CORSO DI PATOLOGIA MOLECOLARE. Prof. Andrea Cabibbo

Transcript

1 CORSO DI PATOLOGIA MOLECOLARE Prof. Andrea Cabibbo

2 Say NO to supermarket

3 Say NO to supermarket

4 Quali caratteristiche deve acquisire una cellula normale per diventare tumorale?

5 Capacità che devono essere acquisite da una cellula per diventare tumorale GFs-RTKs-RAS-Myc p53-bax-bcl-2 prb-myc Hanahan & Weinberg, Cell, 2000

6 Cancer Pathways

7 Elementi di complessità

8 Cancer Pathways

9 Elementi di complessità The RAS Superfamily

10 Cancer Pathways

11 Elementi di complessità

12 RAS Activation and Deactivation Ras is a G protein, or a guanosine-nucleotide-binding protein. Specifically, it is a single-subunit small GTPase, which is related in structure to the Gα subunit of heterotrimeric G proteins (large GTPases). G proteins function as binary signaling switches with "on" and "off" states. In the "off" state it is bound to the nucleotide guanosine diphosphate (GDP), while in the "on" state, Ras is bound to guanosine triphosphate (GTP), which has an extra phosphate group as compared to GDP. This extra phosphate holds the two switch regions in a "loaded-spring" configuration (specifically the Thr-35 and Gly-60). When released, the switch regions relax which causes a conformational change into the activated state. Henec, activation and deactivation of Ras and other small G proteins are controlled by cycling between the active GTP-bound and inactive GDP-bound forms. The process of exchanging the bound nucleotide is facilitated by guanine nucleotide exchange factors (GEFs) and GTPase activating proteins (GAPs). As per its classification, Ras has an intrinsic GTPase activity, which means that the protein on its own will hydrolyze a bound GTP molecule into GDP. However this process is too slow for efficient function, and hence the GAP for Ras, RasGAP may bind to and stabilize the catalytic machinery of Ras, supplying additional catalytic residues ("arginine finger") such that a water molecule is optimally positioned for nucleophilic attack on the gamma-phosphate of GTP. An inorganic phosphate is released and the Ras molecule is now bound to a GDP. Thus, GAPs regulate Ras inactivation. RAS-GTP GAPs GEFs RAS-GDP

13 SOS è un GEF! RAS-GTP GAPs GEFs RAS-GDP

14 Vie di trasduzione del segnale: in sostanza cos è il segnale?

15 Predisposizione genetica al cancro

16 Il concetto di predisposizione genetica al cancro Retinoblastoma (RB) Sindrome di Li-Fraumeni (p53) Poliposi adenomatosa familiare (APC) Tumore al seno (BRCA1) Usare OMIM per trovarle tutte. Usare limits Ruolo di alleli polimorfici Definizione: una variante genica puo essere definita un polimorfismo quando e presente in piu del 2% della popolazione.

17 Suscettibilità ereditaria al cancro

18 Multi Drug Resistance Proteins

19 Suscettibilità ereditaria al cancro Ereditata suscettibilita genetica Difetto di singolo gene o polimorfismo Mutazioni, virus, carcinogeni chimici Mutazione genetica acquisita Cancro

20 SNPs Il sequenziamento dei genomi umani di diversi individui ha portato all identificazione di milioni di Single Nucleotide Polimorfisms (SNPs) che consentono oggi di mappare un gene malattia con una precisione e facilita prima impensabili.

21 Eventi genetici che possono portare alla perdita di eterozigosi (Loss Of Heterozygosity LOH)

22 Le barriere allo sviluppo dei tumori?

23 Le barriere allo sviluppo dei tumori Tumor suppressors Apoptosi Senescenza Sorveglianza immunologica

24 Domande Le basi molecolari del cancro consistono mutazioni in diversi geni. Qualsiasi mutazione in qualsiasi gene puo provocare potenzialmente il cancro, oppure sono necessarie mutazioni in geni particolari?

