Principio di funzionamento dei test cromatografici di conferma. Dr.ssa Silvia Corezzi Lab.Tossicologia USL8 Arezzo

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1 Prcipio funzionamnto di tst cromatografici confrma Dr.ssa Silvia Corzzi Lab.Tossicologia USL8 Arzzo

2 Tcnich combat La La cromatografia cromatografia èè una una tcnica tcnica sparazion V V accoppiata accoppiata con con una una tcnica tcnica rivlazion (spttrofotomtrica (spttrofotomtrica o spttromtrica spttromtrica MS) MS) Aumnto Aumnto dl dlpotr formativo formativo tcnich tcnich combat combat

3 Tcnich combat Tutt l L Guida più rcnti, oltr ch vari tsti Lgg stabiliscono oggi ch la cromatografia dv ssr abbata alla tcnica rivlazion MS. Prchè la tcnica rivlazion MS è la miglior?

4 Prcipi dlla cromatografia Cromatografia Cromatografia su su colonna colonna Una Una miscla miscla v v sparata sparata bas bas all'affità all'affità di di vrsi vrsi componnti componnti vrso vrso una una fas fas stazionaria stazionaria immobilizzata immobilizzata una una colonna colonna d d una una fas fas mobil mobil ch ch fluisc fluisc contuo contuo attravrso attravrso ssa ssa In In qusto qusto smpio: smpio: il il componnt componnt azzurro azzurro ha ha maggior maggior affità affità pr pr la la fas fas mobil mobil qu qu sc sc pr pr primo primo dalla dalla colonna, colonna, qullo qullo giallo giallo ha ha maggior maggior affità affità pr pr la la fas fas stazionaria stazionaria d d sc sc pr pr ultimo, ultimo, qullo qullo rosso rosso ha ha comportamnto comportamnto trmo trmo

5 Prcipali tipi cromatografia Fas stazionaria solida (sparazion pr adsorbimnto) liquida (sparazion pr ripartizion) Fas mobil gassosa (Gas-cromatografia) liquida (Cromatografia Liquida) LC o HPLC (High Prformanc Liquid Chromatography)

6 Cromatogramma A È È un un grafico grafico ch ch riporta riporta sull'ass sull'ass dll dll X X il il tmpo tmpo ncssario ncssario ad ad uscir uscir dalla dalla colonna colonna (tmpo (tmpo ritnzion) ritnzion) sull'ass sull'ass dll dll Y Y una una grandzza grandzza fisica fisica A carattristica carattristica dlla dlla sostanza sostanza misurata misurata da da un un opportuno opportuno rivlator rivlator t R

7 Cromatografia Nlla Nlla colonna colonna cromatografica cromatografica avv avv la la sparazion sparazion di di composti composti trss trss (t (t R ). R ). La La grandzza grandzza A A pnd pnd dal dal tipo tipo rivlator rivlator (dtctor) (dtctor)

8 Il problma di RIVELATORI... Il Il rivlator UV-VIS VIS A A = = ASSORBANZA ASSORBANZA con con uno uno spttrofotomtro spttrofotomtro ad ad una una opportuna opportuna λ λ dotato dotato clla clla a a flusso flusso collgato collgato all'uscita all'uscita dlla dlla colonna colonna cromatografica cromatografica si si vidnzia vidnzia l'uscita l'uscita una una sostanza sostanza prò... prò... sostanz sostanz vrs vrs ch ch coluiscono coluiscono possono possono assorbir assorbir alla alla stssa stssa λ λ Il Il rivlator rivlator UV-VIS UV-VIS èè poco poco spcifico spcifico prchè prchèil il riconoscimnto riconoscimnto avv avv su su una una sgola sgola λλ (oltr (oltr ch ch sul sul t R t ) R )

9 Rivlator fluorimtrico La La fluorscnza fluorscnza è è il il fnomno fnomno pr pr cui cui alcun alcun molcol molcol sono sono capaci capaci assorbir assorbir una una crta crta λ λ (λ (λ ccitazion) ccitazion) rimttr rimttr ad ad una una λ λ maggior maggior (λ (λ mission) mission) Il Il rivlator rivlator fluorimtrico fluorimtrico è è più più spcifico spcifico qullo qullo UV-VIS UV-VIS prchè prchè il il riconoscimnto riconoscimnto avv avv su su 2 2 vrs vrs λ λ (oltr (oltr ch ch sul sul t R t ) R ) ma ma non non è è ancora ancora suffict suffict pr pr una una attribuzion attribuzion sicura... sicura...

