Continua. Peptidasi H 2 O

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1 Continua Peptidasi H 2 O

2 APPLICAZIONI INDUSTRIALI Gli enzimi sono molto utilizzati nell'industria chimica e in altre applicazioni industriali che richiedono catalizzatori estremamente specifici. Le principali limitazioni al loro impiego sono la scarsa stabilità in un solvente differente da quello biologico e - ovviamente - il numero limitato di reazioni per cui l'evoluzione ha messo a punto enzimi efficaci. Di seguito viene riportato un elenco di settori/applicazioni in cui vengono impiegati enzimi. Successivamente gli enzimi verranno discussi in base alla classe di appartenenza (in base al meccanismo d azione)

3 Tabella 1. Alcune applicazioni di enzimi. SETTORE APPLICAZIONE ENZIMI FUNZIONI Industria alimentare Panificazione Alimenti per neonati Birrificazione α-amilasi fungine Proteasi Tripsina Enzimi contenuti nell'orzo. Enzimi dell'orzo prodotti industrialmente. Amilasi, glucanasi e proteasi Beta glucosidasi Amiloglucosidasi Proteasi Fonte: Wikipedia Enzima Catalizzano la conversione dell'amido presente nella farina in zuccheri semplici. Utilizzate nella produzione di pane in genere, si inattivano intorno ai 50 C e sono dunque distrutte durante il processo di cottura. I produttori di biscotti le utilizzando per ridurre la concentrazione di proteine nella farina. Proteasi utilizzata per predigerire gli alimenti destinati ai neonati. Degradano amido e proteine producendo zuccheri semplici, amminoacidi e brevi peptidi, utilizzati dai lieviti per la fermentazione. Largamente utilizzati per la birrificazione industriale come sostituto degli enzimi naturali dell'orzo. Degradano i polisaccaridi e le proteine del malto. Ottimizza il processo di filtrazione. Permette la produzione di birre a basso contenuto calorico. Rimuovono la torbidezza che si genera durante la conservazione delle birre.

4 SETTORE APPLICAZIONE Succhi di frutta Industria casearia Industria alimentare Intenerimento della carne Trattamento dell'amido ENZIMI UTILIZZATI Cellulasi, pectinasi Chiarificano Rennina Vari enzimi prodotti da microrganismi Lipasi Lattasi Papaina Amilasi, amiloglucosidasi e glucoamilasi Glucosio isomerasi FUNZIONI i succhi di frutta Derivata dallo stomaco di giovani ruminanti (come vitelli e agnelli), è usata nella manifattura di formaggi per idrolizzare proteine. Il loro impiego è crescente nel settore. Utilizzata nella produzione di formaggi come il Roquefort. Degradano il lattosio a glucosio e galattosio. Con la sua azione proteolitica, ammorbidisce la carne per la cottura. Convertono l'amido in glucosio (molto utilizzati nella produzione di sciroppi). Converte il glucosio in fruttosio, per la produzione di sciroppi ad alta concentrazione di fruttosio (che, rispetto al saccarosio, presenta alte caratteristiche dolcificanti e basso contenuto calorico).

5 SETTORE ENZIMI UTILIZZATI FUNZIONI Industria cartiera Produzione di biocarburanti Detersivi Amilasi, xilanasi, cellulasi e ligninasi Cellulasi Soprattutto proteasi, in una specifica isoforma in grado di funzionare all'esterno delle cellule. Amilasi Lipasi - Le amilasi favoriscono la degradazione dell'amido, al fine di ottenere una viscosità inferiore. - Le xilanasi favoriscono lo sbiancamento della carta. - Le cellulasi ammorbidiscono le fibre. - Le ligninasi rimuovono la lignina per rendere la carta più morbida. Utilizzate per degradare la cellulosa in zuccheri semplici utilizzabili perle fermentazioni. Utilizzate nelle fasi di prelavaggio, con applicazione diretta sulle macchie di natura proteica. Utilizzate per il lavaggio di stoviglie con macchie particolarmente resistenti di amido e derivati. Utilizzate per ottimizzare la rimozione di macchie di unto e grassi di vario tipo.