25 Domande Le basi molecolari del cancro consistono mutazioni in diversi geni. Qualsiasi mutazione in qualsiasi gene puo provocare potenzialmente il cancro, oppure sono necessarie mutazioni in geni particolari? Cos e un proto-oncogene?

26 Domande Le basi molecolari del cancro consistono mutazioni in diversi geni. Qualsiasi mutazione in qualsiasi gene puo provocare potenzialmente il cancro, oppure sono necessarie mutazioni in geni particolari? Cos e un proto-oncogene? Cos e un tumor suppressor?

27 Domande Le basi molecolari del cancro consistono mutazioni in diversi geni. Qualsiasi mutazione in qualsiasi gene puo provocare potenzialmente il cancro, oppure sono necessarie mutazioni in geni particolari? Cos e un proto-oncogene? Cos e un tumor suppressor? Come si puo spiegare la predisposizione genetica al cancro?

28

29 Approcci High Throughput nella ricerca sul cancro Microarrays e Proteomica

30 Proteomica a chi?????

31 Concetto di High Throughput

32 Domanda Cos e un marker tumorale?

33 Domanda Come si fa ad identificare un marker tumorale?

34 Domanda Uno spot su un gel bidimensionale (una proteina), invariabilmente presente in persone destinate a sviluppare un tumore alla prostata nel giro di 6 mesi, e mai presente in persone non destinate ad ammalarsi, di cui pero si ignora la funzione biologica, e un buon potenziale marker tumorale?

35 Domanda Perche esistono dei marker tumorali? Come si possono generare, che origine possono avere?

36 Schema generale per l introduzione di genomica e proteomica nella pratica clinica Biopsia o plasma/urine/saliva Sviluppo di farmaci e/o nuovi metodi diagnostici Analisi genomica, trascrittomica (microarrays), proteomica (2D gels, MALDI-TOF, SELDI-TOF) Identificazione di targets farmacologici e nuovi markers Identificazione di mutazioni, pathways molecolari difettosi, proteine mancanti, sottoespresse, sovraespresse, normalmente non presenti, modificate in maniera anomala etc..

37 Identificazione di markers tumorali Approcci di microarray e proteomica, di tipo high throughput, possono portare all identificazione di markers utili per la diagnosi, classificazione e prognosi per vari tipi di tumori. L approccio preferito e quello di studiare liquidi biologici facilmente accessibili quali il siero, le urine o la saliva e di correlare particolari markers con il tipo e lo stadio della malattia. In molti casi una volta identificato un marker affidabile, il tipo di analisi effettuata sui pazienti non sara piu di tipo high throughput ma di tipo tradizionale, esclusivamente volta ad identificare la presenza e/o lo stato di quel particolare marker, ad esempio attraverso tecniche di tipo immunologico. In altri casi si arriva ad una predizione basata sulla variazione piu di un marker, ad esempio 5-10 marker. In tal caso si parla di signature (firma). L analisi da effettuare in questi casi puo essere piu complessa e richiedere l utilizzo di tecniche piu sofisticate quale mass spec o microarrays, anche se non su scala high throughput. In un lavoro su Lancet alcuni ricercatori hanno riportato l identificazione di markers per il cancro all ovaio che hanno una affidabilita e sensibilita del % e ricerche in questa direzione sono in corso per molti tipi di tumori con risultati estremamente promettenti. Nel caso delle signatures nessuna delle proteine della firma e di per se significativa. Lo sono invece variazioni di piu di un marker contemporaneamente, cosi come determinato negli esperimenti di microarrays o proteomica

38 Break?

39 Confronti tra tessuto sano e tessuto canceroso o cellule sane e cellule tumorali Domanda: una biopsia di un tumore è un campione omogeneo, e fatto di cellule tutte uguali?