10 Rivlatori 3D... Il grand passo avanti è avr un rivlator capac far uno SCAN complto dlla molcola uscita dalla colonna modo da non confondrla più con altr Lo SPETTRO DELLA SOSTANZA aggiung al cromatogramma una vra propria 3 mnsion

11 Rivlator a FOTODIODI Diod Array Dtctor (DAD) REMEDi BIORAD In In qusto qusto caso caso il il dtctor dtctor sgu sgu uno uno SPETTRO SPETTRO UV UV dlla dlla sostanza sostanza uscita uscita dalla dalla colonna colonna

12 Cromatogramma ottnuto con rivlator DAD Ogni Ogni sostanza sostanza v v riconosciuta riconosciuta bas bas a a 2 2 t R t rlativi R rlativi a a 2 2 IS IS d d bas bas al al suo suo spttro spttro UV UV fra fra nm. nm. pr pr confronto confronto con con lo lo spttro spttro torico torico contnuto contnuto nlla nlla bibliotca bibliotca bibliotca fornita fornita dal dal softwar softwar? ma ma il il softwar softwar non non riconosc riconosc lo lo spttro spttro UV UV 2 2 sostanz sostanz ch ch coluiscono... coluiscono... (qui (qui pr pr smpio smpio caton caton cata) cata)

13 Rivlator a spttromtria massa MS La La molcola molcola uscita uscita dalla dalla colonna colonna cromatografica cromatografica v v ionizzata ionizzata (spsso) (spsso) frammntata frammntata L'analisi L'analisi massa massa dlla dlla molcola molcola solo solo ionizzata ionizzata dà dà formazioni formazioni univoch univoch sul sul suo suo PESO PESO MOLECOLARE MOLECOLARE (formula (formula bruta) bruta) L'analisi L'analisi massa massa di di frammnti frammnti dà dà formazioni formazioni univoch univoch sulla sulla STRUTTURA STRUTTURA CHIMICA CHIMICA poiché poiché ogni ogni molcola molcola si si frammnta frammnta modo modo carattristico carattristico ni ni suoi suoi lgami lgami più più dboli dboli

14 Rivlator a spttromtria massa MS Aldo Poltti Il Il rivlator rivlator MS, MS, applicato applicato alla alla GC GC o o alla alla LC LC dà dà formazioni formazioni il il più più dll dll volt volt DEFINITIVE DEFINITIVE sull'idntità sull'idntità una una molcola molcola

15 Rivlator a spttromtria massa GC-MS LC-MS Il rivlator MS è il gold standard Inizialmnt è stato utilizzato com rivlator Gas-cromatografia (GC-MS) In GC l molcol viaggiano nlla colonna d scono da qusta fas vapor. Qusto rnd più facil la ionizzazion ch avv ad alto vuoto. L'trfacciamnto con la cromatografia liquida (HPLC o LC) è più rcnt (LC-MS)

16 GC-MS Richista accttata com tcnica confrma pr drogh d'abuso pr la sua alta spcificità Prsnt nll L Guida Istituzioni Socità Sctifich tutto il mondo non solo Tossicologia Forns ma ormai anch Tossicologia Clica

17 GC-MS Da Da ogni ogni picco picco gas-cromatografico (GC) (GC) uno uno spttro MS MS Potr Potr formativo MS MS >> >> RIVELATORI CONVENZIONALI

18 GC-MS Ionizzazion lttronica La La ionizzazion ionizzazion avv avv pr pr bombardamnto bombardamnto dlla dlla molcola molcola M con con lttroni lttroni - ad - ad alta alta E E (70V) (70V) La La molcola molcola prima prima si si ionizza ionizza poi poi si si frammnta frammnta

19 GC-MS Ionizzazion lttronica Tipi ioni Molcolari Frammnti Di trasposizion Mtastabili Ngativi A carica multipla In In GC-MS GC-MS si si ottngono ottngono pochi pochi ioni ioni a a carica carica multipla multipla

20 GC-MS/MS La Ionizzazion Elttronica è una tcnica ionizzazion hard prchè ad alta Enrgia (provoca stsa frammntazion nlla maggior part dll molcol). Lo stp frammntazion può ssr comunqu riptuto pr ottnr frammnti frammnti MS/MS o MS TANDEM In toria si può concpir un sprimnto MS n.