6 SETTORE ENZIMI UTILIZZATI FUNZIONI Pulizia delle lenti a contatto Proteasi Produzione di gomma Catalasi Fotografia Biologia molecolare Proteasi (ficina) Enzimi di restrizione, DNA ligasi e polimerasi Permettono la rimozione di varie proteine dalle lenti, per prevenire eventuali infezioni. Consente la produzione di ossigeno a partire dal perossido, per convertire il lattice in gomma schiumosa. Degradano la gelatina presente sulle pellicole di scarto per il recupero del contenuto di argento. Utilizzate per la manipolazione del DNA nelle tecniche di ingegneria genetica. Ampi utilizzi in farmacologia, agricoltura e medicina (tra cui la medicina forense).

7 Applicazioni industriali delle cistein-proteasi Produzione di birra e bevande alcoliche Durante la preparazione della birra vengono aggiunti diversi ingredienti che possono formare complessi proteici insolubili che intorbidiscono il prodotto, soprattutto quando questo viene raffreddato. Il trattamento con enzimi proteolitici quali papaina o bromelina consentono alla birra di rimanere limpida quando viene raffreddata. Industria dei prodotti da forno Le proteasi vengono utilizzate perché consentono di preparare l impasto più velocemente, in quanto il glutine viene parzialmente idrolizzato. Evitano il ritirarsi dell impasto; permettono di avere una doratura più uniforme. La proteasi più utilizzata è la bromelina, che ha un ampio intervallo di ph ottimale (6-8,5) e temperature ottimali di reazione tra C.

8 Trasformazione dei prodotti alimentari L idrolisi delle proteine alimentari (animali o vegetali) viene realizzata per differenti motivi: 1. Aumentare le caratteristiche nutrizionali (morbidezza, tenerezza) 2. Ritardare il deterioramento 3. Modificare varie proprietà funzionali (solubilità, schiumabilità, coagulazione e proprietà emulsionanti) 4. Prevenire interazioni indesiderate 5. Modificare odore o sapore 6. Rimuovere fattori tossici o inibenti L idrolisi enzimatica viene preferita a quella chimica in quanto porta alla formazione di idrolizzati contenenti miscele di peptidi ben conosciute e impedisce la distruzione parziale o totale di determinati amminoacidi e la formazione di sostanze tossiche. Le cistein-proteasi più utilizzate sono papaina e bromelina.

9 Gli idrolizzati di pesce, uova e vegetali non solo favoriscono la formazione di ottimi aromi, ma anche l assimilazione delle proteine. Le caseine e le proteine del siero sono i substrati proteici più importanti in natura: 1. l idrolisi delle proteine del siero riduce la loro tendenza a schiumare; 2. L idrolisi delle proteine del latte riduce l allergenicità dei derivati del latte; 3. Gli idrolizzati proteici del latte vengono utilizzati nelle bevande energizzanti, nei cibi per l infanzia, per la nutrizione parenterale e nei prodotti dietetici. Le proteasi vengono utilizzate per aumentare la tenerezza della carne, attraverso la rottura dei legami crociati delle proteine fibrose (collagene ed elastina) papaina, bromelina o ficina, che vengono spruzzate sulla superficie della carne. La carne degli animali più vecchi può essere resa più tenere iniettando la papaina inattiva nella vena giugulare degli animali vivi poco prima della macellazione con la morte dell animale si accumulano gruppi tiolici nel muscolo, che attivano la papaina, intenerendo la carne.

10 Aspartico-proteasi Il principale utilizzo delle aspartico-proteasi (AP) si ha nell industria lattierocasearia. La coagulazione enzimatica del latte avviene i due fasi: 1. Le aspartico-proteasi idrolizzano il legame Phe105-Met106 della k-caseina, dividendo la proteina in due: la para-k-caseina, idrofobica, e il caseinomacropeptide, idrofilico. 2. Le micelle di caseina coagulano a causa della destabilizzazione provocata dall attacco proteolitico.