40 Confronti tra tessuto sano e tessuto canceroso o cellule sane e cellule tumorali Domanda: una biopsia di un tumore è un campione omogeneo, e fatto di cellule tutte uguali? Eterogeneità nell ambito delle cellule tumorali (subcloni) Presenza di altre cellule non tumorali, quali ad es fibroblasti o infiltrati linfocitari o altre cellule, anche a seconda della localizzazione del tumore nell organismo Il tumore puo essere infiltrato in un tessuto prevalentemente sano (prelevato durante la biopsia)

41 Il problema dell eterogeneita dei campioni di tessuto tumorale negli esperimenti di profiling

42 Il problema dell eterogeneita dei campioni di tessuto tumorale negli esperimenti di profiling Per quale motivo l eterogeneita del tessuto in una biopsia puo essere un problema per successivi esperimenti di profiling genomico / trascrittomico / proteomico?

43 Il problema dell eterogeneita dei campioni di tessuto tumorale negli esperimenti di profiling I campioni di tessuto prelevati dal chirurgo sono hanno spesso una composizione eterogenea: diversi tipi cellulari, in diversa proporzione. Inoltre negli stadi avanzati, quali ad esempio sicuramente quelli post-vascolarizzazione, la popolazione delle stesse cellule tumorali ha aquisito una notevole eterogeneita genetica a causa della presenza di sotto-cloni con mutazioni differenti. La laser capture microdissection consente di ottenere, in alcuni casi, popolazioni piu omogenee

44 Laser Capture Microdissection

45 Laser Capture Microdissection La LCM consente di isolare specifiche popolazioni cellulari da tessuti congelati o fissati in etanolo, ed eventualmente anche colorati. La colorazione consente di identificare meglio le sottopopolazioni cellulari presenti nel campione.

46 Laser Capture Microdissection La LCM consente di isolare specifiche popolazioni cellulari da tessuti congelati o fissati in etanolo, ed eventualmente anche colorati. La colorazione consente di identificare meglio le sottopopolazioni cellulari presenti nel campione.

47 Laser Capture Microdissection Il microambiente di un tumore, costituito da cellule endoteliali, stroma (fibroblasti) e spesso anche da cellule del sistema immunitario svolge un ruolo essenziale nello sviluppo del tumore stesso. Pertanto l analisi del microambiente puo essere altrettanto importante di quello delle cellule tumorali. La LCM consente una separazione pulita delle cellule tumorali e varie altre sottopopolazioni di cellule normali da una singola biopsia.

48 Microarrays e Proteomica

49 DNA Microarrays

50 Quanti spots puo contenere un DNA microarray ?

51 Un esperimento di DNA microarrays Un microarray chip puo contenere anche spots

52 I due tipi principali di microarrays a DNA Tecnologia a c-dna Tecnologia a oligonucleotidi (Affymetrix ) Queste 2 tecnologie differiscono in maniera sostanziale solo nella fase di preparazione dei cips (vetrini) con gli spots. Le fasi successive di ibridazione e rilevazione sono analoghe.

53 Microarrays affymetrix (GeneChip )

54 Il principio dei DNA microarrays

55 Utilizzo di microarrays per identificare differenze nell espressione genica tra cellule normali e cellule tumorali

56 Prognosi sulla base di gene expression profiling B. Martin & P.S. Nelson, Trends in Cell. Biol. 2001

57 Esempio di prognosi differenziale sulla base di gene expression profiling: DLBCL Diffused Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) L analisi con microarrays di vari DLBCL ha consentito di individuare, in tumori all apparenza identici dal punto di vista morfologico, due classi diverse, sulla base del loro profilo di espressione genica: - DLBCL con un profilo di espressione simile ai linfociti dei centri germinali dei linfonodi - DLBCL con un profilo simile a quello dei linfociti circolanti nel sangue I pazienti con DLBCL del primo tipo, quello simile alle cellule dei centri germinali, hanno una prognosi molto migliore di quelli con un DLBCL di secondo tipo. Dunque in questo caso i microarrays hanno consentito di fatto di individuare, all interno di un gruppo apparentemente omogeneo, una ulteriore classificazione in sottotipi, che ha delle ricadute dirette sulla clinica. In effetti e ora possibile stabilire un trattamento differenziato per i due tipi di DLBCL tenendo conto della diversa prognosi.

