). Comunemente si utilizza la forma approssimata dell'equazione di Horwitz σ R = 0,02 C 0,8495 dove σ R è lo scarto tipo di riproducibilità. In questo caso è possibile mettere direttamente in relazione σ R con la concentrazione di analita.

52 EQUAZIONE DI HORWITZ E PRECISIONE DI RIPETIBILITA' Moltiplicando σ R per il fattore di copertura (es. K=2) si ottiene l'incertezza estesa. Prima di utilizzare lo scarto tipo di riproducibilità per il calcolo dell'incertezza estesa è necessario verificare che il proprio scarto tipo di ripetibilità stretta (Sr) sia compatibile con σ R ottenuto dall'equazione di Horwitz. Ovvero si deve verificare la condizione 1/2 σ R Sr 2/3 σ R. In particolare è necessario verificare che RSD% sperimentale < 0,67 x 2 [1-0,5 log(c)] Nel caso in cui Sr <1/2 σ R sarà invece possibile avere uno scarto tipo di ripetibilità migliore. L'equazione di Horwitz è applicabile per concentrazioni (sempre espresse in termini frazionari) che ricadono nell'intervallo tra 1,2x ,38x10-1. Per valori esterni all'intervallo citato si applicano le due correzioni di Thompson: σ R = 0,22 x C per C < 1,2x10-7 σ R = 0,01 x C 1/2 per C > 1,38x10-1

53 EQUAZIONE DI HORWITZ E CRITERI DI ACCETTABILITA' PER LA PRECISIONE DI RIPETIBILITA' UK Chemicals Regulation Directorate (CRD) of the Health and Safety Executive (HSE), Guidelines For Validation Of Analytical Methods For Non-agricultural Pesticide Active Ingredients And Products.

54 Recovery ammesso in funzione della concentrazione attesa UK Chemicals Regulation Directorate (CRD) of the Health and Safety Executive (HSE), Guidelines For Validation Of Analytical Methods For Non-agricultural Pesticide Active Ingredients And Products.

55 Esempi di parametri interni specifici applicabili a diverse tecniche analitiche

56 PARAMETRI DA CONSIDERARE PER LA VALUTAZIONE DELLA ROBUSTEZZA I parametri che dovrebbero essere valutati in fase di studio della robustezza sono essenzialmente di tre tipi: 1.parametri di base: es. stabilità delle soluzioni (standard, campione, condizione/usura dei materiali consumabili (es. colonne cromatografiche, ecc. 2.parametri interni: sono parametri direttamente legati alla procedura analitica (es. condizioni operative strumentali 3.parametri esterni: sono parametri direttamente legati alle condizioni ambientali (es. laboratorio, analisti, strumenti, ecc.

57 STRATEGIA DI CONVALIDA La strategia adottata per la validazione o convalida di metodi analitici dipende da diversi fattori: standard di qualità applicabile, es.: ISO GLP GMP GCP... ambito di applicazione food pharma biocidi fitosanitari studi clinici...

58 scopo dell'analisi test qualitativo test limite test quantitativo tipo di test identificazione titolo impurezza analisi residuale STRATEGIA DI CONVALIDA limite di specifica o regolatorio applicabile matrice considerata tecnica analitica applicata

59 STRATEGIA DI CONVALIDA: linee guida ICH ICH Q2 (R1), Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology

60 STRATEGIA DI CONVALIDA: linee guida EDQM EDQM, Validation of Analytical Procedures Guideline for OMCLs

61 STRATEGIA DI CONVALIDA: linee guida SANCO (BIOCIDI) SANCO 3030/99, Validation of Analytical Procedures Guideline for OMCLs

62 STRATEGIA DI CONVALIDA Standard: GMP / Ambito: pharma / Scopo: test quantitativo (HPLC) Tipo test: titolo (%) / Matrice: prodotto farmaceutico

63 STRATEGIA DI CONVALIDA Standard: GMP / Ambito: pharma / Scopo: test quantitativo (HPLC) Tipo test: impurezze / Matrice: prodotto farmaceutico

