ATTUALITA SULLA DIAGNOSTICA DELL INFEZIONE TUBERCOLARE Varese, 9 Novembre 2011 Diagnostica microbiologica ed antibiogramma

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1 ATTUALITA SULLA DIAGNOSTICA DELL INFEZIONE TUBERCOLARE Varese, 9 Novembre 2011 Diagnostica microbiologica ed antibiogramma Agostino Rossi MD & Bassani Alessandro DTLB Sergio Gallazzi, Berrone Andreina, Elena Canali,.. Laboratorio di Microbiologia e Virologia (Direttore: Prof. Antonio Toniolo) Ospedale di Circolo e Università dell Insubria, VARESE

2 Rates of new TB cases, 2005 Estimated annual new TB cases per 100,000 population No estimate 0 24 (ITALY) or more

3 One third of the world s population is infected with organisms of the Mycobacterium tuberculosis complex Each year: - Two million people die -Eight million people are newly infected

4 One third of the world s population is infected with organisms of the Mycobacterium tuberculosis complex Each year: - Two million people die -Eight million people are newly infected World killer microrganisms : S.pneumoniae (pneumonia virus & bacteria), enteric virus-bacteria-parasites, Mycobacterium tuberculosis, HIV1-2, Malaria parasites

5 Laboratorio di Microbiologia e Virologia Osp.di Circolo e Univ.Insubria VARESE

6 Il genere Mycobacterium è l unico genere della famiglia delle Mycobacteriaceae. Nel genere Mycobacterium le varie specie hanno un contenuto genomico di G+C alto e pari al 60-70%; per questo sono simili ai generi Rhodococcus, Nocardia e Corynebacterium. Il genere Mycobacterium appartiene agli Actinobacteria, come i generi Rhodococcus, Nocardia e Corynebacterium.

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8 Il genere Mycobacterium è l unico genere della famiglia delle Mycobacteriaceae. Ma nel genere Mycobacterium sono comprese oltre 120 diverse specie micobatteriche.

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10 Le specie di micobatteri maggiormente riscontrabili in Microbiologia Medica sono: Mycobacterium tuberculosis complex Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium africanum.. MNT o NTM (o MOTT) (cioè micobatteri non tubercolari ) Micobatteri a lenta crescita Micobatteri a rapida crescita (Mycobacterium leprae)

11 Numero pazienti Mycobacterium tuberculosis 458 Mycobacterium bovis 4 Mycobacterium avium complex 115 Mycobacterium xenopi 11 Mycobacterium kansasii 9 Mycobacterium marinum 3 Mycobacterium fortuitum 3 Mycobacterium chelonei 2 Mycobacterium celatum 2 Mycobacterium scrofulaceum 2 Mycobacterium shimoidei 1 Mycobacterium gastri 1 Mycobacterium gordonae - Laboratorio di Microbiologia e Virologia Osp.di Circolo e Univ.Insubria VARESE

13 METODI MICROBIOLOGICI PER RICERCA di MICOBATTERI Trattamento campioni (NALC-NaOH) Esame microscopico AFB (Acid Fast Bacteria o BAAR) Esame colturale Terreni solidi (colonie batteriche) Terreni liquidi (coltura terreno liquido) Metodo fluorimetrico MGIT Metodo ossidoriduttivo Antibiogramma Metodo fluorimetrico Metodo manuale Ricerca DNA LCR (ligase chain reaction) PCR (polymerase chain reaction), PCR Real-Time SDA (strand displacement amplification) Analisi Proteomica MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization and time of flight) Analisi DNA Ibridazione DNA/DNA, sequenziamento DNA, DNA array, PCR-ESI-MS, MALDI-RE RFLP, SPOLIGOTYPING, MIRU.. (tipizzazione intraspecifica)

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15 METODI MICROBIOLOGICI PER RICERCA di MICOBATTERI Trattamento campioni (NALC-NaOH) o lisicentrifugazione Esame microscopico AFB (Acid Fast Bacteria o BAAR) Esame colturale Terreni solidi (colonie batteriche) Terreni liquidi (coltura terreno liquido) Metodo fluorimetrico MGIT Metodo ossidoriduttivo Antibiogramma Metodo fluorimetrico Metodo manuale Ricerca DNA LCR (ligase chain reaction) PCR (polymerase chain reaction), PCR Real-Time SDA (strand displacement amplification) Analisi Proteomica MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization and time of flight) Analisi DNA Ibridazione DNA/DNA, sequenziamento DNA, DNA array, PCR-ESI-MS, MALDI-RE RFLP, SPOLIGOTYPING, MIRU.. (tipizzazione intraspecifica)