58 Esempio di prognosi differenziale sulla base di gene expression profiling: Tumore alla mammella (breast cancer) In un esperimento sono stati comparati attraverso DNA microarrays i profili di espressione di 5361 geni selezionati in tumori di: - Sette pazienti con la mutazione BRCA1 - Sette pazienti con la mutazione BRCA2 - Sette pazienti con casi sporadici non collegabili a mutazioni in BRCA1 o 2 Si e dunque visto che i profili dei 3 gruppi erano notevolmente omogenei all interno di ogni gruppo. Ovvero quelli con BRCA1 erano simili tra loro e diversi dagli altri due gruppi, e cosi via. Sarebbe dunque possibile distinguere i tre gruppi esclusivamente sulla base del profilo di espressione. Inoltre gli stessi esperimenti hanno identificato 176 geni espressi differenzialmente tra i casi BRCA1 e BRCA2 suggerendo delle differenze importanti nella biologia di questi due tipi di tumore, che sebene morfologicamente identici hanno evidentemente alcune differenze nei meccanismi della patogenesi, a livello molecolare.

59 Domanda Quali sono i 2 principali tipi di DNA Microarrays?

60 Domanda Per quale motivo la tecnologia Affymetrix si avvantagia dalla sequenza del genoma umano?

61 Il problema dell eterogeneita dei campioni di tessuto tumorale negli esperimenti di profiling Quale tecnica consente di ovviare in parte a questa difficolta, consentendo di isolare, da una singola biopsia, le diverse componenti tissutali?

62

63 Proteomica Il cancro e stato definito una malattia genetica o comunque del genoma, sulla base del fatto che le cellule tumorali portano in genere numerose mutazioni che sono alla base del fenotipo tumorale Tuttavia si puo definire il cancro una malattia proteomica : i difetti genetici modificano i pathways di trasduzione del segnale creando un vantaggio selettivo per le cellule, forzandole ad ignorare segnali inibitori o a mandare di continuo falsi segnali positivi

64 Proteomica vs microarrays La proteomica analizza direttamente chi fa il lavoro, le proteine. L analisi attaverso i microarrays non prende in cosiderazione un numero importante di variabili quali ad esempio gli splicings differenziali e le modificazioni post-traduzionali. Inoltre la correlazione tra l abbondanza di un trascritto e quella della relativa proteina non e sempre lineare.

65 Markers tumorali nel siero PROTEOMIC PATTERN ANALYSIS E.F. Petricoin & L.A. Liotta, Trends in Biotechnol. 200

66 Il marker tumorale ideale Consente di scoprire se una persona ha un cancro con una semplice analisi del sangue.

67 2D Gel electrophoresis

68 Identificazione di markers per il tumore alla vescica attraverso 2D gel electrophoresis Upregolate nel tumore Downregolate nel tumore

69 Limiti dei 2D gels Relativamente low throughput Richiedono molto lavoro e le analisi prendono molto tempo Non vedono bene le proteine basiche e quelle a basso peso molecolare, che spesso possono essere dei buoni marcatori

70 Domanda Con quale tecnica e possibile identificare uno spot su un gel bidimensionale di proteine

71 Spettrometria di massa MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization combinata con uno spettrometro Time Of Flight) ESI Tandem Mass Spectrometry (Electron Spray Ionization) SELDI-TOF: Surface Enhanced Laser Desorption- Ionization La sensibilita di queste tecniche e dell ordine delle femtomoli

72 Peptide mass fingerprinting Agenti riducenti + SDS Maldi-TOF Elenco masse molecolari peptidi (fingerprint)

73 Peptide mass fingerprinting

74 Peptide fingerprinting Elenco masse molecolari peptidi (fingerprint/profilo) In genere un profilo corrisponde in maniera univoca ad una particolare proteina, consentendone dunque l identificazione attraverso strumenti bioinformatici. Tipicamente il profilo viene comparato con i profili virtuali di tutte le proteine presenti nelle banche dati disponibili quali genbank, swissprot etc... Negli strumenti moderni tale comparazione puo avvenire in tempo reale e fa parte dell output della macchina. I softwares sono sempre piu sofisticati ed in grado di risolvere anche misture di notevole complessita.