64 STRATEGIA DI CONVALIDA Standard: ISO / Ambito: food / Scopo: test quantitativo (LC/MS/MS) Tipo test: residuale (pesticidi, rif. SANCO 10684/09) / Matrice: estratto vegetale

65 STRATEGIA DI CONVALIDA Standard: GLP / Ambito: biocidi / Scopo: test quantitativo (LC/MS/MS) Tipo test: titolo (biocidi, rif. SANCO 3030/99) / Matrice: prodotto biocida

66 STRATEGIA DI CONVALIDA Standard: GLP / Ambito: clinico / Scopo: test quantitativo (LC/MS/MS) Tipo test: titolo (ppm) / Matrice: plasma

67 PANORAMICA CRITERI DI ACCETTABILITA' PER I PARAMETRI DI PERFORMANCE

68 Esercitazioni

69 ESERCITAZIONI Un prerequisito per la valutazione degli studi esistenti in ambito REACH è stabilire la loro qualità scientifica in base ai seguenti 3 aspetti: A.Affidabilità, Pertinenza, Adeguatezza; B.Specificità, Precisione, Ripetibilità; C.Affidabilità, Specificità, Incertezza. La valutazione dell affidabilità gli studi esistenti mediante il KLIMISCH SCORING SYSTEM: A.Permette di avere il grado di affidabilità mediante l assegnazione di un punteggio che va da 1 a 4; B.Può essere usato separatamente dai Criteri US EPA (1998, High Production Volume Challenge Program); C.Deve essere usato assieme ai Criteri US EPA (1998, High Production Volume Challenge Program).

70 ESERCITAZIONI Un prerequisito per la valutazione degli studi esistenti in ambito REACH è stabilire la loro qualità scientifica in base ai seguenti 3 aspetti: A.Affidabilità, Pertinenza, Adeguatezza; B.Specificità, Precisione, Ripetibilità; C.Affidabilità, Specificità, Incertezza. La valutazione dell affidabilità gli studi esistenti mediante il KLIMISCH SCORING SYSTEM: A.Permette di avere il grado di affidabilità mediante l assegnazione di un punteggio che va da 1 a 4; B.Può essere usato separatamente dai Criteri US EPA (1998, High Production Volume Challenge Program); C.Deve essere usato assieme ai Criteri US EPA (1998, High Production Volume Challenge Program).

71 ESERCITAZIONI In Italia la BPL è di competenza del: A.Ministero delle Politiche Agricole e Forestali; B.Ministero degli Interni; C.Ministero della Salute. Quali di questi punti sono in comune alle GLP e alle ISO/IEC 17025? A.Recording and reporting of data, Chain of custody, Archivist; B.Training, Reference materials, Equipment and maintenance; C.Preventive actions, Proficiency testing, Service to the client.

72 ESERCITAZIONI In Italia la BPL è di competenza del: A.Ministero delle Politiche Agricole e Forestali; B.Ministero degli Interni; C.Ministero della Salute. Quali di questi punti sono in comune alle GLP e alle ISO/IEC 17025? A.Recording and reporting of data, Chain of custody, Archivist; B.Training, Reference materials, Equipment and maintenance; C.Preventive actions, Proficiency testing, Service to the client.

73 ESERCITAZIONI Secondo la ISO/IEC17025 la determinazione della prestazione di un metodo è data dalla valutazione di uno, o una combinazione dei seguenti fattori (segnare quello/i non corretto/i): A.taratura con campioni o materiali di riferimento; B.confronto dei risultati ottenuti con altri metodi; C.valutazione empirica della accuratezza; D.confronti interlaboratorio; E.valutazione sistematica dei fattori che influenzano il risultato; F.stima dell incertezza di misura.

74 ESERCITAZIONI Secondo la ISO/IEC17025 la determinazione della prestazione di un metodo è data dalla valutazione di uno, o una combinazione dei seguenti fattori (segnare quello/i non corretto/i): A.taratura con campioni o materiali di riferimento; B.confronto dei risultati ottenuti con altri metodi; C.valutazione empirica della precisione del metodo; D.confronti interlaboratorio; E.valutazione sistematica dei fattori che influenzano il risultato; F.stima dell incertezza di misura.