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17 METODI MICROBIOLOGICI PER RICERCA di MICOBATTERI Trattamento campioni (NALC-NaOH) Esame microscopico AFB (Acid Fast Bacteria) Esame colturale Terreni solidi (colonie batteriche) Terreni liquidi (coltura terreno liquido) Metodo fluorimetrico MGIT Metodo ossidoriduttivo Antibiogramma Metodo fluorimetrico Metodo manuale Ricerca DNA LCR (ligase chain reaction) PCR (polymerase chain reaction) SDA (strand displacement amplification) Analisi Proteomica MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization and time of flight) Analisi DNA Ibridazione DNA/DNA, sequenziamento DNA, DNA array,.

18 BAAR or AFB positive clinical specimen Laboratorio di Microbiologia e Virologia Osp.di Circolo e Univ.Insubria VARESE

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22 Modello della struttura della parete micobatterica Lipo-arabino-mannano Lipidi con ac.grassi C14-C18 Lipidi con ac.grassi C28-C30-C40-C88 Acidi Micolici Fosfatidil-inositolo-mannosidi Arabino-galattano Peptidoglicano

23 Modello della struttura della parete micobatterica. Lipo-arabino-mannano Lipidi con ac.grassi C14-C18 Lipidi con ac.grassi C28-C30-C40-C88 Acidi Micolici Fosfatidil-inositolo-mannosidi Arabino-galattano Peptidoglicano

24 La particolare struttura della parete micobatterica ha enormi ripercussioni sulla gestione microbiologicoclinica dei Micobatteri per varie ragioni: di infettività (tipo di disinfettanti, persistenza ambiente,..) farmacologiche (uptake e bersaglio dei farmaci, ) metaboliche (coltura dei micobatteri, ) molecolari (estrazione di DNA micobatterico,..)..

25 ISONIAZIDE PIRAZINAMIDE CICLOSERINA ETIONAMIDE AMINOGLICOSIDI [streptomicina, amikacina, kanamicina, viamicina] self-promoted uptake CHINOLONI [ofloxacina, ciprofloxacina, levofloxacina, sporfloxacina] RIFAMPICINA, RIFABUTINA porine via lipidi-ac.micolici AMINOGLICOSIDI ETIONAMIDE ISONIAZIDE CICLOSERINA subunità 30S rrna formazione complesso aminoacido + trna ETAMBUTOLO sintesi D-alanina-D-alanina enoil-acil-carrier ossigenodipendente arabinosil transferasi SINTESI PROTEINE CHINOLONI SINTESI ACIDI MICOLICI DNA girasi (inibizione replicazione DNA) RIFABUTINA RIFAMPICINA RNA polimerasi (inibizione) SINTESI, TRASCRIZIONE, REPLICAZIONE DNA Quadro riassuntivo dei bersagli dell azione dei farmaci antitubercolari = vie di transito dei farmaci attraverso la parete micobatterica = bersaglio d azione degli antimicobatterici

26 METODI MICROBIOLOGICI PER RICERCA di MICOBATTERI Trattamento campioni (NALC-NaOH) Esame microscopico AFB (Acid Fast Bacteria) Esame colturale Terreni solidi (colonie batteriche) Terreni liquidi (coltura terreno liquido) Metodo fluorimetrico MGIT Metodo ossidoriduttivo Antibiogramma Metodo fluorimetrico Metodo manuale Ricerca DNA LCR (ligase chain reaction) PCR (polymerase chain reaction) SDA (strand displacement amplification) Analisi Proteomica MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization and time of flight) Analisi DNA Ibridazione DNA/DNA, sequenziamento DNA, DNA array,.

