LIPIDI. Insolubili in acqua, solubili in solventi organici FOSFOLIPIDI-TRIGLICERIDI-COLESTEROLO-ACIDI GRASSI LIBERI FOSFORO TRIGLICERIDE FOSFOLIPIDE

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1 LIPIDI Insolubili in acqua, solubili in solventi organici FOSFOLIPIDI-TRIGLICERIDI-COLESTEROLO-ACIDI GRASSI LIBERI TRIGLICERIDE FOSFOLIPIDE Cholesteryl Ester O P N R C O N BASE AZOTATA P FOSFORO ACIDO GRASSO

2 CHILOMICRONI VLDL LDL HDL DIAMETRO % COLEST. LIB MOBILITA ELETROF. Origine Pre β β α % COLEST. ESTER % TRIGLICERIDI 80-90* % FOSFOLIPIDI % PROTEINE APOLIPOPROT. B-48 B-1OO B-100 AI, AII

3 SEPARAZIONE DELLE LIPOPROTEINE DEL PLASMA MEDIANTE ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO ZONA DI APPLICAZIONE DEL PLASMA + CHILOMICRONI LDL (β) VLDL (Pre β) HDL (α)

4 Apo Sede sintesi Lipoproteine Funzione AI Fegato, Intestino HDL Attivatore LCAT AII Fegato, Intestino HDL B100 Fegato LDL,VLDL Catabolismo LDL per interazione con il recettore LDL B48 Intestino Chilomicroni Assemblaggio chilomicroni CI Fegato VLDL Attivatore LCAT, Inibitore catabolismo IDL, VLDL, Remnants CII Fegato VLDL,HDL Attivatore LPL CIII Fegato VLDL Inibisce l assunzione epatica delle VLDL e dei residui dei chilomicroni D Vari tessuti Trasferimento degli esteri del colesterolo E Fegato VLDL, LDL Fattore di riconoscimento e di legame dei residui dei chilomicroni e delle VLDLremnants da parte delle cellule LCAT= Lecitin cholesterol acyl transferasi: Esterifica il colesterolo libero LPL=Lipoprotein Lipasi: idrolizza i trigliceridi

5 Metabolismo dei lipidi esogeni HDL A I A IV TG CE B48 CII Capillare LPL TG CE B48 E Recettori remnants Fegato Chilomicroni Remnants dei Chilomicroni

6 Metabolismo endogeno dei lipidi Recettori LDL TESSUTI EXTRAEPATICI MACROFAGI E TG CII CE B100 Capillare LPL E TG CE B100 HTGL B100 CE E B100 CE E VLDL IDL LDL LDL modificate

7 Formazione della placca aterosclerotica

8 Trasporto inverso del colesterolo Tessuti A I PL A I HDL nascente c c c PL A I LCAT c c c CE Col CE PL E HDL CETP E Recettori Fegato VLDL LDL

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10 Variabilità preanalitica 1. paziente 2. prelievo 3. campione Variabilità analitica 1. colesterolo totale 2. colesterolo HDL 3. colesterolo LDL 4. trigliceridi 5. apo A-I, B 6. Lp(a) Indicazione per la richiesta Refertazione

11 VARIABILITA PRE-ANALITICA: 1. PAZIENTE Variabilità biologica fonte ineliminabile di variabilità col totale col HDL col LDL trig apo A-I e B Lp(a) CVb~ 6% 7% 9% 20% 6% variabile Gli effetti della VB si controllano effettuando > 1 misura a distanza di qualche settimana (due - quattro)

12 VARIABILITA PRE-ANALITICA: 2. PRELIEVO ortostatismo 10% PRELIEVO occlusione 10% Standardizzazione: posizione seduta (da almeno 5 min.) laccio (il meno possibile)

13 VARIABILITA PRE-ANALITICA: 3. CAMPIONE CAMPIONE siero/plasma conservazione Standardizzazione: EDTA 5% + 4 C per 4-5 giorni - 70 C se >1 settimana eparina attivazione LPL (?) (metodo dipendente)

14 VARIABILITA ANALITICA: GOALS National education cholesterol program INESATTEZZA IM PRECISIONE ET 1.65xBIAS% +CV Colesterolo totale 3% CV 3% 9% Trigliceridi 5% CV 5% 15% Colesterolo HDL > 1,09 mmo/l;42 mg/dl 5% CV 4% 13% Colesterolo LDL 4% CV 4% 12%

15 VARIABILITA ANALITICA: 1.COLESTEROLO TOTALE Metodo Definitivo ID - MS (NIST) Standard Primario SRM 911 (NIST) Metodo di Riferimento ALBK (CDC) Standard Secondario SRM (NIST) Metodi Routinari CHOD / POD / TRINDER CDC= centers for disease control; NIST= national institute of standard and technology