21 GC-MS Spttro MS Gli Gli ioni ioni sono sono sparati sparati bas bas al al rapporto rapporto m/z. m/z. Si Si ritrova ritrova lo lo ion ion non non frammntato frammntato (IONE (IONE MOLECOLARE) MOLECOLARE) d d i i frammnti frammnti carattristici carattristici dlla dlla molcola molcola con con valor valor m/z m/z frior frior

22 GC-MS Ricrca librria Aldo Poltti Nl Nl caso caso molcol molcol complss, complss, l'attribuzion l'attribuzion dlla dlla struttura struttura è è possibil possibil dal dal confronto confronto con con BIBLIOTECHE BIBLIOTECHE DI DI SPETTRI SPETTRI MS MS fornit fornit con con il il softwar softwar dllo dllo strumnto. strumnto. Poiché Poiché GC GC si si usa usa smpr smpr EI EI a a V, V, gli gli spttri spttri ottnuti ottnuti con con qualunqu qualunqu strumnto strumnto sono sono uguali uguali (FINGERPRINT (FINGERPRINT dlla dlla molcola) molcola) prfttamnt prfttamnt confrontabili confrontabili fra fra loro loro con con la la bibliotca bibliotca

23 GC-MS Un smpio... CONFERMA DI OPPIACEI Matric: siro,ur, sangu tro, matrici non convnzionali... I glucuroni non si possono vdr GC-MS Snza idrolisi si vdono coda morfa libr Con idrolisi nzimatica o chimica si vdono coda morfa totali Estrazion dalla matric biologica (LLE ospe)

24 GC-MS Un smpio... ESTRAZIONE LIQUIDO-LIQUIDO Ur, sangu o plasma luiti con tampon a ph 8-9 Sistmi solvnti: cloromtano/mtanolo 9:1 cloromtano/isobutanolo 9:1 tilactato/cloroformio/sano 7:2:1

25 GC-MS Un smpio... ESTRAZIONE SOLIDO-LIQUIDO Fas solida: rvrsd phas C2, C8, C18 Fas solida: mixd mod Fasi Fasi copolimrich copolimrich con con mccanismo mccanismo idrofobico idrofobico scambio scambio ionico ionico

26 GC-MS Un smpio... Fas organica da LLE o luato da SPE portato a scco drivatizzato pr rndr gli analiti più volatili Adatti Adatti alla alla gas-cromatografia

27 Uno stp spnsabil GC-MS La drivatizzazion di gruppi polari Ricoramo Ricoramo ch ch GC GC l l molcol molcol viaggiano viaggiano fas fas vapor. vapor. I I gruppi gruppi polari polari com com -OH -OH rndono rndono l l sostanz sostanz alto-bollnti alto-bollnti. bollnti. Pr Pr vaporizzar vaporizzar l l molcol molcol polari polari occorr occorr un un riscaldamnto riscaldamnto spto spto ch ch può può provocarn provocarn la la dcomposizion dcomposizion trmica. trmica. La La drivatizzazion drivatizzazion maschra maschra maschra i i gruppi gruppi polari polari rndndo rndndo l l molcol molcol più più volatili volatili

28 GC-MS Il procsso complto Campion biologico Aggiunta Standard Intrno (analogo o dutrato) Idrolisi nzimatica (β-glucuronidasi 65 C. 2h.) Purificazion SPE O LLE Drivatizzazion Analisi Intrprtazion di risultati

29 GC-MS Il risultato

30 GC-MS Il risultato

31 HS-GC GC-MS Il mtodo lzion pr la confrma dll'tanolo ni liqui biologici è la Gas-Cromatografia Spazio Tsta (Had Spac GC). S si ricrcano sostanz volatili (tanolo) sciolt una matric mno volatil (sangu, ura) conv ittar colonna non la fas liquida (ch dovrbb ssr lungamnt prtrattata) ma il vapor quilibrio con il liquido mantnuto vial trmostatata. Lo Spazio Tsta è dunqu un sistma izion sistma izion può ssr abbato a un dtctor MS o convnzional

32 LC-MS Evitar Evitar la la drivatizzazion di di composti composti polari polari La LC-MS consnt sparar carattrizzar un numro composti molto più lvato dlla GC-MS Fornisc formazioni su Pso Molcolar struttura di composti sparati LC