27 NALC-NaOH-COLTURA- AFB STAIN Tempo (ore) Id. campioni (liste, etc.) 0,30 Preparazione campioni 0,30 Decontaminazione 0,30 Temp o (ore) MTB DNA Centrifugazione 0,30 0,30 Preparazione Coltura 0,30 0,30 Neutralizzazione Colorazione AFB 0,30 1,0 Lisi TOTALE AFB 3 0,30 Preparazione mix 1,0 TOTALE AFB & MTB DNA = ore 5,30 Amplificazione MTB DNA 3-4 TOTALE MTB DNA

28 TAT medio (ore) TAT range (ore) Tempo risposta LIS (giorni) AFB 22,3 6,4 58,6 5 MTB-DNA 36,2 6,9 110,4 10 AFB+ & MTB-DNA 24,2 6,9 33,6 - Laboratorio di Microbiologia e Virologia Osp.di Circolo e Univ.Insubria VARESE

29 BAAR or AFB positive clinical specimen Laboratorio di Microbiologia e Virologia Osp.di Circolo e Univ.Insubria VARESE

30 ES. MICROSCOPICO MICOBATTERI (AFB/BAAR) Mycobacterium tuberculosis complex (n = 90 pazienti) NALC-NaOH centrifugazione - SENSIBILITA (%) CAMPIONI RESPIRATORI 72,2 CAMPIONI TS.LINFONODALI 11,1* URINE 0* * Colture e ricerca DNA di M.tuberculosis complex = POSITIVE

31 ES. MICROSCOPICO MICOBATTERI (AFB/BAAR) Mycobacterium tuberculosis complex (n = 90 pazienti) NALC-NaOH e centrifugazione - SENSIBILITA (%) CAMPIONI RESPIRATORI 72,2 ES. MICROSCOPICO MICOBATTERI (AFB/BAAR) Mycobacterium tuberculosis complex (n = 90 pazienti) Ricerca diretta senza trattamento (stima vs CFU/mL) - SENSIBILITA (%) CAMPIONI RESPIRATORI 13,3

33 I micobatteri sono batteri a lenta o lentissima crescita; infatti per colonie visibili devono almeno trascorrere giorni di coltura, ma in certi casi necessitano sino a giorni. Infatti il loro tempo di generazione è compreso tra 2 e >20 ore. Le poche specie definite a rapida crescita si sviluppano in 4-7 giorni ( 7 giorni) I micobatteri sono batteri aerobi (O2, respirazionecitocromi, deidrogensi, ossidasi,..) Non formano spore e questi bacilli non sono mobili.

34 Micobatteri a lenta crescita = superiore a 7 giorni Micobatteri a rapida crescita = in 5-6 giorni Laboratorio di Microbiologia e Virologia Medica Osp.di Circolo e Univ.Insubria VARESE

35 Non photochromogens Scotochromogens Photochromogens Laboratorio di Microbiologia e Virologia Medica Osp.di Circolo e Univ.Insubria VARESE

36 I micobatteri sono batteri a lenta o lentissima crescita. infatti per poter osservare colonie visibili devono almeno trascorrere giorni di coltura Ma i micobatteri sono batteri aerobi (O2, respirazionecitocromi, deidrogensi, ossidasi,..) e quindi il consumo di O2 in coltura può essere utilizzato. per avere tempi più rapidi di coltura

37 Preparazione coltura MGIT Campione biologico DIGESTIONE, DECONTAMINAZIONE E CONCENTRAZIONE Miscela antibiotica PANTA + Supplemento di crescita OADC BACTEC MGIT 960 Incubazione

38 Middlebrook 7H9 medium FO 2 FO 2 FO 2 (F = rutenio cloruro) FO FO 2 2 FO2 FO 2 MGIT = Mycobacteria Growth Indicator Tube

39 Mycobacterium spp F F F F F F F (F = rutenio cloruro) MGIT = Mycobacteria Growth Indicator Tube

40 N. Osservazioni ,5 % 34,1 % Colture MGIT Positive (N=82) 19,5 % 6,1 % Giorni 4,9 % 3,7 % 1,2 % Laboratorio di Microbiologia e Virologia Osp.di Circolo e Univ.Insubria VARESE

41 COLTURE PER RICERCA MICOBATTERI LJ = Coltura in Lowenstein-Jensen medium MGIT = Coltura "fluorimetrica" in Middlebrook 7H LJ MGIT Laboratorio di Microbiologia e Virologia Osp.di Circolo e Univ.Insubria VARESE

42 Preparazione coltura MGIT Campione biologico DIGESTIONE, DECONTAMINAZIONE E CONCENTRAZIONE Miscela antibiotica PANTA + Supplemento di crescita OADC BACTEC MGIT 960 Contaminazione colture (%) Incubazione TLB non addestrato TLB in training TLB addestrato < 10