75 ESERCITAZIONI Quale di queste affermazioni è corretta? A.la precisione del sistema viene valutata mediante misure ripetute su uno stesso campione; B.la precisione di riproducibilità viene valutata mediante misure ripetute entità di prova identiche prelevate dal medesimo campione applicando lo stesso metodo, nello stesso laboratorio, con lo stesso operatore, con la stessa apparecchiatura e in un breve intervallo di tempo; C.la precisione di ripetibilità viene valutata applicando lo stesso metodo su entità di prova identiche, in laboratori differenti, da operatori diversi.

76 ESERCITAZIONI Quale di queste affermazioni è corretta? A.la precisione del sistema viene valutata mediante misure ripetute su uno stesso campione; B.la precisione di riproducibilità viene valutata mediante misure ripetute entità di prova identiche prelevate dal medesimo campione applicando lo stesso metodo, nello stesso laboratorio, con lo stesso operatore, con la stessa apparecchiatura e in un breve intervallo di tempo; C.la precisione di ripetibilità viene valutata applicando lo stesso metodo su entità di prova identiche, in laboratori differenti, da operatori diversi.

77 ESERCITAZIONI Il Limite di rilevabilità è: A.la più bassa concentrazione di analita che può essere determinata con accuratezza accettabile nelle condizioni specificate dal metodo; B.la più bassa concentrazione di analita che può essere rilevata, ma non necessariamente quantificata nelle condizioni specificate dal metodo; C.la più bassa concentrazione di analita che può essere quantificata nelle condizioni specificate dal metodo. La robustezza del metodo analitico rappresenta: A.capacità di rimanere inalterato se applicato da un altro operatore ma non in un altro laboratorio; B.capacità di rimanere inalterato da piccole variazioni deliberate nei parametri di base, interni ed esterni; C.capacità di rimanere inalterato se vengono effettuate delle variazioni sostanziali del metodo.

78 ESERCITAZIONI Il Limite di rilevabilità è: A.la più bassa concentrazione di analita che può essere determinata con accuratezza accettabile nelle condizioni specificate dal metodo; B.la più bassa concentrazione di analita che può essere rilevata, ma non necessariamente quantificata nelle condizioni specificate dal metodo; C.la più bassa concentrazione di analita che può essere quantificata nelle condizioni specificate dal metodo. La robustezza del metodo analitico rappresenta: A.capacità di rimanere inalterato se applicato da un altro operatore ma non in un altro laboratorio; B.capacità di rimanere inalterato da piccole variazioni deliberate nei parametri di base, interni ed esterni; C.capacità di rimanere inalterato se vengono effettuate delle variazioni sostanziali del metodo.

79 ESERCITAZIONI La seguente figura rappresenta un metodo: A. esatto ed impreciso; B. preciso ed esatto; C. preciso ed inesatto; D. inesatto ed impreciso. Quale di queste affermazioni non è corretta? A.un valore di RSD pari a 10% può essere accettabile per la precisione di ripetibilità di un titolo di un principio attivo presente a livelli di g/100g; B.un valore di RSD pari a 1% può essere accettabile per la precisione di ripetibilità di un impurezza presente a livelli di mg/kg; C.un valore di RSD pari a 5% può essere accettabile per la precisione di ripetibilità di un titolo di un principio attivo presente a livelli di mg/kg.

80 ESERCITAZIONI La seguente figura rappresenta un metodo: A. esatto ed impreciso; B. preciso ed esatto; C. preciso ed inesatto; D. inesatto ed impreciso. Quale di queste affermazioni non è corretta? A.un valore di RSD pari a 10% può essere accettabile per la precisione di ripetibilità di un titolo di un principio attivo presente a livelli di g/100g; B.un valore di RSD pari a 1% può essere accettabile per la precisione di ripetibilità di un impurezza presente a livelli di mg/kg; C.un valore di RSD pari a 5% può essere accettabile per la precisione di ripetibilità di un titolo di un principio attivo presente a livelli di mg/kg.