11 Gli enzimi per la coagulazione del latte si ottengono da mammiferi (vitelli, ovicaprini lattanti o maiale), piante (fico e carciofo-caciofiore) e funghi (estratti da una muffa (Mucor miehei)*, sono coagulanti economici e di qualità inferiore a causa dell attività proteolitica meno specifica) ma possono anche essere prodotti con la tecnologia del DNA ricombinante. Gli enzimi estratti dal quarto stomaco (abomaso) dei vitelli da latte (caglio o presame) sono quelli tradizionalmente usati (è l'unico permesso per la produzione di tutti i formaggi DOP come Parmigiano Reggiano, Grana Padano, Caciocavallo Silano, Pecorino Romano o il Castelmagno e il Pecorino di Farindola). In aggiunta alla chimosina, la miscela di enzimi contiene anche pepsina A. *

12 Tecnologia del DNA ricombinante.

13 Le aspartico-proteasi (EC X) esibiscono una gran numero di attività e specificità. Sono coinvolte in numerose funzione fisiologiche 1. Digestione dei nutrienti nei mammiferi (chimosina, pepsina A) 2. Difesa contro i patogeni 3. Virulenza dei lieviti (candidopepsina) 4. Metastasi del cancro al seno (catepsina D) 5. Interazioni polline-pistillo (cardosina A) 6. Controllo della pressione sanguigna (renina) 7. Degradazione dell emoglobina da parte di parassiti (plasmepsina di Plasmodium falciparum che taglia l emoglobina tra i residui Phe 33- Leu 34 della subunità α-globina ) 8. Maturazione delle proteine dell HIV (retropepsina)

14 Strutturalmente, appartengono alla famiglia della pepsine A1. Sono sintetizzate come pre-pro-enzimi: dopo il taglio del peptide segnale, il proenzima viene secreto e attivato da una auto-catalisi. SP P M SP peptide segnale P pro-segmento M enzima maturo Strutturalmente, sono costituite da: 1. singola catena polipeptidica di amminoacidi 2. Peso molecolare kda 3. Struttura terziaria soprattutto foglietti b, arrangiati in una conformazione bilobata (i due lobi sono omologhi).

15 Il sito catalitico è localizzato tra i due lobi e contiene due residui di aspartato (uno in ogni lobo), essenziali per la catalisi. In molti degli enzimi appartenenti alla famiglia delle pepsine, i residui di Asp si trovano in un motivo Asp-Thr-X, dove la X è una Ser o una Thr.

16 I residui di Asp attivano una molecola d acqua che media l attacco nucleofilo sul legame peptidico del substrato. La tasca catalitica è abbastanza grande da ospitare al massimo 7 residui della catena polipeptidica del substrato. All ingresso della tasca catalitica è localizzata una regione flessibile (flap) che controlla la sitospecificità.

17 Metallo-proteasi Le metallo-proteasi tagliano il legame peptidico attraverso l azione di una molecola d acqua attivata dal legame con ioni bivalenti. In base alla classificazione MEROPS, le metallo-proteasi vengono classificate in 14 diversi CLAN. Il CLAN MA comprende le metallo-proteasi maggiormente utilizzate a livello industriale, tra cui le Gluzincine [MA(E)] e le Metzincine [MA(M)] da Bacillus sp. Fanno parte delle metallo-proteasi: Amminopeptidasi (M1, M61), Carbossipeptidasi (M2, M32), Peptidil-dipeptidasi (M2), Oligopeptidasi (M3, M13) Endopeptidasi (M4, M10, M12 e altre)

18 Tutti i membri di questo CLAN sono caratterizzati dalla presenza di uno ione zinco all interno del sito attivo e dal motivo HEXXH, altamente conservato: i due residui di His (H) sono coinvolti nel legame con lo zinco, mentre Glu (E) è considerato il residuo importante per la catalisi. Le sottoclassi MA(E) e MA(M) differiscono per il terzo residuo amminoacidico legante lo zinco: - gluzincine Glu - metzincine Asp o His

19 Termolisina (famiglia delle glucinzine) amminoacidi 2. Due domini: - dominio N-terminale principalmente foglietti e -eliche in piccola parte; - dominio C-terminale soprattutto -eliche 3. Il sito catalitico con lo ione zinco è localizzato tra i due domini 4. Il motivo HEXXH è integrato nell -elica centrale

20 Meccanismo: Il legame tra lo zinco e il substrato è favorito dal legame dell acqua con il residuo di Glu143 e dal suo successivo attacco nucleofilo al carbonio carbonilico del legame peptidico da idrolizzare.