44 Mycobacterium spp ANTIBIOGRAMMA MET.FLUORIMETRICO BREAK-POINT F F F F F F F (F = rutenio cloruro) MGIT = Mycobacteria Growth Indicator Tube

45 ANTIBIOTICO Concentrazione (µg/ml) STREPTOMICINA 1 µg/ml ISONIAZIDE 0,1 µg/ml RIFAMPICINA 1 µg/ml ETAMBUTOLO 5 µg/ml ANTIBIOTICO Concentrazione (µg/ml) PIRAZINAMIDE 100 µg/ml

46 ANTIBIOTICO Concentrazione (µg/ml) Concentrazione (µg/ml) STREPTOMICINA 1 µg/ml 4 µg/ml ISONIAZIDE 0,1 µg/ml 0,4 µg/ml RIFAMPICINA 1 µg/ml - ETAMBUTOLO 5 µg/ml 7,5 µg/ml

47 RANGE (giorni) ANTIBIOGRAMMA MTB ANTIBIOGRAMMA MTB (presenza di inquinamenti*) * Possibili false-resistenze Laboratorio di Microbiologia e Virologia Osp.di Circolo e Univ.Insubria VARESE

48 Mycobacterium spp ANTIBIOGRAMMA MET.FLUORIMETRICO.. MIC.. (da 3 a 7 concentrazioni) F F F F F F F (F = rutenio cloruro) MGIT = Mycobacteria Growth Indicator Tube

49 ANTI-TUBERCOLARI ALTERNATIVI (metodo manuale, MIC?) CIPROFLOXACINA LEVOFLOXACINA RIFABUTINA AMIKACINA/AMIKACINA SOLFATO AC. PARA-AMINO-SALICILICO (PAS) D-CICLOSERINA ETIONAMIDE CAPREOMICINA KANAMICINA

50 ANTIBIOGRAMMA MANUALE Metodo di riferimento Medium:Middlebrook 7H10 Laboratorio di Microbiologia e Virologia Osp.di Circolo e Univ.Insubria VARESE

51 Middlebrook 7H10 medium Laboratorio di Microbiologia e Virologia Medica Osp.di Circolo e Univ.Insubria VARESE

52 FARMACI ANTI-M.avium complex CIPROFLOXACINA LEVOFLOXACINA RIFABUTINA AMIKACINA/AMIKACINA SOLFATO AC. PARA-AMINO-SALICILICO (PAS) D-CICLOSERINA ETIONAMIDE CAPREOMICINA KANAMICINA

53 ANTIBIOGRAMMA MANUALE Metodo di riferimento Medium:Middlebrook 7H10

54 ANTI-TUBERCOLARI ALTERNATIVI (metodo manuale, MIC?) CIPROFLOXACINA LEVOFLOXACINA RIFABUTINA AMIKACINA/AMIKACINA SOLFATO AC. PARA-AMINO-SALICILICO (PAS) D-CICLOSERINA ETIONAMIDE CAPREOMICINA KANAMICINA

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56 Drug resistance: key concepts Primary (initial) resistance TB patient s initial Mycobacterium tuberculosis population resistant to drug Secondary (acquired) resistance Drug-resistant M. tuberculosis in initial population selected by inappropriate drug use (inadequate treatment or nonadherence) Resistant M.tuberculosis

57 Drug resistance in M. tuberculosis Mutational resistance is linked to the dimension of bacterial populations. The MDR phenotype (resistance to at least INH & RFP) is the result of accumulative mutations rather than the acquisition of a transferable MDR factor. Bacterial population: Cavities CFU Hard caseous foci CFU Average spontaneous mutation rate to resistance (David, 1970): INH 3 x 10-8 Streptomycin 1 x x 10-8 EMB 1 x 10-7 RMP 2 x Mutation rate for 2 drugs: <1 x Thus, testing for resistance to any drug is of utmost importance before initiating treatment (Musser, 1995).

58 Definitions Multidrug resistant (MDR) TB: M. tuberculosis isolate resistant to at least isoniazid & rifampicin Extensively drug resistant (XDR) TB: MDR plus resistance to at least a fluoroquinolone and one second-line injectable drug (amikacin, kanamycin, capreomycin)

59 MDR and XDR strains WHO estimates about 400,000 cases of multidrug-resistant (MDR)-tuberculosis (defined as resistant to isoniazid and rifampin) occur annually. In an international, retrospective survey of nearly 18,000 TB isolates collected from 2000 through 2004, 20 percent of samples were MDR-TB, and 10 percent of these (or 2 percent overall) were XDR-tuberculosis (resistant to isoniazid, rifampin, fluoroquinolones, and at least one of the 3 injectable anti-tuberculosis drugs capreomycin, kanamycin, and amikacin) (MMWR 2006; 55(11):301-5, available at < tm>).