16 VARIABILITA ANALITICA: 1.COLESTEROLO TOTALE CholesterolReferenceMethodLaboratoryNetwork

17 VARIABILITA ANALITICA: 1. COLESTEROLO TOTALE Standardizzazione: utilizzare materiali certificati CRMLN rivolgersi al centro del network

18 Metodi routinari di dosaggio del colesterolo METODI CHIMICI METODI ENZIMATICI CHOD / POD / TRINDER

19 Metodi routinari di dosaggio del colesterolo Metodi Chimici Ossidazione chimica del colesterolo in ambiente fortemente acido Formazione di un composto colorato (assorbimento 610 o 410 nm) Svantaggi Bassa specificità L ossidazione col libero e esterificato produce cromofori con differenti coefficienti di estinzione molare (estrazione con solventi organici ed idrolisi chimica)

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23 METODI ENZIMATICI Siero Colesterolo 2/3 esteri del colesterolo 1/3 in forma libera Esteri colesterolo Esterasi colesterolo +R-COOH Esterasi di Pseudomonas: specificità acidi grassi legati al colesterolo

24 METODO ENZIMATICO CHOD / POD / TRINDER ossidasi Colesterolo + O 2 colestenone + H 2 O 2 Dosaggio del colestenone o H 2 O aminofenazone + fenolo perossidasi 4-p-benzochinone-monoimino-fenazone + H 2 O Misura a 500 nm

25 VARIABILITA ANALITICA: 2.COLESTEROLO HDL Metodo Definitivo? Standard Primario? Metodo di Riferimento eparina-mn (su d> 1.006) Metodi Routinari precipitanti, omogenei (diretti)

26 METODI DI PRECIPITAZIONE PER LA MISURA DI HDL COLESTEROLO Interazione tra cariche degli agenti precipitanti (polianioni e/o cationi bivalenti) e quelle delle lipoproteine contenenti APOB -Precipitazione con: eparina/magnesio Magnesio solfato di Destrano/Magnesio PEG fosfotungstato/

27 Reattivo precipitante Mescola Centrifuga HDL LDL+ VLDL Decanta Misura Misura

28 HDL chilo VLDL LDL Detergenti Polimeri sintetici / ab HDL VLDL chilo LDL E Enzimi modificati E E HDL E E HDL E HDL E E

29 VARIABILITA ANALITICA: 2.COLESTEROLO HDL metodi omogenei certificazione CRMLN SI studi multicentrici di valutazione 2 / 5 interferenza da TG mmol/l mg/dl interferenza da LP anomale? (IDL, LPX) interferenza con campioni particolari? (cm)

30 VARIABILITA ANALITICA: 1. COLESTEROLO HDL Standardizzazione: utilizzare materiali certificati CRMLN

31 VARIABILITA ANALITICA: 3.COLESTEROLO LDL Metodo Definitivo? Standard Primario? Metodo di Riferimento col in LP > col HDL (candidato) (beta - quantificazione) Metodi Routinari calcolo (Friedewald) omogenei (diretti)

32 VARIABILITA ANALITICA: 3.COLESTEROLO LDL Formula di Friedewald C-LDL =C-totale - (C-HDL + TG / 5) Vantaggi fa risparmiare tempo e denaro utilizzata negli studi epidemiologici Svantaggi solo se TG < 4,5 mmol/l; 400 mg/dl dipende da precisione, accuratezza e variabilità biologica di C-tot, C-HDL e TG COL / TG in VLDL variabile è una stima

33 HDL chilo VLDL LDL Detergenti Surfattanti LDL VLDL chilo HDL E E LDL E E LDL LDL E E E

34 VARIABILITA ANALITICA: 3.COLESTEROLO LDL metodi omogenei certificazione CRMLN 4 / 5 studi multicentrici di valutazione 1 / 5 interferenza da TG molto variabile -11/L; 1000 mg/dl interferenza da LP anomale accertata per alcuni (remnants, LPX) interferenza con campioni particolari? (cm, FR)

35 VARIABILITA ANALITICA: 3. COLESTEROLO LDL Standardizzazione: formula di Friedewald: verificare l accuratezza di col tot, HDL e TG metodi omogenei: utilizzare materiali certificati CRMLN

36 FLOW-CHART PER LA GESTIONE DELLA RICHIESTA DI PROFILO LIPIDICO

37 VARIABILITA ANALITICA: 4.TRIGLICERIDI Metodo Definitivo ID-MS (candidato) Standard Primario tripalmitina, trioelina Metodo di Riferimento sec Carlson & Lofland estrazione + met. enzimatico (candidato) Metodi Routinari idrolisi enzimatica dei tg +determinazione glicerolo libero