33 LC-MS Il problma dll'trfaccia La La LC LC lavora lavora ad ad alta alta prssion prssion (High (High Prssur Prssur Liquid Liquid Chromatography) Chromatography) Il Il rivlator rivlator MS MS lavora lavora ad ad alto alto vuoto vuoto Com Com può può avvnir avvnir la la ionizzazion ionizzazion una una fas fas condnsata? condnsata? Aldo Poltti

34 LC-MS Ionizzazion a prssion atmosfrica Nll trfaccia API (Atmosphric Prssur Ionization) la ionizzazion avv pr lttronbulizzazion: gli ioni si formano da soluzioni ch vngono fmnt nbulizzat attravrso un capillar tnuto ad alto potnzial. L più usat sono: Elctrospray (ESI) Ionizzazion chimica a prssion atmosfrica (APCI) Fotoionizzazion a prssion atmosfrica (APPI)

35 LC-MS Ionizzazion a prssion atmosfrica Ambiti Ambiti applicazion applicazion GC-MS GC-MS d d LC-MS LC-MS funzion funzion dlla dlla polarità polarità (ass (ass x) x) dl dl pso pso molcolar molcolar (ass (ass y) y) dll dll sostanz sostanz ricrcat ricrcat Aldo Poltti

36 LC-MS Ionizzazion a prssion atmosfrica

37 LC-MS Ionizzazion lttrospray ESI La produzion ioni gassosi attravrso lctrospray passa attravrso 3 sta 1 - Produzion gocciol carich nlla rgion vica all'uscita dl capillar ES 2 - Rapida muzion dll mnsioni dll gocciol carich pr vaporazion dl solvnt consgunt aumnto dlla rpulsion lttrostatica 3 - scoppio dll gocciol con produzion ioni fas gas

38 LC-MS ESI Un Un gas gas riscaldato riscaldato (N (N 2 ) 2 ) facilita facilita l'vaporazion l'vaporazion dl dl solvnt solvnt l'grsso l'grsso dgli dgli ioni ioni nl nl capillar capillar ch ch troduc troduc nll'analizzator nll'analizzator

39 LC-MS Efftto matric L'fftto sopprssion dl sgnal dovuto alla matric è consgunza dlla comptizion fra l'analita d i componnti dlla matric pr il raggiungimnto dlla suprfic dll gocciol carich pr l'mission dgli ioni fas gas.

40 LC-MS Nll'analisi Nll'analisi quantitativa quantitativa èè prfribil prfribil sporr sporr STANDARD STANDARD INTERNI INTERNI DEUTERATI DEUTERATI pr pr corrggr corrggr gli gli fftti fftti matric. matric. Uno Uno standard standard trno trno dutrato, dutrato, aggiunto aggiunto alla alla miscla miscla concntrazion concntrazion nota, nota, si si comporta comporta nlla nlla sorgnt sorgnt sattamnt sattamnt com com la la sostanza sostanza cognita cognita si si stgu stgu da da ssa ssa pr pr un un rapporto rapporto m/z m/z più piùalto (+1 (+1 s s monodutrato, monodutrato, s s bidutrato bidutrato cc.) cc.)

41 LC-MS ESI Formazion ioni multicarica La ESI può slocar sulla molcola un numro carich anch molto lvato. La spttromtria massa misura il rapporto m/z dgli ioni. Uno ion massa 5000 uma con 5 carich v rivlato a m/z = Ciò prmtt stndr il rang massa dgli analizzatori.

42 LC-MS ESI Spttri massa ch danno formazioni sul pso molcolar Elvata snsibilità Adatta pr analiti volatili ma anch polari o ionici Prmtt l'analisi molcol ad alto pso molcolar tramit la formazion ioni multicarica ma... ma... limitato limitato l'uso l'uso tamponi tamponi non non volatili volatili ionizzazion ibita ibita da da tamponi tamponi fortmnt sali sali conzioni conzioni analitich analitich variabili variabili (bibliotch non non confrontabili) soprattutto... limitat limitat l l frammntazioni

43 LC-MS/MS La ESI è una tcnica ionizzazion soft (provoca scarsa frammntazion). Pr avr formazioni strutturali è ncssario attivar la frammntazion dllo ion molcolar tramit un scondo stp (MS/MS)