60 Possible return to a pre-antibiotic era Drug susceptible TB* MDR-TB 1990 XDR-TB 2006 Total DR? *or limited resistance manageable with 4 drug regimen - DOTS Resistance to H&R Treatable with 2 nd line drugs Resistance to 2 nd line drugs Treatment options seriously restricted Resistance to all available drugs No treatment options

62 Cluster epidemici di Mycobacterium tuberculosis resistenti a isoniazide e rifampicina (MDR strains) ** ** Mutazione gene rpob (H526D), ceppo di M.tuberculosis resistente alla rifampicina Laboratorio di Microbiologia e Virologia Medica Osp.di Circolo e Univ.Insubria VARESE

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65 GENOMICA PROTEOMICA oltre 3900 possibili proteine enzimi metabolismo (parete,..) proteine virulenza.. (30 proteine)

66 RICERCA DNA (PCR,SDA) Mycobacterium tuberculosis complex (n = 90 pazienti) NALC-NaOH centrifugazione CAMPIONI AFB-POSITIVI E SU INDICAZIONE CLINICA - SENSIBILITA (%) CAMPIONI RESPIRATORI, CAMPIONI TS.LINFONODALI 98,9 URINE 99,9

67 CAMPIONI CLINICI ED AMPLIFICAZIONE DNA MTB (AFB-POSITIVI E/O INDICAZIONE CLINICO-MICROBIOLOGICA ) PCR,SDA CAMPIONI RESPIRATORI Espettorati (campioni multipli) X Broncoaspirati, broncolavaggi Espettorato e broncoaspirato TS.LINFONODALI Biopsia linfonodale 2X TS.LINFONODALI (da interventi chirurgici) ALTRI CAMPIONI Agospirato e pus da linfondo Mat.da fistola Ts.linfonodale sede tiroidea Ts.linfonodale mediastinico Ts.linfonodale sede pleurica Ts.linfonodale sede addominale Ts.linfonodale sede epatica Ts.linfonodale sede pancreatica Liquor, ascessi cerebrali,.. Biopsie ossee URINE Urine (campioni multipli) (X) 2X= eseguire PCR in duplicato X X 2X 2X 2X 2X 2X 2X 2X 2X 2X

68 Metodo Sensitivity (%) Sensitivity related to clinical disease (%) LCR, PCR,SDA & COLTURE 98,5 99,7 COLTURE (O 2 ) 97,2 - Diagnosi microbiologiche di TBC ottenute con un singolo campione ( coltura/amplificazione, coltura) 15,6 % (31 pazienti) Laboratorio di Microbiologia e Virologia Osp.di Circolo e Univ.Insubria VARESE

69 REPARTI INVIANTI (CAMPIONI CLINICI, PAZIENTI A RISCHIO,..) PER RICERCA DI MICOBATTERI MALATTIE INFETTIVE Espettorato (campioni multipli) Faringoaspirati, Broncoaspirati Liquor, biopsie osse,.. Ts.linfonodali NOTE CHIRURGIA TORACICA Campioni di Pazienti Trapiantati NEFROLOGIA (SOT-Rene) CHIRURGIA TRAPIANTI PNEUMOLOGIA Espettorato & Broncoaspirato PEDIATRIA Casi Respiratori Ts.linfonodali (ts.linfonodale pleurico, addominale, mediastinico) Ts.linfonodale peripancreatico CHIRURGIA TORACICA CHIRURGIA MALATTIE INFETTIVE MEDICINE, ONCOEMATOLOGIA Espettorato, Broncoaspirato Ts.linfonodali Urine OTORINO

70 Un rigraziamento H. DI SONDALO Laboratorio Dr. Bernardini Vincenzo Dr.ssa Troupjoti Panaiota H. DI CIRCOLO E UNIV.INSUBRIA Microbiologia e Virologia Prof. Porta Francesco Prof. Toniolo Antonio Malattie Infettive Prof. Grossi Paolo