38 Metodi routinari di dosaggio dei trigliceridi METODI CHIMICI METODI ENZIMATICI con idrolisi chimica completamente enzimatici

39 Metodi routinari di dosaggio dei trigliceridi Metodo Chimico (Van Handel e Zilversmit) Trattamento del campione con cloroformio, denaturazione lipoproteine, rilascio di trigliceridi Estratto purificato dei fosfolipidi Aliquota A idrolisi mediante potassa alcolica (glicerolo totale) Aliquota B non sottoposta a idrolisi (glicerolo libero) Aliquote A e B trattate con agenti ossidanti (glicerolo formaldeide) Formaldeide misurata a 570nm in presenza di acido solforico

40 Metodi routinari di dosaggio dei trigliceridi METODI ENZIMATICI con idrolisi chimica dei trigliceridi con alcali a caldo con idrolisi enzimatica dei trigliceridi con lipasi Trigliceridi glicerolo + ATP ADP + fosfoenolpiruvato Piruvato + NADH + H glicerolo + acidi grassi glicerolo-3.fosfato +ADP ATP + piruvato Lattato + NAD Il NADH consumato è in rapporto stechiometrico con il glicerolo Svantaggi Lipasi Reattivi poco stabili Glicerolo chinani piruvatochinasi latticodeidrogenasi

41 Metodi routinari di dosaggio dei trigliceridi METODI ENZIMATICI glicerolofosfatoossidasi glicerolo-3.fosfato + O2 diidrossiacetone fosfato + H 2 O 2 H 2 O clorofenolo-4-aminofenazone + HCl Reazione Trinder misurata 500nm perossidasi fenazone +2 H 2 O Svantaggi Bilirubina inibisce la formazione del cromoforo Vantaggi Buona precisione, reattivi stabili nel tempo

42 VARIABILITA ANALITICA: 4. TRIGLICERIDI Standardizzazione: utilizzare materiali certificati CRMLN rivolgersi al centro del network

43 VARIABILITA ANALITICA: 4. TRIGLICERIDI Standardizzazione: fisiologicamente la concentrazione del glicerolo è ~ 0.3 mmol/l; 3mg/dL cause pre-analitiche di apporto: tappi, materiali di calibrazione paziente: diabete, trattamento con eparina, edema cerebrale soggetto ospedalizzati: glicerolo bianco

44 VARIABILITA ANALITICA: 4. TRIGLICERIDI IL PROBLEMA DEL GLICEROLO LIBERO: bianco 1.TG glicerolo + ac. grassi + ATP... LPL 2.TG glicerolo + ac. grassi + ATP...

45 VARIABILITA ANALITICA: 4. TRIGLICERIDI IL PROBLEMA DEL GLICEROLO LIBERO: bianco 1.TG LPL glicerolo + ac. grassi + ATP.. 2.TG glicerolo + ac. grassi + ATP.. 1. Reagenti non facilmente disponibili 2.!!! Campioni limpidi con TG elevati presenza di glicerolo

46 VARIABILITA ANALITICA: APOLIPROTEINE Apoliproteine: indicazioni per la richiesta apo A-I nei soggetti con bassi livelli di colesterolo HDL

47 indicazioni per la richiesta APOLIPROTEINA B nei soggetti con storia personale e/o familiare di: - patologia cardiovascolare - iperlipidemia combinata familiare In presenza di livelli normali o poco aumentati di colesterolo e/o trigliceridi, può suggerire un aumento di particelle LDL

48 Fattori di rischio cardiovascolare emergenti: LDL piccole e dense ApoB

49 Insulino resistenza e sdldl Fat Cells á FFA Liver CE IR X Insulin á TG á Apo B á VLDL CE á VLDL (CETP) TG (CETP) TG LDL HDL SD LDL (hepatic lipase) Apo A-1 Kidney (lipoprotein or hepatic lipase)

50 LDL PICCOLE E DENSE Cambiamenti conformazionali nell Apo B Minore affinità per il recettore LDL Emivita allungata Maggiore suscettibilità alla ossidazione ApoB LDL LDL piccole e dense

51 elettroforesi capillare ELETTROFORESI CAPILLARE

52 LDL piccole e dense 1. Soggetti con storia o familiarità di patologia cardiovascolare in assenza dei classici fattori di rischio 2. Parenti di 1 grado dei soggetti del punto 1 3. Casistiche di pazienti a rischio 4. Dosaggio non eseguito di routine (laboratori specializzati)