44 LC-MS/MS TRIPLO QUADRUPOLO 3 3 quadrupoli quadrupoli collgati collgati Q1,Q2,Q3 Q1,Q2,Q3 Il Il quadrupolo, quadrupolo, opportunamnt opportunamnt attravrsato attravrsato da da corrnt corrnt contua contua raofrqunza raofrqunza cra cra un un campo campo lttrico lttrico statico statico d d altrnato altrnato grado grado acclrar acclrar gli gli ioni ioni spararli spararli bas bas al al rapporto rapporto m/z m/z

45 LC-MS/MS TRIPLO QUADRUPOLO Il Il primo primo quadrupolo quadrupolo slziona slziona uno uno o o più più ioni ioni prcursori, prcursori, il il scondo scondo funziona funziona da da clla clla collision, collision, il il trzo trzo slziona slziona uno uno o o più più ioni ioni prodotto prodotto

46 Full Scan-MS/MS S si analizzano tutti i prcursori (variando il primo quadrupolo) tutti i rlativi prodotti (variando il trzo quadrupolo), si ott uno spttro full scan. Qusto è util nllo SCREENING TOSSICOLOGICO

47 Dconvoluzion dgli spttri I softwar sono grado laborar spttri complssi, provnti anch da molcol ch coluiscono facndo la dconvoluzion dgli spttri. Trova gli ioni l cui abbondanz viduali crscono muiscono modo scrono all'uscita dalla colonna (cando ch ssi provngono dalla stssa molcola) Qusti ioni vngono raggruppati pr produrr uno spttro ricostruito pr ciascun composto. Lo spttro ricostruito v confrontato con qulli dlla bibliotca

48 Dconvoluzion dgli spttri In qusto smpio, l'algoritmo dconvoluzion è stato grado riconoscr la cocaa una zon molto affollata dl cromatogramma

49 Scrng cromatografico? La possibilità risolvr spttri sovrapposti (molcol ch coluiscono) ha avuto applicazioni nllo scrng tossicologico. Si è proposto adrittura applicar il rivlator MS ad una LC ultra fast (corsa cromatografica 1-3 m.) vitando lo scrng immunochimico.

50 LC-MS/MS Pr la confrma (si sa cosa crcar) sono più utili configurazioni più slttiv dl Full Scan

51 LC-MS/MS Q1 Q1 variabil: variabil: tanti tanti ioni ioni prcursori prcursori Q2 Q2 solo solo Rf: Rf: non non slziona slziona m/z m/z ma ma funziona funziona solo solo da da clla clla collision collision Q3 Q3 statico: statico: un un solo solo ion ion prodotto prodotto

52 LC-MS/MS Q1 Q1 statico: statico: un un solo solo ion ion prcursor prcursor Q2 Q2 solo solo Rf: Rf: non non slziona slziona m/z m/z ma ma funziona funziona solo solo da da clla clla collision collision Q3 Q3 variabil: variabil: tanti tanti ioni ioni prodotto prodotto dall'unico dall'unico ion ion prcursor prcursor

53 LC-MS/MS Q1 Q1 Q3 Q3 variabili variabili scronicamnt scronicamnt con con m m costant costant Q2 Q2 solo solo Rf: Rf: non non slziona slziona m/z m/z ma ma funziona funziona solo solo da da clla clla collision collision m= m= m 1 -m 1 -m 2 (smpio 2 (smpio m=45 m=45 prta prta CH CH 2 NH 2 NH 2 CH 2 CH 3 pr 3 pr vidnziar vidnziar AMP AMP d d MDA) MDA)

54 LC-MS/MS Q1 statico: un solo ion prcursor Q2 solo Rf: non slziona m/z ma funziona solo da clla collision Q3 statico: un solo ion prodotto dall'unico ion prcursor È IL METODO PIÙ SPECIFICO: OGNI MOLECOLA VIENE IDENTIFICATA IN BASE AD UNA SPECIFICA TRANSIZIONE DI MASSA

55 LC-MS/MS L L transizioni transizioni carattrizzanti... carattrizzanti...

56 CONCLUSIONI La tcnica LC-MS/MS ha una snsibilità spcificità adguata alla confrma drogh ni campioni biologici Risptto alla GC-MS ha un più ampio rang utilizzo Si possono analizzar sostanz polari snza drivatizzazion La part prparativa è più smplic vloc ch nlla GC-MS Pr qusto c'è un crscnt trss da part di Laboratori Tossicologia Clica vrso qusta tcnica l Ditt produttrici si stanno dotando bibliotch spttri smpr più sts