53 Se aumenta il numero delle LDL piccole e dense: il dosaggio del colesterolo LDL sottostima il numero delle particelle. Larger LDL More cholesterol/particle Smaller LDL Less cholesterol/particle Apo B Similar LDL cholesterol Cholesteryl ester

54 VARIABILITA ANALITICA: 5. APO A-I e B Standardizzazione: Verificare che i calibratori dei kit commerciali abbiano il valore assegnato secondo il InternationalMasterCalibrator Apo A-I SP1 01 Apo A-I SP1 01 1,50 g/l 1,22 g/l

55 VARIABILITA ANALITICA: 5. APO A-I e B Metodo Definitivo? Standard Primario apo B: LDL ( ) apo A-I: A-I purificata Metodo di Riferimento ELISA a doppio anticorpo (candidato) InternationalMasterCalibrator Metodi Routinari nefelometria, turbidimetria

56 Lipoproteina (a) Lp(a) Costituita da una LDL in cui l ApoB è legata alla apolipoproteina(a) da un ponte disolfuro. Apo(a) sintetizzata dal fegato; probabile assemblaggio extracellulare. Varianti di Apo(a) caratterizzate da un numero differente di ripetizioni di domini Kringle Catabolismo poco chiaro: non ci sono recettori specifici per Lp(a) o Apo(a). Ipotesi di un ruolo del rene. Concentrazioni molto variabili mg/dl; europei di solito <10mg/dL Omologia con il plasminogeno

57 Lp(a)

58 Lipoproteina (a) Lp(a) Alti livelli di Lp(a) sono - associati ad aumento di rischio cardiovascolare - presenti in pazienti con ipercolesterolemia familiare ( LDL) - presenti in pazienti con patologie renali ( catabolismo) - presenti nei soggetti con minore numero di ripetizioni Kringle Bassi livelli di Lp(a) sono presenti in pazienti con: - abetalipoproteinaemia ( LDL) - patologie con perdita di funzionalità epatica ( sintesi) - presenti nei soggetti con maggiore numero di ripetizioni

59 VARIABILITA ANALITICA: 6. Lp (a) HOOC H 2 N apo (a) LDL S Problemi di misura struttura apo (a)+ apo B complessa plasminogeno polimorfismo ripetizioni di K4 nella popolazione

60 VARIABILITA ANALITICA: 6. Lp (a) HOOC H 2 N apo (a) LDL S Problemi di misura struttura apo (a)+ apo B complessa plasminogeno polimorfismo ripetizioni di K4 nella popolazione IFCC working group Soluzioni I ab contro apo(a) / II ab contro apo B standard in mmo / L

61 VARIABILITA ANALITICA: Lp (a) Lp (a) : indicazioni per la richiesta HOOC H 2 N apo (a) LDL S non è raccomandato lo screening di popolazione pazienti con storia personale e/o familiare di CHD o CVD senza fattori di rischio classici

62 FORMAZIONE DELLA PLACCA ATEROMASICA

63 Strategia per la valutazione del rischio lipidico Parametri: Colesterolo totale, HDL, LDL, Trigliceridi priorità INDICAZIONI PER LA RICHIESTA 1. Pazienti con patologia cardiovascolare (prevenzione secondaria) 2. Soggetti a rischio elevato per la coesistenza di più fattori di rischio (fumo, obesità, ipertensione, diabete) 3. Parenti di 1 grado dei soggetti del punto 1 e 2 4.Tutti i soggetti che vengono a contatto con le strutture sanitarie per altre cause

64 REFERTAZIONE INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI considerazione n. 1: nel mondo occidentale una larga parte della popolazione presenta valori di colesterolo associati a rischi elevati gli intervalli di riferimento non sono adeguati ad esprimere la relazione di un dato valore di colesterolo con il rischio

65 REFERTAZIONE INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI considerazione n. 1: nel mondo occidentale una larga parte della popolazione presenta valori di colesterolo associati a rischi elevati popolazione italiana n = colesterolo, mg/dl

66 Variabilità biologica espressa come CV% ed indice di individualità Per indici di individualità <0.6 utilizzo degli intervalli di riferimento di scarsa utilità

67 PROPOSTA DI REFERTAZIONE PER I LIPIDI PLASMATICI da parte del Gruppo di studio SIBioC-SISA Valore Desiderabile Colesterolo totale Colesterolo-HDL 190 mg/dl 40 mg/dl (M) 45 mg/dl (F) Colesterolo-LDL 115 mg/dl Trigliceridi 150 mg/dl Commento i valori desiderabili riportati si riferiscono a soggetti a rischio CV basso/moderato. Per i soggetti a rischio alto o molto alto, i valori desiderabili possono essere inferiori